方法論記事

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

DOI：

10.3791/61031

⸱

2020年5月9日

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明するキヌレニン経路で生成される4種類のトリプトファン代謝産物(キヌレニン、3−ヒドロキシキヌレニン、キサンチュレン酸、3−ヒドロキシアントラニル酸)を、液体クロマトグラフィーによって分析した培養液から採取した培地中の単一の四重極質量分析法を用いて説明する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

キヌレニン経路とキヌレニンと呼ばれるトリプトファンのカマボリテは、免疫調節と癌生物学への関与に対する注目度が高まっています。 インビトロ 細胞培養アッセイは、疾患メカニズムにおける異なるトリプトファンカマボリテの寄与について学び、治療戦略をテストするためにしばしば使用される。分泌代謝物およびシグナル伝達分子が豊富な細胞培養培地は、トリプトファン代謝および他の細胞事象の状況を反映する。複雑な細胞培養培地における複数のキヌレニンの信頼性の高い定量のための新しいプロトコルは、複数のサンプルの信頼性と迅速な分析を可能にするために望まれる。これは、質量分析と結合された液体クロマトグラフィーで達成することができる。この強力な技術は、代謝産物の定量のために多くの臨床および研究機関で使用され、キヌレニンの測定に使用することができます。

ここでは、4つのキヌレニン、すなわちキヌレニン、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシアントラニル、およびキサンスレン酸を 、インビトロ 培養癌細胞から採取した培地において、単四重極質量分析(LC-SQ)と結合した液体クロマトグラフィーの使用を示す。SQ検出器は、他の質量分析計に比べて使いやすく、安価です。SQ-MS分析では、サンプルから複数のイオンが生成され、特定の質量電荷比(m/z)に従って分離され、その後に単一イオン監視(SIM)モードを使用して検出されます。

本稿では、報告された方法の利点を取り上げ、いくつかの弱点を示す。これは、クロマトグラフィーおよび質量分析と共にサンプル調製を含むLC-SQ分析の重要な要素に焦点を当てています。品質管理、方法キャリブレーション条件、マトリックス効果の問題についても説明します。我々は、すべての標的検体のための1つのアナログ標準として3-ニトロチロシンの簡単な適用を記述した。ヒト卵巣および乳癌細胞の実験によって確認されるように、提案されたLC-SQ法は信頼できる結果を生成し、さらに他 のインビトロ 細胞モデルに適用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

キヌレニン経路(KP)は、ヒト細胞におけるトリプトファン(Trp)の変性の主要な経路である。インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO-1)は、KPの第1及び制限酵素であり、TrpをN-フォルミルカヌレニン1に変換する。KP内のさらなるステップは、他の二次代謝産物、すなわち種々の生物学的特性を示すキヌレニンを生成する。キヌレニン(Kyn)は、アリル炭化水素受容体(AhR)2に結合した後に、毒性特性および細胞イベントを調節する第1の安定したTrpカタボライトである。その後、Kynは自発的にまたは酵素媒介プロセス内のいくつかの分子に変換され、3-ヒドロキシキヌレニン(3HKyn)、アントラニル酸(AA)、3-ヒドロキシアントラニル酸(3-HAA)、キヌレン酸(Kyna)、キナンテレン酸(XA)などの代謝産物を生成する。別の下流代謝産物は、2-アミノ-3-カルボキシムコン酸-6-セミアルデヒド(ACMS)、キノリン酸(QA)またはピコリン酸(PA)1に非酵素的なサイクライゼーションを行う。最後に、QAは、さらにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)3、重要な酵素補因子であるKP終点代謝産物に変換される。キヌレニンには、キナやPAなどの神経保護特性があるものもあれば、3HAAや3HKynの他の人は有毒である4.3HKynから形成されるキサンスレン酸は抗酸化作用と血管弛緩性5を提示する。XAは、老化したレンズに蓄積し、上皮細胞のアポトーシスを導く6.KPは、20世紀半ばに記述され、様々な障害への関与が実証されたときに、より注目を集めました。この代謝経路の活性の増加およびいくつかのキヌレニンの蓄積は、免疫応答を調節し、うつ病、統合失調症、脳症、HIV、認知症、筋萎縮性側索硬化症、マラリア、アルツハイマー病、ハンチントン病、癌4、7などの異なる病理学的状態に関連している。Trp代謝のいくつかの変化は、腫瘍微小環境および癌細胞2,8で観察される。また、キヌレニンは有望な疾患マーカー9と考えられている。がん研究において、in vitro細胞培養モデルは、抗癌剤10に対する応答の前臨床評価のために十分に確立され、広く使用されている。Trp代謝産物は、細胞によって培養培地中に分泌され、キヌレニン経路の状態を評価するために測定することができる。そのため、容易で柔軟で信頼性の高いプロトコルを備えた様々な生物学的標本において、できるだけ多くのKP代謝産物を同時に検出するための適切な方法を開発する必要があります。

本論文では、がん細胞から採取した培養後の培地において、キヌレニン経路代謝産物であるKyn,3HKyn,3HAA,XAをLC-SQで同時に決定するためのプロトコルについて述べた。現代の分析的アプローチにおいて、液体クロマトグラフィー13、14、15、16は、個々のトリプトファン・カマボリトの同時検出および定量化に好ましく、エーリッヒ試薬11,12を利用した生化学的非特異的アッセイとは対照的である。現在のところ、ヒト検体におけるキヌレニンの測定には、主に紫外線または蛍光検出器13、17、18、19による液体クロマトグラフィーに基づく多くの方法がある。液体クロマトグラフィーと質量分析検出器(LC-MS)を組み合わせると、感度が高く(検出の下限)、選択性、再現性が高いため、このタイプの分析に適しているようです。

Trp代謝産物は、ヒト血清、血漿および尿13、20、21、22、23において既に決定されているが、細胞培養培地のような他の生物学的標本に対する方法も望まれている。以前、LC-MSは、ヒトグリオーマ細胞の培養後に採取した培地中のTrp由来化合物、単球、樹状細胞、またはインターフェロンガンマ(IFN-γ)24、25、26で処理されたアストロサイトに使用した。現在、がんモデルで使用される異なる培養培地、細胞、および治療における複数の代謝産物の評価を可能にする新しい検証済みプロトコルが必要です。

開発された方法の目的は、KPの異常を示すことができる4つの主要なキヌレニンを(1つの分析実行内で)定量することです。ここに提示される、 インビトロ 培養ヒト癌細胞27から採取した培地において、1つの内部標準(3-ニトロチロシン、3NT)を用いて選択された有意義なキヌレニンの定量的LC-SQ分析のための我々の最近発表されたプロトコルの重要なステップが示される。我々の知る限りでは、 インビトロ で増殖した細胞から得られた培養培地中で3HKyn、3HAA、KynおよびXAを同時に定量する初のLC-SQプロトコルです。いくつかの変更では、この方法は、より広い範囲の細胞培養モデルにおけるTrp代謝の変化を研究するためにさらに適用される可能性がある。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 標準3NT、キエン、3HKyn、3HAA、XA標準ストックソリューションの調製

  1. 最高精度(それぞれ0.3mg)のバイアル中の試薬の重量を量る。精度を高めるために、試薬をスケールアップし、ステップ1.2に従って溶媒の体積を調整します。
  2. 試薬を300 μLの溶媒に溶解し、1 g/Lのストック溶液を得る。キエン、3HAA、およびジメチルスルホキシド(DMSO)のXA;3HKynを塩酸(HCl)でpH2.5に酸性化した水で。
    注意:3HAAは目、鼻、喉、肺を刺激します。吸入、皮膚と接触し、飲み込むと有害です。手袋とマスクなど、適切な保護具を着用してください。
  3. 密にバイアルを閉じて、溶解を加速するために1分間超音波浴に入れて下ろします。
    注:ストックソリューションを-20°Cに保存し、在庫ソリューションの不安定性により、凍結/解凍(最大3サイクル)を最小限に抑えてください。

2. 炭処理培地の製造

  1. チューブ内で、活性炭の280mgを秤量し、目的の細胞を培養するために調製された液体培地の5mLを加える。
  2. シーソーロッカーの中型と木炭でチューブを室温(50振動/分に設定)で2時間振ります。次に、チューブを6000 x g で15分間遠心する。
  3. 遠心分離機からチューブを取り出し、慎重に堆積物を乱すことなく上清を収集します。必要に応じて遠心分離を繰り返し、すべての炭残渣を除去する。
  4. 0.45 μmのシリンジフィルターを使用して上清をフィルターします。
  5. 木炭前処理培養培地が、ステップ6.3.2で説明したようにLC-MSでパイロットサンプルを実行して、キヌレニンの痕跡を奪われていることを確認します。それ以外の場合は、手順 2.1 から 2.4 を繰り返します。
    注:完全な培養培地にキヌレニンが含まれていない場合、炭を用いた精製工程は省略される可能性があります。この場合、通常細胞培養用に調製される完全な培地を使用して、校正基準および品質管理サンプルを調製します。
  6. 調製した培地は、分析まで4°Cで保管してください。

3. キャリブレーションソリューションとキャリブレーションカーブの作成

  1. 0.75 μLの0.1 g/L 3NT溶液で炭前処理培養培地をスパイクし、キャリブレーション範囲をカバーするために少なくとも6つの異なる濃度(3HKyn、3HAA、Kyn、XA)の4つの標準を加えます。各サンプルの最終体積は150 μL.Vortexで十分に保ちます。サンプル調製には1.5 mL遠心管を使用してください。
    注:3HKynの推奨キャリブレーションポイント:0.018、0.045、0.22、1.12、2.23、4.46 μmol/ L;Kynの場合:0.0096、0.048、0.24、1.20、2.40、3.84 μmol/L;3HAAの場合:0.033、0.16、0.65、3.27、6.53、13.06 μmol/L;XAの場合:0.019、0.13、0.49、1.22、3.65、4.87 μmol/L。
  2. 1%(v/v)のギ酸を含む150μLの冷たいメタノール(-20°Cに保つ)を各チューブに加え、サンプル脱タンパク化を行います。チューブと渦をよくしっかりと閉じます。
  3. サンプルを-20°Cで40分間インキュベートします。
  4. サンプルを14,000xgで4°Cで15分間遠心分離します。 遠心分離機からチューブを取り外します。新しい管に上清を収集します。土砂を邪魔しないでください。
  5. 自動ピペットを使用して、上清の270 μLをガラスバイアルに移します。バイアルを蒸発器に入れ、乾燥するまで静かに蒸発させます。水/メタノール分率に適切なプログラムを使用して、揮発性成分を蒸発させます。40°C以上の温度を適用せず、過度の乾燥を避けてください。
    注:フラットボトムガラスバイアル、すなわち、クロマトグラフィーバイアルは、プラスチック円錐管と比較して、より速い蒸発と高い回復を促進します。
  6. 30分後、蒸発状態を確認します。必要に応じて、蒸発を続けます(例えば、10分余分に追加)。過度の乾燥は避けてください。
  7. 蒸発器からバイアルを取り出します。水中の0.1%(v/v)のギ酸の60 μLで各サンプルを再構成します。残留材料を含むバイアルに溶剤を加えます。バイアルと渦ウェルをしっかりと閉じます。
  8. サンプルを1.5 mLチューブに移し、14,000 x g で4°Cで15分間回転し、沈殿したタンパク質を分離します。
  9. タンパク質ペレットを乱すことなく、自動ピペットで円錐ガラスのインサートでクロマトグラフィーバイアルに上清を移します。バイアルをしっかりと閉じます。
  10. インサートバイアル内の気泡の存在を確認し、必要に応じて(例えば、渦によって)それらを取り除きます。
  11. LCオートサンプラーにサンプルを含むクロマトグラフィーバイアルを移します。オートサンプラートレイに配置されたサンプルの位置を記録します。

4. 品質管理(QC)サンプルの調製

  1. 0.75 μLの0.75 μLの0.75 μLの0.75 μLと4つのキヌレニン(3HKyn、3HAA、Kyn、XA)の基準を用いて、キャリブレーション曲線の直線範囲から選択した1濃度で炭前処理培養培地(1.5 ml遠心管で調製)をスパイクします。サンプルの最終容積は150 μLに保ちます。
    注:該当する場合は、キャリブレーション曲線の線形範囲に該当する異なる濃度で複数のQCサンプルを調製します。
  2. セクション3(ステップ3.2-3.11)で説明されているプロトコルに従ってください。

5. LC-MS システムの設定

  1. 移動相溶媒を準備する:溶媒A:20 mmol/Lアンモニウムの大体を超純水(pH 4.3はギ酸で調整)する。溶媒B:100%アセトニトリル。
    注意:ホウケイ酸ガラス瓶のみを使用してください。ボトルを再充填する前に超純水でリンスしてください。洗剤で洗浄したボトルは使用しないでください。
    注意:アセトニトリルは、重篤な健康影響または死を引き起こす。それは熱によって容易に点火される。アセトニトリル液と蒸気は、目、鼻、喉、肺を刺激する可能性があります。
    1. 結晶性試薬(15.77g)をガラス瓶に50mLの超純水に溶解して、アンモニウムの皮質溶液5モル/Lを調製します。すべての残差が溶解するまでかき混ぜます。0.45 μm膜を通してフィルターを通して残りの破片を取り除きます(例えば、ナイロンシリンジフィルターを使用して)。ストック液を4°Cに保存してください。
    2. オレンジ色のガラス瓶に980mLの超純水に5モル/Lアンモニウムギ酸4mLを水に加えて溶剤Aを調製し、よくかき混ぜます。攪拌バーを浸し、ボトルに溶媒を入れて磁気攪拌機に入れます。pH電極を溶液に浸し、攪拌下でpHを制御します。ギ酸ストック溶液を加える(98%-100%)pH 4.3を得るために0.2 mLの先端が付いた自動ピペットを使用してドロップワイズ、超純水で1 Lまでの音量を調整し、よくかき混ぜます。
      注:微生物の増殖を防ぐために、少なくとも週に1回は溶剤を準備してください。
      注意:酸(FA)は吸入すると有毒であり、皮膚の火傷および眼の損傷を引き起こす。ヒュームフードの下で作業します。保護手袋とコートを着用してください。
    3. 0.22 μm膜(ナイロンシリンジフィルターなど)を通してすべての溶液をフィルターして、残りの破片を除去します。オプションで、入ってくる粒子からシステムを保護するために、LC溶剤貯留器専用の溶媒入口フィルターを使用します。
  2. LC-MS制御およびデータ収集ソフトウェアを開始します。
  3. 気泡を除去し、すべての溶媒チャネルをプライミングするために移動相でLCシステムをパージします。
  4. 分析列を詰まらせないように保護するガード列をアンサンブルします。
  5. ガードおよび分析カラム(C18、2.1 x 100 mm、1.8 μm)を100%アセトニトリルで約30分間洗い流し、その後100%の溶媒Aでカラム内の安定した圧力が観察されるまで洗い流します。制御ソフトウェアを使用してシステムのパフォーマンスを制御します。
  6. データ収集ソフトウェアで適切な LC パラメータを設定します。
    1. 勾配プログラムを設定する: 0-8 分溶媒 B 0%;8-17分溶媒B 0-2%;17-20分溶媒B 2%;20-32分溶媒B 10-30%;32〜45分溶媒B 0%。
    2. 移動相流量を0.15 mL/minに、合計解析実行時間を45分、カラム温度を+40 °C、射出量を10 μLに設定します。
  7. 質量分析検出器の取得パラメータを設定します。
    1. イオン化パラメータを適用:単一イオンモニタリング(SIM)、正イオン化、ネブライザー圧50psi、+350°C乾燥ガス温度、12 L/minの乾燥ガス流、および5500Vキャピラリー電圧。
    2. 分析対象イオンを選択:3HKyn m/z 225.0(スキャン期間:2-6分、フラグメント電圧:100 V)の場合。Kyn m/z 209.0(スキャン期間:6-12分、フラグメント電圧:80 V)3HAA m/z 154.0(スキャン期間:12-18分、フラグメント電圧:80 V)3NT m/z 227.0(スキャン期間:18-23分、フラグメント電圧:100V)XA m/z 206.0(スキャン期間:23-45分、フラグメント電圧:100 V)
  8. LC システムでワークリストを構築し、サンプルを実行します。
  9. 最初、実験サンプルの分析の前に、少なくとも三量体でブランクサンプル(溶媒A)を実行し、続いて1つのQCサンプルを実行する。
  10. データ分析ソフトウェアを開き、QCサンプルで得られた結果をロードします。
  11. クロマトグラム上の検体ピークの位置を確認します。信号が予想位置を超えてシフトする場合は、適切な検体信号収集のためのタイムゲートを調整します。信号の統合に関する説明については、ソフトウェアマニュアルを参照してください。

6. キャリブレーションカーブの構築

  1. データ取得ソフトウェアでは、校正標準をワークリストに追加し、三元で標準を実行します。
  2. 保持時間が約4.4分、10分、16分、21分、30分の3HKyn、Kyn、3HAA、3NT、XAに対応するピーク面積をそれぞれ統合して測定します。
  3. スプレッドシートプログラムを使用して、各代謝物の個々のキャリブレーション曲線を構築します。
    1. キャリブレーションチャートを作成するには、3NTピークエリアと検体の濃度に対する検体ピーク面積の比の値をプロットします。
    2. ブランクサンプル(3NTのみでスパイクした木炭前処理培養培地)を分析し、培地中に分析対象の分析対象物の痕跡がないことを確認します。それ以外の場合は、各キャリブレーションポイントから取得した値を引きます。
    3. 各キャリブレーションカーブの直線性を確認します。
      1. 個々に、各検体について、傾きインターセプト線形方程式(y = ax +b)を作成し、yは3NTピーク面積に対する検体ピーク面積の比に対応し、aは傾き、xは検体濃度(μmol/L)、bは曲線の切片を指します。グラフ 'y' と 'x' をプロットすると、キャリブレーション曲線が生成されます。
      2. グラフに線形近似曲線を追加し、グラフにキャリブレーション曲線方程式と回帰係数を表示します。回帰係数が 0.990 を指定していることを確認します。キャリブレーション基準が一致しない場合は、これらをもう一度準備または分析してください。必要に応じて、キャリブレーションカーブの濃度範囲を変更します。
    4. 実験サンプルを分析する前に、QCサンプルを分析してシステムのパフォーマンスを確認します。非互換性(基準値からの20%の偏差±)の場合は、新しいキャリブレーション曲線を準備します。

7. インビトロ細胞培養と分析用サンプル採取

  1. ᴅグルコースの4.5 g/Lを含むDMEM(ダルベッコの修飾ワシ培地)で研究された癌細胞(MDA-MB-231またはSK-OV-3)をプレートし、 10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、2 mmol/L ʟグルタミン、1 Uペニシリン/ストレプトマイシン1と培養37°Cで5%CO2の加湿雰囲気で培養し、実験のためにそれらを拡大する。合流度の80%で細胞を通過させる。
  2. トリプシンを使用して培養皿から細胞を取り外し、1ウェルあたり0.3×106細胞の密度で12ウェルプレート上の実験のための種子を種分し、一晩インキュベーターに入れる。
  3. 翌日、培養培地を吸引し、実験計画に応じて、研究した化合物の添加の有無にかかわらず新鮮なDMEMを添加する。
  4. 48時間後、細胞の上から培地(約500μL)を1.5mLチューブに回収します。遠心分離機は14,000 x g で5分間、細胞の破片を除去する。上清を収集し、分析まで-80°Cで保存します。
  5. タンパク質推定のためにステップ7.4から細胞ペレットを保存します。サンプルを-20 °Cで凍結します。
    注:異なるウェルから培地のために得られた結果は、個々のウェルの細胞数の変動性を考慮して、総タンパク質含有量に正規化する必要があります。タンパク質濃度は、ステップ9に記載されるように評価することができる。

8. LC-MS 分析用のサンプルの準備

  1. 凍結したサンプルを室温で解凍し、よく混ぜます。培養培地149.25μLを遠心チューブ(1.5mL)に移します。
  2. 0.75 μLの3NT溶液(内部標準)を0.1 g/L加えます。チューブと渦をよく閉じます。
  3. サンプル脱タンパク化のために1%(v/v)FAを含む-20 °Cメタノールで150 μLの冷やして下さいます。チューブと渦をよく閉じます。
  4. セクション 3 (ステップ 3.3-3.11) で説明されているサンプル準備を続行します。
    注:SK-OV-3のようないくつかの癌細胞は、培養培地に大量のキンを分泌します。データをキャリブレーションカーブの直線範囲に収めるためには、サンプルの約100倍希釈が必要です。この場合、試料の一部を0.1%(v/v)FAで水中で希釈し、希釈されていないサンプルに加えて分析します。較正曲線の標準の基準サンプルは、完全培養培地の100倍希釈して調製する必要があります。あるいは、キャリブレーション曲線にポイントを追加し(適切な溶解性と直線性が達成された場合)、実験試料中のKynの濃度レベルに調整する。
  5. セクション 5 で説明されているように、LC-MS でサンプルを分析します。ワークリストを作成し、各サンプルを三重で実行します。
  6. ワークリストが完成したら、検地のピーク領域を測定します。
  7. 利用可能なソフトウェアを使用してスプレッドシートを生成し、数値データを取得します。
  8. 1 つのスプレッドシート列で、3NT ピーク領域の検数積ピーク領域の比率を計算します。
  9. 実験サンプルに存在する検体の濃度を計算するには、各分析対象に専用の線形キャリブレーション式(ステップ6.3から)を使用します。

9. タンパク質の含有量とデータの正規化の評価

  1. 1.5 mLチューブでリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の100 μLでステップ7.5から細胞ペレットを再懸濁します。
    注:8gの塩化ナトリウム、0.2gの塩化カリウム、1.44gのリン酸二塩基ナトリウム、950mLの超純水中のリン酸二水素カリウムを溶解してPBS溶液を調製してください。よくかき混ぜる。塩酸(滴下)でpHを7.4に調整します。超純水で最大1Lの音量を調節します。均質になるまでよくかき混ぜます。
    注意: 塩酸は腐食性が高く、適切な安全対策を講じる必要があります。ヒトの皮膚との接触は、発赤、痛み、皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。ヒュームフードの下で作業します。保護手袋とコートを着用してください。
  2. サンプルを-20°Cで凍結し、氷の上で解凍します。この手順を 3x 繰り返します。
  3. サンプルを14,000xgで4°Cで15分間遠心分離する。 新しい管に上清を収集します。ペレットを邪魔しないでください。
  4. 上清をPBSで10倍希釈します。
  5. ウェル範囲あたりのタンパク質の0〜2μgの較正曲線を構築します。
    1. 校正用にウシ血清アルブミン(BSA)標準溶液を準備します。BSAの1.23 μgを1mLの超純水と渦によく溶かします。
    2. 96ウェルプレートでは、異なる量のBSA標準溶液(1.23 μg/mL):0 μL、2 μL、4 μL、5 μL、7 μL、10 μL、15 μL、20 μLをロードします。
    3. 50 μLの最終容積にPBSで井戸を充填します。
  6. 同じ96ウェルプレートにステップ9.4から10〜15μLの細胞ライセートをロードします。井戸にPBSを充填し、50 μLの最終容積に到達します。
    注:必要に応じて、各ウェルのセルライセートアリコートの体積を調整して、キャリブレーションカーブの直線範囲に収まります。最終ボリュームを、ウェル当たり50 μLのサンプルに保ちます。
  7. ブラッドフォード試薬200μL(超純水で5回希釈)を各ウェルに加えます。
  8. 室温で少なくとも5分間96ウェルのパテをインキュベートします。プレートをマイクロプレートリーダーに挿入します。λ= 595 nmで吸光度を測定します。
  9. スプレッドシートプログラムを使用して、キャリブレーション曲線を構築します。BSA量(μg)対吸光度をプロットします。線形近似曲線を追加し、グラフにキャリブレーション曲線方程式と回帰係数を表示します。
  10. 線形方程式(y = ax +b、yはλ=595nmの吸光度に相当し、aは傾き、xはタンパク質含有量(μg)、bは曲線の切片を指す)を使用してサンプル中のタンパク質量を計算する。
    注: 計算のサンプル希釈係数を検討してください。
  11. タンパク質の1mg当たりのサンプル中のキヌレニン量を正常化するために推定タンパク質含有量を使用してください。これを行うには、ステップ8.9で決定したキヌレニンの濃度をステップ9.10の総タンパク質含有量で割る。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MSは、複雑な標本の一部の成分がいわゆるマトリックス効果を引き起こし、分析物のイオン化を損なうにもかかわらず、生物学的に活性な分子の定量化において紛れもない利点を提示する。それはイオン抑制またはイオン増強をもたらし、精度を強く低下させ、LC-MSの検出/定量の限界に影響を及ぼし、これは方法の「弱い」点と考えられる。我々のプロトコルでは、イオンは正のモードでエレクトロスプレーイオン化(ESI)によって生成され、これはTrp代謝物決定13に関する他の研究にも用いられた。しかし、ESIは、大気圧化学イオン化(APCI)28よりもマトリックス効果を起こしやすい。したがって、細胞培養培地中のTrp代謝物を正確に定量するために、内部標準およびマトリックスマッチキャリブレーションを使用して、検体シグナルに対するマトリックス依存効果を補償し、サンプル調製工程中の標的化合物の損失を補正した。全ての調査対象(3HKyn、Kyn、3HAA、XA)に同じ内部標準(3NT)を適用しました。3NTは、細胞培養に使用される元の新鮮な培地には見つからず、適用された分析...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本論文では、 インビトロ 培養ヒト癌細胞から培地で測定される4つの主要Trp代謝物(3HKyn、Kyn、3HAA、XA)の同時定量化のための詳細なLC-SQプロトコルを提示する。分析の中で最も重要な点であるサンプル調製、クロマトグラフィー/質量分析法、データ解釈に特に注意が払われます。

一般に、LC-MS分析は、高感度のため、使用材料のプロトコルの厳密さと純度の最高水準を必要とします。これは、きれいに洗浄され、適切に洗浄されたガラス製品だけでなく、標準的な手順を通じて高級化学物質のアプリケーションを指します。この敏感なアプローチでは分析に大きな影響を与える可能性がある微生物汚染を避けるために、移動相の淡水ベースの溶媒を使用することは非常に重要です。LCシステムに注入する前に、分析されたサンプルは、不溶性粒子の存在を注意深く調べる必要があります。サンプル分析の前に列を十分に平衡にする必要があることに注意することが重要です。これらの規則に従わないと、サンプル、LCシステム、分析カラムの汚染やMSソースでのサンプルイオン化不足が発生し、最終的に信号のシフトが発生する可能...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、東ポーランド2007-2013(POPW.01.03.00-06-003/09-00)、ルブリンのジョン・ポール2世カトリック大学(イロナ・サドクのための若い科学者助成金)のバイオテクノロジーと環境科学の学部によって、東ポーランドの運用プログラム開発の下で欧州地域開発基金から欧州連合によって支援されました OPUS13(2017/25/B/NZ4/01198マグダレーナ・スタニシェフスカ、原則調査官)。 著者らは、細胞培養およびタンパク質定量のための装置を共有してくれたJPII CULの学際研究センター、酸化ストレス研究所のアニエスカ・シシビオール教授に感謝する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-ヒドロキシアントラニル酸Sigma-Aldrich14877697%
3-ニトロ-L-チロシンSigma-AldrichN7389
アセトニトリルSupelco1.00029LC-MS LiChrosolv
活性炭Supelco05105粉末
分析天びんOhaus
分析カラムAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 急速分解能 HT (2.1 x 100 mm, 1.8 & micro;m)
ギ酸アンモニウムSupelco7022溶離液添加剤、LC-MS、LiChropur、≥99.0%
ウシ血清アルブミンシグクロマトグラフィー
キャップAgilent Technologies5185-5820ブルースクリューキャップ、PTFE/レッドシルセパ
細胞培養皿ネスト704004ポリスチレン、非発熱性、滅菌
細胞培養プレートBiologix07-601212ウェル、非発熱性、非細胞毒性、滅菌
セルインキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィックHERAcell 150i Cu
遠心分離エッペンドルフモデル5415R
遠心分離機エッペンドルフモデル5428
遠心チューブBionovoB-2278エッペンドルフタイプ、1.5 mL
遠心チューブBionovoB-3693ファルコンタイプ、50 mL、PP
クロマトグラフィーデータ買収および分析ソフトウェアAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
クロマトグラフィーインサートバイアルAgilent Technologies9301-1387100 µL
クロマトグラフィー バイアルAgilent Technologies5182-07142 mL、透明ガラス
ジメチルスルホキシドSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)PAN BiotechP04-41450
デュアルメーター pH/導電率メトラー・トレドセブンマルチ
エバポレーターGenevacモデル EZ-2.3 エリート
ウシ胎児血清Sigma-AldrichF9665
ギ酸Supelco5.33002LC-MS LiChropur
試薬保管用ガラス瓶BionovoS-207050 mL、透明ガラス
ガードカラムAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 ナローボアガードカラム (2.1 x 12.5 mm、5 & micro;m)
塩酸メルク1.00317.1000
L-キヌレニンSigma-AldrichK8625≥98% (HPLC)
マグネチックスターラーWigoES 21 H
マイクロバランスメトラー・トレドモデル XP6
Milli-Q システムMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV ポンプ付き
四重極質量分析計Agilent TechnologiesG1948Bモデル 6120
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma-Adrich048M4874V
プレートリーダーBio TekSynergy 2 Gen5 によって操作
塩化カリウムメルク1.04936.1000
リン酸二水素カリウムメルク1.05108.0500
タンパク質アッセイ 染料試薬濃縮BioRad500-0006
シーソーロッカースチュアートSSL4
血清ピペットNest3260015 mL、ポリスチレン、非発熱性、滅菌塩化
ナトリウムSigma-Aldrich7647-14-5
リン酸二塩基性Merck1.06346.1000
溶剤入口フィルターAgilent Technologies5041-2168ガラスフィルター、20 μm孔径
溶媒リザーバー(LC-MS用)Agilent Technologies9301-65241 L、透明ガラス
溶媒リザーバー(LC-MS用)Agilent Technologies9301-65261 L、琥珀色ガラス
スプレッドシートプログラムMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
攪拌棒Bionovo6-2003テフロンコーティング
シリンジフィルター 培養用中型ろ過Bionovo7-8803セルロース、およびOslash; 30 mm、0,45 & micro;m
移動相コンポーネントろ過用シリンジフィルターBionovo6-0018ナイロン、 Ø 30 mm、0,22 µm
組織培養プレートVWR10062-90096ウェル、滅菌
済み トリプシン-EDTA溶液Sigma-AldrihT4049-100 mL
超高速液体クロマトグラフィーシステムAgilent TechnologiesG1367D、G1379B、G1312B、G1316C1200 Infinityシステムは、オートサンプラー(G1367D)、デガッサー(G1379B)、バイナリポンプ(G1312B)、カラムサーモスタット(G1316C)で構成されています
超音波浴Polsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
Xanthuren acidSigma-AldrichD12080496%
マ バイアル用1001887398機 ナトリウム 再生

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事