癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

Summary

ここで説明するキヌレニン経路で生成される4種類のトリプトファン代謝産物(キヌレニン、3−ヒドロキシキヌレニン、キサンチュレン酸、3−ヒドロキシアントラニル酸)を、液体クロマトグラフィーによって分析した培養液から採取した培地中の単一の四重極質量分析法を用いて説明する。

Abstract

キヌレニン経路とキヌレニンと呼ばれるトリプトファンのカマボリテは、免疫調節と癌生物学への関与に対する注目度が高まっています。 インビトロ 細胞培養アッセイは、疾患メカニズムにおける異なるトリプトファンカマボリテの寄与について学び、治療戦略をテストするためにしばしば使用される。分泌代謝物およびシグナル伝達分子が豊富な細胞培養培地は、トリプトファン代謝および他の細胞事象の状況を反映する。複雑な細胞培養培地における複数のキヌレニンの信頼性の高い定量のための新しいプロトコルは、複数のサンプルの信頼性と迅速な分析を可能にするために望まれる。これは、質量分析と結合された液体クロマトグラフィーで達成することができる。この強力な技術は、代謝産物の定量のために多くの臨床および研究機関で使用され、キヌレニンの測定に使用することができます。

ここでは、4つのキヌレニン、すなわちキヌレニン、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシアントラニル、およびキサンスレン酸を 、インビトロ 培養癌細胞から採取した培地において、単四重極質量分析(LC-SQ)と結合した液体クロマトグラフィーの使用を示す。SQ検出器は、他の質量分析計に比べて使いやすく、安価です。SQ-MS分析では、サンプルから複数のイオンが生成され、特定の質量電荷比(m/z)に従って分離され、その後に単一イオン監視(SIM)モードを使用して検出されます。

本稿では、報告された方法の利点を取り上げ、いくつかの弱点を示す。これは、クロマトグラフィーおよび質量分析と共にサンプル調製を含むLC-SQ分析の重要な要素に焦点を当てています。品質管理、方法キャリブレーション条件、マトリックス効果の問題についても説明します。我々は、すべての標的検体のための1つのアナログ標準として3-ニトロチロシンの簡単な適用を記述した。ヒト卵巣および乳癌細胞の実験によって確認されるように、提案されたLC-SQ法は信頼できる結果を生成し、さらに他 のインビトロ 細胞モデルに適用することができる。

Introduction

キヌレニン経路(KP)は、ヒト細胞におけるトリプトファン(Trp)の変性の主要な経路である。インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO-1)は、KPの第1及び制限酵素であり、TrpをN-フォルミルカヌレニン¹に変換する。KP内のさらなるステップは、他の二次代謝産物、すなわち種々の生物学的特性を示すキヌレニンを生成する。キヌレニン(Kyn)は、アリル炭化水素受容体(AhR)2に結合した後に、毒性特性および細胞イベントを調節する第1の安定したTrpカタボライトである。その後、Kynは自発的にまたは酵素媒介プロセス内のいくつかの分子に変換され、3-ヒドロキシキヌレニン(3HKyn)、アントラニル酸(AA)、3-ヒドロキシアントラニル酸(3-HAA)、キヌレン酸(Kyna)、キナンテレン酸(XA)などの代謝産物を生成する。別の下流代謝産物は、2-アミノ-3-カルボキシムコン酸-6-セミアルデヒド(ACMS)、キノリン酸(QA)またはピコリン酸(PA)1に非酵素的なサイクライゼーションを行う。最後に、QAは、さらにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド^(NAD+)3、重要な酵素補因子であるKP終点代謝産物に変換される。キヌレニンには、キナやPAなどの神経保護特性があるものもあれば、3HAAや3HKynの他の人は有毒である

Protocol

1. 標準3NT、キエン、3HKyn、3HAA、XA標準ストックソリューションの調製

1. 最高精度(それぞれ0.3mg)のバイアル中の試薬の重量を量る。精度を高めるために、試薬をスケールアップし、ステップ1.2に従って溶媒の体積を調整します。
2. 試薬を300 μLの溶媒に溶解し、1 g/Lのストック溶液を得る。キエン、3HAA、およびジメチルスルホキシド(DMSO)のXA;3HKynを塩酸(HCl)でpH2.5に酸性化した水で。
   注意:3HAAは目、鼻、喉、肺を刺激します。吸入、皮膚と接触し、飲み込むと有害です。手袋とマスクなど、適切な保護具を着用してください。
3. 密にバイアルを閉じて、溶解を加速するために1分間超音波浴に入れて下ろします。
   注:ストックソリューションを-20°Cに保存し、在庫ソリューションの不安定性により、凍結/解凍(最大3サイクル)を最小限に抑えてください。

2. 炭処理培地の製造

1. チューブ内で、活性炭の280mgを秤量し、目的の細胞を培養するために調製された液体培地の5mLを加える。
2. シーソーロッカーの中型と木炭でチューブを室温(50振動/分に設定)で2時間振ります。次に、チューブを6000 x g で15分間遠心する。
3. 遠心分離機からチューブを取り出し、慎重に堆積物を乱すことなく上清を収集します。必要....

Results

LC-MSは、複雑な標本の一部の成分がいわゆるマトリックス効果を引き起こし、分析物のイオン化を損なうにもかかわらず、生物学的に活性な分子の定量化において紛れもない利点を提示する。それはイオン抑制またはイオン増強をもたらし、精度を強く低下させ、LC-MSの検出/定量の限界に影響を及ぼし、これは方法の「弱い」点と考えられる。我々のプロトコルでは、イオンは正のモードでエレクトロスプレーイオン化(ESI)によって生成され、これはTrp代謝物決定¹³に関する他の研究にも用いられた。しかし、ESIは、大気圧化学イオン化(APCI)28よりもマトリックス効果を起こしやすい。したがって、細胞培養培地中のTrp代謝物を正確に定量するために、内部標準およびマトリックスマッチキャリブレーションを使用して、検体シグナルに対するマトリックス依存効果を補償し、サンプル調製工程中の標的化合物の損失を補正した。全ての調査対象(3HKyn、Kyn、3HAA、XA)に同じ内部標準(3NT)を適用しました。3NTは、細胞培養に使用される元の新鮮な培地には見つからず、適用された分析.......

Discussion

本論文では、 インビトロ 培養ヒト癌細胞から培地で測定される4つの主要Trp代謝物(3HKyn、Kyn、3HAA、XA)の同時定量化のための詳細なLC-SQプロトコルを提示する。分析の中で最も重要な点であるサンプル調製、クロマトグラフィー/質量分析法、データ解釈に特に注意が払われます。

一般に、LC-MS分析は、高感度のため、使用材料のプロトコルの厳密さと純度の最高水準を必要とします。これは、きれいに洗浄され、適切に洗浄されたガラス製品だけでなく、標準的な手順を通じて高級化学物質のアプリケーションを指します。この敏感なアプローチでは分析に大きな影響を与える可能性がある微生物汚染を避けるために、移動相の淡水ベースの溶媒を使用することは非常に重要です。LCシステムに注入する前に、分析されたサンプルは、不溶性粒子の存在を注意深く調べる必要があります。サンプル分析の前に列を十分に平衡にする必要があることに注意することが重要です。これらの規則に従わないと、サンプル、LCシステム、分析カラムの汚染やMSソースでのサンプルイオン化不足が発生し、最終的に信号のシフトが発生する可能.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
3-ヒドロキシアントラニル酸	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-ニトロ-L-チロシン	Sigma-Aldrich	N7389
アセトニトリル	Supelco	1.00029	LC-MS LiChrosolv
活性炭	Supelco	05105	粉末
分析天びん	Ohaus
分析カラム	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 急速分解能 HT (2.1 x 100 mm, 1.8 & micro;m)
ギ酸アンモニウム	Supelco	7022	溶離液添加剤、LC-MS、LiChropur、≥99.0%
ウシ血清アルブミン	シグ	クロマトグラフィー
キャップ	Agilent Technologies	5185-5820	ブルースクリューキャップ、PTFE/レッドシルセパ
細胞培養皿	ネスト	704004	ポリスチレン、非発熱性、滅菌
細胞培養プレート	Biologix	07-6012	12ウェル、非発熱性、非細胞毒性、滅菌
セルインキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック		HERAcell 150i Cu
遠心分離	エッペンドルフ		モデル5415R
遠心分離機	エッペンドルフ		モデル5428
遠心チューブ	Bionovo	B-2278	エッペンドルフタイプ、1.5 mL
遠心チューブ	Bionovo	B-3693	ファルコンタイプ、50 mL、PP
クロマトグラフィーデータ買収および分析ソフトウェア	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
クロマトグラフィーインサートバイアル	Agilent Technologies	9301-1387	100 µL
クロマトグラフィー バイアル	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL、透明ガラス
ジメチルスルホキシド	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
デュアルメーター pH/導電率	メトラー・トレド		セブンマルチ
エバポレーター	Genevac		モデル EZ-2.3 エリート
ウシ胎児血清	Sigma-Aldrich	F9665
ギ酸	Supelco	5.33002	LC-MS LiChropur
試薬保管	用ガラス瓶Bionovo	S-2070	50 mL、透明ガラス
ガードカラム	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 ナローボアガードカラム (2.1 x 12.5 mm、5 & micro;m)
塩酸	メルク	1.00317.1000
L-キヌレニン	Sigma-Aldrich	K8625	≥98% (HPLC)
マグネチックスターラー	Wigo		ES 21 H
マイクロバランス	メトラー・トレド		モデル XP6
Milli-Q システム	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV ポンプ付き
四重極質量分析計	Agilent Technologies	G1948B	モデル 6120
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma-Adrich	048M4874V
プレートリーダー	Bio Tek		Synergy 2 Gen5 によって操作
塩化カリウム	メルク	1.04936.1000
リン酸二水素カリウム	メルク	1.05108.0500
タンパク質アッセイ 染料試薬濃縮	BioRad	500-0006
シーソーロッカー	スチュアート	SSL4
血清ピペット	Nest	326001	5 mL、ポリスチレン、非発熱性、滅菌塩化
ナトリウム	Sigma-Aldrich	7647-14-5
リン酸二塩基性	Merck	1.06346.1000
溶剤入口フィルター	Agilent Technologies	5041-2168	ガラスフィルター、20 μm孔径
溶媒リザーバー(LC-MS用)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L、透明ガラス
溶媒リザーバー(LC-MS用)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L、琥珀色ガラス
スプレッドシートプログラム	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
攪拌棒	Bionovo	6-2003	テフロンコーティング
シリンジフィルター 培養用中型ろ過	Bionovo	7-8803	セルロース、およびOslash; 30 mm、0,45 & micro;m
移動相コンポーネントろ過用シリンジフィルター	Bionovo	6-0018	ナイロン、 Ø 30 mm、0,22 µm
組織培養プレート	VWR	10062-900	96ウェル、滅菌
済み トリプシン-EDTA溶液	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
超高速液体クロマトグラフィーシステム	Agilent Technologies	G1367D、G1379B、G1312B、G1316C	1200 Infinityシステムは、オートサンプラー(G1367D)、デガッサー(G1379B)、バイナリポンプ(G1312B)、カラムサーモスタット(G1316C)で構成されています
超音波浴	Polsonic	104533	model 6D
Vortex	Biosan		model V-1 plus
Xanthuren acid	Sigma-Aldrich	D120804	96%