植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

サマリー

このプロトコルは、アラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在化のための植物材料が固定され、親水性アクリル樹脂に埋め込まれ、切り離され、ガラススライドに取り付けられる方法を詳細に記述する。我々は、細胞壁関連エピトープが特定の抗体で検出されることを示す。

要約

植物の開発には、内部および外部刺激の両方に応答して、細胞壁の組成と構造の一定の調整が含まれます。細胞壁は、タンパク質、フェノール化合物および水と共にセルロースおよび非セルロース性多糖類で構成されています。細胞壁の90%は、多糖類(例えば、ペクチン)およびアラビノガラクタンタンパク質(AMP)で構成されています。植物組織学的セクションにおける特定のグリカンエピトープの蛍光免疫局在化は、壁多糖ネットワーク、構造および構成要素のリモデリングを明らかにする重要なツールであり続けています。

ここでは、植物組織中のAMPおよびペクチンからグリカンエピトープを検出するための最適化された蛍光免疫局在化手順を報告する。パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド固定は、植物サンプルのLR-White埋め込みと一緒に使用され、組織構造および組成のより良い保存を可能にする。超ミクロトームで得られた埋め込みサンプルの薄い部分は、特定の抗体による免疫局在化に使用された。この手法は、大きな解像度、高い特異性、および同じサンプル内の複数のグリカンエピトープを検出する機会を提供します。この技術は、グリカンの細胞内局在化を可能にし、細胞壁に蓄積のレベルを検出します。また、発達過程におけるAGPおよびペクチン分布の時空間的パターンの決定も可能となる。このツールの使用は、最終的に研究の方向を導き、植物の特定の機能にグリカンをリンクすることができます。さらに、得られた情報は、生化学的および遺伝子発現研究を補完することができる。

概要

植物細胞壁は、多糖類と糖タンパク質から構成される複雑な構造です。細胞壁は、そのアーキテクチャ、組織および構成が細胞の種類、局在化、発達段階、外部および内部刺激によって異なる非常に動的な構造^{である 1}.アラビノガラクタンタンパク質(AMP)およびペクチンは、植物細胞壁の重要な構成要素である。AGPは、高グリコシル化タンパク質およびペクチンは、その組成、量および構造が異なる植物の発生段階^2、3、4の間に大きく変化するホモガラクチュロン多糖である。ASPおよびペクチン研究は、プログラムされた細胞死、無生物性ストレスへの応答、性植物の生殖、他の多くの間でのいくつかの植物プロセスへの関与を明らかにした^5。これらの研究のほとんどは、免疫局在性研究から得られた情報から始まりました。

その複雑さを考えると、細胞壁の研究には多くの異なるツールが必要です。モノクローナル抗体(mAbs)を用いたグリカンエピトープの検出は、この構造に沿った多糖類および糖タンパク質分布を解決するための貴重なアプローチです。グリカンエピトープを検出するために利用可能なmAbsの大規模なコレクションがあり、各mAbの特異性^は6と同様に継続的に改善されている。ここで説明する技術はすべての植物種に適用可能であり、より高価で複雑な技術を伴うかもしれない将来の研究の方向性を導くのに最適なツールです。

この技術では、特定の抗体は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)、TRITC(テトラメチルローダミン-5-(および6)-イソチオシアネート)またはいくつかのアレクサフルオール染料などの蛍光色素に化学的に結合されます。免疫蛍光は、蛍光顕微鏡下で直接観察することができるグリカンの明確かつ迅速な細胞内局在化を可能にするいくつかの利点を提供する。それは、高い特異的かつ感受性であり、試料の調製は、より少量で存在する場合であっても、抗原の自然な構造を効果的に保護することができるので。それは同じサンプルの複数の抗原の検出を可能にし、最も重要な、高品質および視覚的に美しい結果を提供する。蛍光免疫局在化研究によって提供される大きな力にもかかわらず、彼らはしばしば、手順の異なるステップの視覚化を可能にする詳細なプロトコルの欠如のために、実行し、実装することが困難であると考えられている。ここでは、この手法を実行する方法と高品質の画像を取得する方法について、いくつかの簡単なガイドラインを提供します。

ここで示すプロトコルの場合、サンプルはまず修正され、最も適切な固定を使用して埋め込む必要があります。時間がかかり、比較的面倒な技術と考えられていますが、植物試料の適切な固定と埋め込みは、免疫局在アッセイを成功させるための鍵です。この目的のために、最も通常はアルデヒドのような架橋固定剤を用いた化学固定である。架橋固定剤は、組織の分子間の化学的結合を確立し、サンプルを安定化し硬化させる。ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、架橋性固定剤であり、そして時々両方の固定剤の混合が⁷を使用する。ホルムアルデヒドは、組織の構造保存を大きくし、長期間にわたって、小さな組織の引き込みと免疫染色との互換性を提供します。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドと組み合わせて通常使用される、より強力で安定した固定剤です。グルタルアルデヒドの使用は、いくつかの自由なアルデヒド基を固定組織に導入し、非特異的標識を生成する可能性があるため、考慮しなければならないいくつかの欠点を有する。また、タンパク質と他の分子との架橋は、時折、抗体に対してアクセスできない標的エピトープをレンダリングする可能性があります。これを回避するには、固定の数量と期間を慎重に定義する必要があります。

固定後、サンプルは、セクションを得る前に硬化するために適切な樹脂に埋め込まれます。ロンドン樹脂(LR-白)アクリル樹脂は、免疫局在性試験に適した樹脂です。他の樹脂とは異なり、LR-Whiteは親水性であり、抗体が抗原に到達することを可能にし、それを容易にする治療を必要としない。LR-Whiteは低い自己蛍光を提供する利点もあり、免疫蛍光イメージング中のバックグラウンドノイズの低減を可能にする。

アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、周期酸-シッフ(PAS)染色など、細胞壁の異なる成分を検出するために利用可能な多くの染色技術があります。これらのどれも免疫局在性分析の力を提供していません⁸.このアプローチは、グリカンの検出に大きな特異性を与え、細胞壁の構成と構造に関するより広大な情報を提供します。

プロトコル

1. サンプル調製:固定、脱水、LR-白埋め込み

1. 固定と脱水
   注: 固定プロセスは、サンプルを保存するために重要です。分子を架橋することで細胞代謝が停止し、細胞の完全性を確保し、分子拡散を防止する。固定剤および使用する濃度は、抗体と相互作用するために十分に露出した抗原を残して、その目的に合わせて調整されなければならない。以下のプロトコルは、グルタルアルデヒドのより強い効果と、パラホルムアルデヒドの軽度の固定能力を兼ね備えています。その比率はAMPおよび細胞壁成分に最適化されたが、他のタンパク質および細胞構造に適している。その後の脱水処理により、LR-White埋め込み用サンプルが準備されます。この実験では、いくつかの植物種の植物組織が使用された。 ケルカスバーサンプル は、フィールドで栽培された木から収集しました。 トリスリアの水中植物の サンプルは、ポーラ・ルトール(キューガーデンズ、ロンドン、英国)によって親切に私たちと共有されました。
   1. すべてのシロイヌナズナズ植物を直接土壌にまき、60%の相対湿度と18°Cで21°Cで16時間光の昼/夜のサイクルを持つ屋内成長施設で成長します。 分析する植物組織を選択し、サンプルを16mm2以下のサイズにトリミングします。
   2. 十分な冷たい固定液溶液(2%ホルムアルデヒド(w/v)、2.5%グルタルアルデヒド(w/v)、25 mM PIPES pH 7および0.001%Tween-20(v/v))で満たされたガラスバイアルにサンプルを直ちに移して、サンプルを完全に水没させます(図1A)。
      注意: ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、吸入および接触によって有害であり得る固定剤である。ヒュームフードの固定ステップを実行し、適切な防護服とニトリル手袋を着用してください。アルコールシリーズから70%までのこのステップ以降のすべてのソリューションは、後で専門スタッフによる除染のために保管する必要があります。
   3. すべてのサンプルを収集した後、固定を更新します。
   4. バイアルを真空チャンバーに移し、ゆっくりと真空を適用します。60 kPaに達すると、浮遊材料はバイアルの底部に沈み始めます(図1B)。
   5. 室温で2時間-80 kPa以下の真空下に保管してください。
   6. 真空をゆっくり解放し、ガラスバイアルを密封し、4°Cで一晩置きます。
   7. 夜間固定中にシンクされなかったサンプルを破棄します。残りのサンプルを25 mM PBS pH 7で10分間洗浄し、続いて25 mM PIPESバッファpH 7.2で20分洗浄します。
   8. エタノール系列(25%、35%、50%、70%、80%、90%、および3x100%エタノール)でサンプルを脱水し、それぞれ20分間乾燥させます。脱水サンプルを埋め込み用にラベル付きガラスバイアルに直ちに移す(図1C)。
      注:脱水プロセスは、70%エタノールステップで一時停止することができます。
2. LR-ホワイト樹脂埋め込み
   注:LR-whiteは、低粘度の非疎水性アクリル樹脂であり、多くの厚い細胞壁層を持つ組織を貫通するのに理想的です。LR-Whiteはまたほとんどの植物のサンプルを切ることのための互換性があるいくつかの硬度の等級入って来。使用樹脂に適切な触媒が混入していることを確認するか、サプライヤーの指示に従って樹脂を準備してください。次の埋め込みプロセスは遅いですが、結果は手段を大いに正当化します。
   1. 一連の三日単位の樹脂濃度(1:3、2:3、1:1、3:2、3:1、1:0)の一連の樹脂でLR-白樹脂をインキュベートし、各ステップで4°Cで24時間インキュベートします。
      注意:LR-ホワイト樹脂は低毒性アクリル樹脂です。しかし、接触や吸入によって皮膚に刺激を与える可能性があります。換気の良い場所や、適切な保護用の着用とニトリル手袋を備えたヒュームフードの下での作業は強くお勧めします。
   2. LR-白色樹脂をリフレッシュし、4°Cでさらに12時間インキュベートします。
   3. 適切なサイズの埋め込みゼラチンカプセル(サイズ1(0.5 mL)をサンプルに3mmまで、最大5 mmまたは3 x 0.3 mLまでのサンプルに対して2 x 0.37 mL、および紙タグ(図1D)を準備します。
      注:試料を樹脂に完全に封じ込めることができるように、サンプルよりもわずかに大きいカプセルサイズを選択します。また、ペンや印刷されたインクは樹脂を汚染し、サンプルを損なうので、タグに鉛筆でラベルを付けることを忘れないでください。
   4. 各カプセルの底に新鮮なLR-白樹脂を1滴塗布します。
   5. 各ゼラチンカプセルにサンプルを入れ、新鮮な樹脂で最大容量に充填します。カプセルキャップを置き、静かに押して密閉シールを形成します(図1E)。
   6. 樹脂を58°Cで24〜48時間重合し、完全に硬化するまで重合します。
   7. サンプルは室温で保存します。
      注:ポスト重合LR白色樹脂は不活性です。

2. スライド準備

注:ガラススライドは、ほこり、グリース、その他の汚染物質を含まず、清潔でなければなりません。一部のサプライヤーは、スライドがくっつくのを防ぐために油と洗剤を使用するので、新しいスライドを清掃する必要があります。ポリL-リジンで処理しても、グリースや洗剤は、スライドへのセクション接着を妨げます。糸くずとほこりは標本の観測に影響を与え、実験を台無しにする可能性が非常に高い。反応ウェル付きのテフロンコーティングスライドは、このタスクに最適です。それらは現実的で再利用可能であり、必要な抗体溶液の量を劇的に減らす。適切な洗浄により、優れた品質の蛍光免疫局在化を非常に手頃なコストで実行できます。

1. スライド洗浄
   1. スライドを染色ラックに入れ、洗浄液(0.1%SDS(w/v)、酢酸1%(v/v)、エタノール10%(v/v))で覆います。
   2. 20分間軽度の攪拌を維持します。
   3. 染色ラックを軽度の攪拌でddH₂Oバスに10分間移します。4回繰り返します。
   4. 100%エタノールに短時間浸漬する前にラックを慎重に排水し、スライドをほこりのない環境で乾燥させます。
   5. 使用するまで保管してください。
2. ポリL-リジンコーティング(オプション)
   注:小さなセクションは、通常、ガラスのスライドをきれいにするために非常によく固執します。この手順は、大きなセクション (>2 mm²⁾にのみ推奨されます。大きなセクションは折り目やしわになりがちで、お勧めできません。それにもかかわらず、必要に応じて、より大きな穴を持つ反応スライドを使用します。上記のように清掃し、次のように進めます。
   1. 正方形のペトリ皿にきれいなスライドを置きます。ピペット0.001%ポリL-リジン溶液(w/v)は、オーバーフローすることなく、スライドの穴をカバーします。
   2. スライドは、閉じたペトリ皿で40°Cで一晩乾燥させてください。
      注:コーティングされたスライドはすぐに使用する準備ができて、数ヶ月間、室温で、ほこりのない環境に保存することができます。

3. サンプルのトリミングと切り離し

1. サンプルトリミング
   1. 鋭利なカミソリの刃で、LR-Whiteブロックを実体顕微鏡でトリムして、試料の対象領域に対して頂点が垂直であるピラミッド型の構造を形成する(補足図1A)。
      注:超ミクロトームの標本のホールダーはブロックをしっかり止める優秀な用具である。デバイスにユニバーサル試料ホルダーがない場合は、ラウンドブロックに最も適合したものを使用してください。
   2. 余分な樹脂の細かいスライスをピラミッドの長軸に垂直に取り除くことによって、ピラミッド構造をトリムします。
   3. 切断面を形成するサンプルに到達するまで進みます。切断面内では、ターゲットサンプルを台形で囲むのが理想的です。
      メモ:樹脂ブロックは、スリット角度でさらにトリミングして、鋭い刃で断面表面積を小さくすることができます(図1F)。
2. 半薄い切断
   注:ガラスナイフ付きのミクロトームが使用されます。エピトープに結合する抗体の能力は、免疫標識反応の成功を条件とします。LR-White樹脂の親水性により、抗体と試料切片との接触が良好に認められます。薄いセクションは、セクションを見つけ、イメージングプロセスを支援するために使用されるかすかなカルコフルーター着色を提示します。後で適用される可能性のある他の汚れについても同じことが言えます。また、厚さが過ぎると、画像取得品質にも影響します。断面の厚さに対する優れた妥協点は、組織の特性に応じて、200〜700 nmの間で見つけることができます。超ミクロトームの標本ホルダーにしっかりとブロックを取り付けます。
   1. 超ミクロトームを使用して、厚さが200~700nmの断面を作ります(図1G)。
   2. 一部のセクションをガラススライド上のddH₂Oドロップに移して、セクション領域を確認します。50°Cのホットプレートにスライドを置き、水が蒸発するまで置きます。30 sのセクションの上に1%ホウ酸溶液(w/v)に1%のトルイジンブルーO(w/v)の低下を置くステイン。すすいで顕微鏡で観察します。
   3. 所望の構造を見つけると、クリーンな反応スライドの各ウェルにあらかじめ置かれた_ddH2Oの各ドロップに1つまたは2つのセクションを移します。
   4. 各スライドを閉じた清潔な10cm平方シャーレに入れ、50°Cで乾燥させます。
   5. 使用するまで、スライドをクリーンなアーカイブ ボックスに保存します。

4. 免疫局在

注:蛍光免疫局在化手順は、2つの抗体の逐次使用に依存します。一次抗体は、特異的標的抗原に対して上昇する。二次抗体は、一次抗体に対して特異的に提起され、蛍光技術のために、フルオロフォア(この特定のプロトコルにおけるFITC)に結合される。一次抗体はサンプル中の標的抗原を検出するために使用され、二次抗体は、一次抗体の過剰を洗い流した後、サンプルに結合された一次抗体の位置をマークするために使用されます。制御はこのアッセイの重要な部分であり、観測の正確性を保証するために常に行われなければならない。スライド上の1つの井戸は、一次抗体治療がスキップされる陰性対照として予約されるべきであり、したがって、実験の最後に信号を観察してはならない。陽性のコントロールは、標識がすでに知られており、確実である抗体で1つをうまく治療することによって実験に含まれなければならない。陽性対照は、二次抗体の標識効果と反応条件を確認するために使用され、陰性対照は二次抗体特異性を試験する。

1. 湿らせたペーパータオルをピペットチップボックスの底に置き、スズホイルで包んでインキュベーションチャンバーを準備します(補足図1B-1E)。スライドをインキュベーションチャンバーに設置します。
2. ピペットはブロッキング溶液(1 M PBSで5%ノンファットドライミルク(w/v)の8mmウェルあたり50 μLの低下を、10分間インキュベートします。ブロッキング溶液を取り出し、PBSで2回10分間全てのウェルを洗います。
3. 一次抗体溶液を調製( 補足表1参照)、ブロッキング溶液中の1:5(v/v)抗体;8 mm 当たり約40 μLの推定値を作ります。
   注: 抗体の濃度は、製造プロトコルに従って調整する必要があります。
4. ddH₂Oで5分間最終洗浄を行い、井戸を完全に乾燥させないでください。
5. 反応ウェルに対する一次抗体溶液をピペットする。コントロールウェルへのピペットブロッキング溶液。
6. インキュベーションチャンバーを閉じ、室温で2時間放置し、続いて4°Cで一晩放置します。 2次抗体溶液を1%ブロッキング溶液(v/v)で調製し、1ウェルあたり約40μL。スズ箔で覆ったままにしておきなさい。
7. PBSで10分間すべての井戸を2回洗浄し、続いてddH₂O.で10分追加します。
8. すべてのウェルに二次抗体溶液をピペットします。これからは、光からスライドを保護します。
9. 室温で暗闇の中で3〜4時間インキュベートします。
10. PBSで10分間すべての井戸を2回洗い、続いてddH₂Oで10分の別の洗浄を行います。
11. 各ウェルにカルコフルーア(1:10,000(w/v)蛍光明るい28の滴を適用します。洗浄せずに、各ウェルに取り付け媒体(材料表を参照)を適用し、カバースリップを配置します(図1H)。
12. 10x/0.45、20x/0.75、40x/0.95、100x/1.40レンズを搭載した蛍光顕微鏡で観察し、UV(カルコフルーター染色用)とFITCフィルターを使用して細胞壁と免疫局在を検出します(図1I)。UV の場合は励起/放出 (nm) 358/461、FITC の場合は 485/530 の波長を使用します。
13. 結果のより良い視覚化のために、両方の画像が ImageJ または類似の画像と重なっています。

結果

実験が成功すると、二次抗体は特異的に明るい緑色の特定のエピトープの位置を一貫した方法で特定し、細胞、組織または器官の特定の発達段階で細胞壁組成物の特徴付けを可能にする。例えばLM6抗体は、1,5-アラビナン、開発中のケルカス・スバー ・アンテル(図2A)の細胞壁に豊富にラベルを付けているI型ラムノガラクチュランを有する化合物に対する高い親和性を有し、したがって、このタイプのペクチンが豊富であり、一次細胞壁組成物の一部であると結論付けることができる。JIM5は、典型的にはケルカス・スベル胚の根端に見られるほとんどエステル化されていないホモガラクトゥロン類に対する親和性を有し、器官の機械的特性を指定する(図2B)。キシログラクロナンは、細胞壁の緩みと関連するキシロースが豊富なペクチンの一種であり、退化細胞に見られる。この抗体LM8は、キシログラクトルナンを特異的に認識し、成熟器官において、ケルカス・シューバー・アグリイオン熟成の最終段階における胚乳細胞のような退行細胞ま...

ディスカッション

ここで説明する植物における蛍光免疫局在化法は、シームレスに簡単に説明する一方で、いくつかの小さなステップの成功に依存しています。最初のサンプル調製と固定です。この最初のステップでは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合物が細胞成分の大部分を架橋するために使用されます。溶液中のホルムアルデヒドは、グルタルアルデヒドが強いより永続的な結合を提供しながら、軽度で可逆的な固定を提供します。2つの固定剤間のバランスは、適切な量の架橋を提供し、エピトープの曝露が一次抗体¹⁰と反応することを可能にする。固定ソリューションが正常に動作するためには、サンプルが小さくなければなりません。直径7mmを超える大きな構造物は、固定が非常に難しく、固定性浸透を確実にするために切り取る必要があります。

傷やストレスの後、一部の植物は、固定プロセスを妨害するホルムアルデヒドと反応する可能性のある暗い沈殿物を形成する大量のタンニンを分泌する。試料を氷の上に置き、曇りになるたびに固定液を交換することで、この効果を軽減できます。空気はまた、固定プロセスと後で樹脂の埋...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
25% (w/v) グルトアルデヒド	寒天 Scientific	AGR1010	aq. 溶液、メタノールフリー
8ウェル ガラス反応スライド	マリンフェルド	MARI1216750	他のブランドも使用可能
酢酸	Sigma-Aldrich	A6283
抗ラット IgG (wole 分子)-GOAT で産生	Sigma-Aldrich	F6258
カバースリップ、24 mm x 50mm	マリンフェルド	MARI0100222	カバー スリップはすべての井戸を覆う必要があります。他のブランドを使用することもできます
ddH2O	na	無
水エタノール
増白剤 28	Sigma-Aldrich	F-6259
ゼラチンカプセル	寒天科学	AGG29211	カプセルのサイズは、サンプルのサイズに合う必要があります。
ガラスバイアル	na	na	密封可能なシンプルで安価なガラスバイアルであれば、どれでも使用できます。バイアルは、使用後に96%エタノールで洗浄してLR-White残留物を除去し、再利用することができます。
LR-white 中グレード、埋め込み樹脂	寒天科学	AGR1281	LR-White にはいくつかの形態があります。中グレードはほとんどの組織に適切な切断サポートを提供しますが、硬い組織にはより硬いグレードの LR-white が推奨される場合があります。可能であれば、ポリメレーション活性剤(過酸化ベンゾイル)と混合済みの樹脂を使用し、そうでない場合は、供給業者の指示に従って樹脂を調製してください。
無脂肪粉ミルク	ネスルé	na	任意の無脂肪粉乳は、
オーブン	na	na	一般的な実験室オーブン
ペトリ皿、10 cm x 10 cm四方	na
パイプ	Sigma Aldrich	P1851
ラットは、モノクローナル抗体	植物プローブを生成します		細胞壁の成分を認識するいくつかの抗体は、Complex Carbohydrate research center (CCRC、ジョージア大学USA)とPlant Probes(Paul Knox Cell Wall Lab、英国リーズ大学)の両方で入手可能です 。 、一般的に使用されるMABSの短いリストと、それらが購入できる場所 は、補足表1
カミソリの刃、	または		通常のカミソリの刃、
SDS	、シグマ-アルドリッチ	、L6026
トルイジン、ブルーオー	、寒天、科学	AGR1727
トゥイーン、20	、シグマ-アルドリッチ	、P9416
、ウルトラミクロトーム	に記載されています。ライカマイクロシステムズ	UC7
直立落射蛍光顕微鏡、UVおよびFITC蛍光フィルター付き	カマイクロシステム	DMLb
真空チャンバー	、
ポンプ	、
Vectashield	Vecta Labs、	T-1000	他の退色防止剤を使用することもできます。FITCおよび蛍光ブライトナー28との互換性を確認してください。(注:非商業的な代替品については、(Jonhson et al 198218を参照)25 mg/mLの1,4-ジアゾビシクロ-(2,2,2)オクタン(DABCO)を9:1(v / v)グリセロールに1xPBSに混合することにより、退色防止培地を作ることができます。希釈したHClでpHを8.6に調整します。

された na 蛍光、、、ライ真空、