発達中のゼブラフィッシュにおける変化した血液形成を検出し定量するためのフローサイトメトリーの使用

サマリー

このアッセイは、胚性ゼブラフィッシュの開発における造血細胞を定量化する簡単な方法です。解離されたゼブラフィッシュからの血液細胞は、フローサイトメトリー分析を行う。これにより、変異動物および遺伝子改変後の血液欠陥の検出が可能となる。

要約

脊椎動物の成熟した血液を構成する細胞系統の多様性は造血幹細胞と前駆細胞(HSPC)の分化から生じる。これは生物の寿命を通して起こる重要なプロセスであり、胚発生中に関与する分子経路の破壊は壊滅的な長期的な結果をもたらす可能性があります。多くの理由から、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は造形学を研究するモデル生物となっています。ゼブラフィッシュ胚は外部に発達し、7日までに受精後(dpf)は、生涯持続する決定的な血液細胞のサブタイプのほとんどを産生している。造血細胞の数を評価するアッセイは、主に特異的な組織学的染色を利用して、その場でのハイブリダイゼーション技術において、および蛍光タンパク質の発現を駆動する血液細胞特異的プロモーターを利用するトランスジェニック動物の顕微鏡検査を行って開発されている。しかし、ほとんどの染色アッセイおよび現場でのハイブリダイゼーション技術では、存在する血液細胞の数を正確に定量化しません。セル番号の大きな違いだけが容易に視覚化されます。トランスジェニック動物を利用し、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡で個人を分析することができますが、これらのアッセイの定量は手動でカウントするか、高価なイメージングソフトウェアを使用することに依存しており、どちらもエラーを引き起こす可能性があります。血液細胞数を評価する追加の方法の開発は、経済的で迅速であり、CRISPR媒介性遺伝子組み換え、モルフォリノ媒介性転写物の減少、および造血に影響を与える薬物化合物の大規模な影響を迅速に評価するために自動化することさえできる。この新しい血液細胞を定量化するためのアッセイは、ゼブラフィッシュ胚全体を解離し、存在する蛍光標識された血液細胞の量を分析することによって行われる。これらのアッセイは、胚発生中の血液細胞の生成、拡張、および調節を担う分子経路の解明を可能にする必要があり、研究者は血液疾患の間に変化した新しい要因、ならびに脊椎動物造血の進化の間に不可欠な経路をさらに発見することを可能にする。

概要

血液産生(造血)は、初期胚で始まる必須の発達過程である。このプロセスは、中皮から直接原始的な赤血球およびマクロファージを生成することから始まり、後に造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)の産生に向けてシフトする。多能であるこれらの幹細胞は、生物中の成熟した血液細胞のすべての品種を生成する。自己更新が可能なシステムは、これらのHSPを通じて継続的に補充されます。このプロセスは開発の早い段階で始まりますが、造血は動物の生命のために続き、身体の遠くの部位に酸素を輸送し、傷害後の出血を止め、感染から体を保護する能力を提供する。この複雑なシステムの開発は、開発中に時間的および空間的に制御され、血液細胞産生の任意の摂動は、貧血、血小板減少症、白血病をもたらす、生物にとって壊滅的なことができます。

造血研究に使用される人気の動物モデルは、人間と比較して同様の血液発達を持つため、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)です。実際、造形中に使用される遺伝子や分子経路の多くは脊椎動物の進化を通じて保存されており、ゼブラフィッシュを研究することでヒト遺伝子について学ぶことができます。重要なことに、ゼブラフィッシュ胚は体内外で発達し、7日以内にほとんどの成熟した血液細胞タイプを生成し、短時間で造血系を直接可視化することが可能である。ゼブラフィッシュも非常にフェクンドであり、研究者は短期間でより多くのサンプルを観察することができ、再現可能なデータを生成するためにも重要です。ゼブラフィッシュの短い生成時間と外部開発は、変異生成研究^{1、2、3、4、5および}薬物スクリーニング6、7、8、9、10の間に容易な操作^および観察を提供する。これにより、ヒト血液疾患に対する有望な治療化合物のパネルを迅速かつ効率的に試験することができます。

重要なことに、ゼブラフィッシュも遺伝的に適しており、ゲノムは配列決定され、アノケン化されています。この難解性により、モルフォリノ(MO-)媒介型ノックダウンやCRISPR媒介性遺伝的アブレーションなどの逆遺伝学技術が実行される。ゼブラフィッシュはまた、前方の遺伝的スクリーンを実行するためのモデルとしての有用性を証明しています。脊椎動物の血液形成に関与する多くの必須遺伝子および経路が、この方法で発見されている。ゼブラフィッシュでは、血液細胞を観察する数多くの方法も開発されています。従来の組織学的染色技術が存在する一方で、血液特異的転写物に対してその際のハイブリダイゼーションを行うことも可能である。重要なことに、多数の魚類のトランスジェニックラインも存在し、それによって蛍光タンパク質が系統特異的プロモーターによって発現され、蛍光タンパク質¹¹を有する特定の血液細胞の標識を可能にする。これにより、研究者は、時間の経過とともに生きている生物の血球の起源、拡張、および調節の最新の観察を行うことができます。

全体的に、造血系の保存、トランスジェニックラインの存在と容易な発達、容易な視覚化、および短い生成時間は、ゼブラフィッシュを経済的で迅速で適応可能な造血モデルにした。ゼブラフィッシュの研究者が利用できる技術のツールボックスを改善するために、我々は胚の血液細胞の数を堅牢に定量化するためにこのアッセイを開発しました。この方法は、トランスジェニック動物を消化し、蛍光血液細胞のフローサイトメトリーを行うことを含む。このように、変異動物由来の血液細胞、MOおよびCRISPR修飾の効果、および小分子の効果を迅速かつ再現可能な方法で定量的に分析することができる。これらのアッセイは、血液細胞を列挙するユーザーフレンドリーで経済的な方法であり、時間の経過とともにその生成、増殖、および維持の検査を可能にする。

プロトコル

カリフォルニア州立大学チコ校の制度的動物管理・使用委員会(IACUC)諮問委員会は、以下に記載されているすべての方法を承認しました。

注:1フェニル2-チオ尿素(PTU;) 表 1)24時間受精後(hpf)で、フローサイトメトリーによる蛍光差別に悪影響を及ぼす色素沈着を防ぎます。以下に示すすべての手順は、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞の分類(FACS)に対して許容されます。しかし、もし目的がFACSの後に造血細胞を培養することであるならば、サンプルを処理する際には滅菌の習慣に従う。無菌の方法で胚サンプルを漂白および調製するためのプロトコルは、以前¹²に記載されている。

1. 48 hpfゼブラフィッシュ胚のデコールリオネーション

1. 10cmのプラスチックペトリ皿に胚(少なくとも5個、しかし200個以下の胚)を使用して、胚が下端に沈むように皿を傾ける。
   注:蓋を外し、ペトリ皿の1つの端の下に蓋を置くことによって、皿を傾けるのは簡単です。
2. できるだけ多くのE3培地(表1)を取り除いて捨て、500μLのデコールリオネーションプロテアーゼ(10mg/mL)を加えます。室温で5分間インキュベートします。
3. 5分後、ペトリ皿を拾い(プレートの下端にすべての胚を保持する)、ペトリ皿の側面を静かにタップし、胚がプレートの底に軽くこすって完全に帯状を取り除くことを可能にします。
4. スクイーズボトルで、プロテアーゼを希釈するためにE3培地の約20mLを加えます。胚がデカンティングすることによってE3培地を沈着させ、取り除くことを可能にする。
5. ステップ 1.4 3x を繰り返して、デコールリオネーションプロテアーゼの痕跡をすべて除去します。
   注: 個々のサンプルを分析するには、少なくとも 5 つの胚が必要です。このデコールリオネーション手順は、ペトリ皿あたり最大200個の胚を収容することができます。サンプルはこの段階でグループ化され、必要に応じて後で分離することができます。あるいは、手動の逆行は、時計職人の鉗子でコリオンを穏やかに引き裂くことによって行うことができる。これは、胚の数が少ない場合に有利である。通常、ゼブラフィッシュは72 hpfによって彼らのころから孵化します。しかし、重度の奇形胚は、そうではなく、その後にデコールリオネーション(手動または化学的のいずれか)を必要とします。

2. 解離のための胚サンプルの調製

1. P1000ピペットを使用して、5-10胚を1つの1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れる。
2. ピペットでE3培地を取り出し、廃棄します。
   注意:胚としての注意を払ってピペットは、簡単に次の手順の間に廃棄することができます。
3. 10 mLのジチオトレイトール(DTT)をE3培地に加えて、胚性ゼブラフィッシュ^{11、12、13、14}を取り巻く粘液コーティングを除去する。マイクロ遠心管を水平に置き、室温で30分間インキュベートします。

3. 胚解離

1. Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩基(DPBS)の1 mLで胚3xをCa²⁺ およびMg²⁺ で洗浄し、DTTの痕跡を除去します。最後の洗浄の後、5mg/mL⁽²⁶ U/mL) 解離プロテアーゼのCa 2+とMg²⁺ と5 μLのDPBSの500 μLを加えます。
   注:他のアイソトニックバッファリング溶液を使用することもできますが、解離酵素が正常に機能するためにはCa²⁺ および^Mg2+ が含まれている必要があります。
2. 185 rpmで水平軌道シェーカーで37°Cでサンプルを60分間インキュベートします。サンプルが完全に解約されるまでP1000ピペットを使用して胚をトリチュレートする。
   注意: 胚を過剰に消化しないように注意してください。いくつかの固体組織が存在する必要があり、それは完全に均質であってはなりません。フローサイトメーター上で観察される標的の血液細胞を破壊する過剰消化が可能である(補足図1)。
   注: この手順は、48-72 hpf 胚に最適です。後期段階では解離プロテアーゼを用いたより長いインキュベーションが必要になることがあります。異なる段階のタイミングは経験的に決定されなければならない。胚組織を解離するより迅速な代替方法がありますが、この方法は60分かかりますが、生きた造血細胞の効率的な分離を可能にするのに十分穏やかで徹底的であることがわかりました。

4. フローサイトメトリーのための解解胚の調製

1. ピペット5解光胚を、35 μmM細胞ストレーナーキャップを備えた5 mLポリスチレン丸底管の上部貯留層に置いた。
2. 濾過細胞を含む5 mLポリスチレンチューブのストレーナーキャップに^Ca2+ または^Mg2+ を有さないリン酸緩衝生理食塩分(PBS)4 mLを加えて細胞をリンスする。
   注:他のアイソトニックバッファリングソリューションも使用できますが、解離酵素を希釈してレンダリングするためにCa²⁺ または^Mg2+ が欠けているはずです。
3. 遠心管は4°Cで、5分間300xgの細胞をペレットする。 ピペットで上清を取り除き、捨てます。細胞をPBSの500 μLで再懸濁します(Ca²⁺またはMg²⁺はありません)。

5. フローサイトメトリー

1. 細胞懸濁液を穏やかに渦を起こして、1:1,000の赤死細胞染色を加える(材料表)。
   注:赤死細胞染色は、標的細胞から死んだ細胞や破片を排除することを可能にする細胞透過性染料であり、緑色蛍光タンパク質(GFP)やDsRedなどの一般的な蛍光体を励起するために使用される488nmレーザーとは異なる633nmレーザーによって励起されるため、死細胞差別のための色素の優れた選択肢です。このようにして、死細胞とトランスジェニック血液細胞からのスペクトル重複はない。1mg/mLのプロピジウムヨウ化素(PI)は、赤死細胞染色に代わる安価な代替物ですが、PIのみで染色されたサンプルと、目的のフルオロフォアのみを使用して測定器の補償を設定するサンプルを予約してください。さもなければ、GFPのようなPIと蛍光ホルモンのシグナルが重なり、偽陽性の結果をもたらす。フローサイトメーターも405nmレーザーを有する場合、青いお父さん細胞染色などの他の染料も優れた選択である。
   注意:血液細胞を分析する際、特定の細胞タイプが赤死細胞の染色を食食いし始める30分後に注意してください。細胞を光から保護し氷上で分析し、染料を加えてから30分以内にフローサイトメトリーを行います。
2. フローサイトメトリー解析
   注: 各フローサイトメーターは少し異なりますが、次の手順は、ほとんどのマシンで分析用のサンプルを準備するのに役立ちます。サイトメトリーを流す初心者のために、特定の機器の専門家である誰かのアドバイスを求めてください。以下の手順は、BD FACSA融合フローサイトメーターに関するものです。
   1. サイトメーターをオンにし、レーザーを20分間温める。空の廃棄物タンクは、シースタンクに適切な溶液を充填し(フローサイトメーターに基づいて変化する)、流体システムを開始します。
      注: フローサイトメーターの種類ごとに、通常は特定の起動手順があります。その起動手順に注意して従ってください。
   2. 解析ソフトウェアでは、5つのプロットを描きます(図1A)。
      1. X 軸上の最初のドット プロット測定前方散布 (FSC)、y 軸の側面散布 (SSC) を使用します。FSC をリニアに、SSC をログとして設定します。
         注: FSC はセル サイズの測定であり、SSC は粒度の測定です。これは、破片からの細胞の識別を可能にします。胚性ゼブラフィッシュ血球集団は、前に記載した成体ゼブラフィッシュ血液細胞と同じ方法でサイズと粒度によって分離しない^15。代わりに、彼らは他のすべての消化胚細胞と同じ集団に現れます。
      2. 2 番目のプロットを設定して、FSC の高さ (H) と FSC 幅 (W) を調べます。SSC (H) 対 SSC (W) を測定する 3 番目のプロットを設定します。
         注: この手順は、ダブレット(レーザーを通過するときに一緒にくっついているセル)を除外するために使用されます。
      3. 第4ドットプロットを設定して、x軸上の赤死細胞染色を測定します(サイトメーターに応じて、これは通常、y軸上の同種菌類[APC])およびSSCに使用されるフィルターに相当します。これにより、死んだ細胞からの生細胞の識別が可能になります。
         注:各サイトメーターのフィルタセットは異なる場合があります。死細胞判別色素に正しい検出フィルターを使用してください。
      4. 5番目のプロットは、選択した蛍光素を測定します。これを蛍光素のヒストグラム(図1)として視覚化するか、ドットプロット(補足図2)を使用します。
         注: 同じ動物の複数の蛍光素を調べる場合は、ドット プロットを使用して両方のパラメータを同時に表示することをお勧めします。フルオロフォアがスペクトルが重なり合っている可能性がある場合(補足図2)、ドットプロットも推奨されます。[面積 (A)] 設定を使用して、すべてのパラメータのレーザーパルスによって生成される曲線下の面積をより正確に計算します。
   3. サンプルをロードし、流量を減らして、サンプルが急速に不足しないようにします。細胞集団の大部分がはっきりと見えるようにFSCとSSCの設定を調整します(図1A)。
   4. セルの母集団の周囲にゲートを描画し、セルにラベルを付けます。2番目のドットプロットがセルにゲートされていることを確認し、最初にFSCでゲートし、次にSSCシングルでゲートしてダブレットを除外します。
   5. 4番目のプロットでは、明らかに負の母集団が存在するように、赤死死細胞染色設定を調整します。これらのセルの周囲にゲートを描画し、ライブ セルにラベルを付けます。5番目のプロットでは、生細胞にゲートを付け、フルオロフォア陰性細胞と陽性細胞を調べます。正のセルの周りにゲートを描画します。
      注:この階層ゲーティング戦略は、細胞ゲートにも存在する生細胞ゲートに存在する単一のフルオロフォア₊ 細胞を調べます。ゲートを適切に設定するように注意してください。これらのゲートは実験に応じてカスタマイズできます。
   6. 各サンプルを実行し、25,000 以上のライブ セル イベントを収集します。
   7. シャットダウン手順に従って、流体をオフにします。シースタンクを補充し、廃棄物タンクを空にします。
      注:タンパク質発現が低い場合^{や細胞集団} が少ない場合、フッ素+細胞を可視化することは困難な場合が多い。パラメータが適切に設定されるようにするには、フルオロフォア^- 兄弟胚を一緒に準備して、ゲートを適切に描画し、レーザー電圧を調整する必要があります(補足図2)。ターゲット セルの母集団がまれである場合は、25,000 を超えるイベントを収集します。5-10の消化された動物では、何百万ものイベントを収集できるはずです。また、これらのデータを用いてフルオロフォア⁺ 細胞の総数も得られる。サンプル中の細胞の総数をヘモサイトメーターで数え、フルオロフォア⁺ 細胞の割合を掛けて、魚1匹あたりのフルオロフォア+細胞の絶対数^を 求めます。

結果

胚性ゼブラフィッシュの赤血球を列挙するために、lcr:GFP¹⁶胚をPBS、7.0 ng/nL ism1 MO、または7.0 ng/nL ism1 MOと共に1細胞段階で注射^した。48 hpfで彼らは消化され、フローサイトメトリー分析を行った。各サンプルからGFP⁺赤血球の割合を分析した後(各サンプルは5無作為に選択された胚です。図1A)において、全制御群の平均を算出した。この平均は1に設定され、すべてのパーセンテージはその基準点から計算されました。これらのデータは、特定のMOを有するism1転写物を減少させることで、48hpf胚に存在する^GFP+赤血球の数を減少させたことを示している。さらに、 外因性 mRNA を有するism1レベル...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、原始的で決定的な脊椎動物造形を研究するための優れたモデルシステムです。過去数十年にわたり、複数のアッセイが開発され、精製され、ゼブラフィッシュが薬物の検査、遺伝子変異体の生成と検査、および造血に不可欠な分子経路を分析することを可能にする全体的な迅速かつ経済的なモデルになることを可能にしました。このプロトコルは、迅速なデータ収集、成虫動物よりも少ない物理的空間の使用、および大規模な化学スクリーンのためのより少ない薬物の使用を可能にする胚性ゼブラフィッシュを利用する。また、mRNAの過剰発現後の定量、CRISPR変異体の生成、およびMO誘発性転写物の減少が、初期胚発生時に起こる特定の遺伝的経路を変化させる。重要なことに、それは、その場合のハイブリダイゼーションや組織学的染色技術では困難である血液細胞の敏感で、強い定量を可能にする。

このアッセイは柔軟で、多くの研究課題に答えるために修正することができます。このプロトコルの1つの変更は、動物の発達段階が異なる血液細胞タイプを定量するために操作される場合に行うことができる。例えば、赤血球はゼブラフィッシュの発達の早い段階...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 ml MCF チューブ	FisherBrand	05-408-129
10 mm ポリスチレン イージーグリップ ペトリ皿	Corning Falcon	351008
5 ml ポリスチレン丸底チューブ セルストレーナーキャップ付き	Corning Falcon	352235
BD FACSAria Fusion フローサイトメーター	BD Biosciences
ジチオールスレイトール (DTT)	Sigma-Aldrich
646563 DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+	Life Technologies	14080-055
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
Librease	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	dissociation protease
Pronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	デコレーションプロテアーゼ
SYTOX Red Dead Cell Stain	Invitrogen	S34859