フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

サマリー

このプロトコルの目的は、ヒトノロウイルスの真核生物病原体の細菌への結合を定量化することです。初期のウイルス-細菌付着アッセイを行った後、フローサイトメトリーは、集団内のウイルス結合細菌を検出するために使用される。

要約

コメンサルバクテリアは、真核生物ウイルスの感染に影響を与えるために十分に確立されています。病原体と宿主微生物叢との間の直接結合は、これらのウイルスの多くについて感染を改変する原因である。このように、ウイルス-バクテリア結合の性質を特徴付けるのは、細菌がウイルス感染を変えるメカニズムを解明するために必要な基礎的なステップである。ヒトノロウイルスの場合、コメンサルバクテリアはB細胞感染を増強する。ウイルスは、これらの細菌に直接結合し、この直接相互作用が感染増強のメカニズムに関与していることを示す。放射性標識ウイルスおよびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のシンチレーションカウントを含む細菌とウイルスとの相互作用を定量化するために、様々な技術を使用することができます。どちらの方法も生きたウイルスの使用を必要とし、実験室で生成する必要があります。現在、ヒトノロウイルスに利用可能な確立されたインビトロ培養システムは、高濃度ウイルスストックの生成を可能にするのに十分な堅牢性を持っていません。生きたウイルスの代わりに、ノロウイルスと細菌の相互作用を特徴付けるためにウイルス様粒子(VLPs)が使用されてきました。ここでフローサイトメトリー法は、グラム陰性およびグラム陽性菌に対するVLP結合を定量するウイルス特異的抗体を用いて記載される。試験した細菌へのVLP結合の背景抗体結合および正確な定量化を減少させるアッセイの最適化のために、細菌のみ及びアイソタイプ制御の両方を含む。VLP:細菌比率が高いと、VLPは細菌集団の大部分に結合する。しかし、VLP量が減少すると、結合する細菌の割合も減少します。最終的に、この方法は、ノロウイルスを調節する特定の条件および構造成分を解明する将来の実験で使用することができる:細菌相互作用。

概要

ヒトノロウイルス(HuNovs)は、世界中の胃腸疾患の主な原因であり、毎年6億8,500万人の感染症と20万人以上の死亡を引き起こします^。他の腸内ウイルスと同様に、この病原体の感染を増強するとともに、その代理ウイルスであるマウスノロウイルス^22,33の感染を増強することが示されている。また、細菌がヒトノ^,ロウイルス^4、5、65による感染⁴を阻害する可能性があるという矛盾する報告もある。⁶いくつかのウイルスに対して、ウイルスと細菌の直接相互作用は、ウイルス感染^{22、7、8、9、107,8,9}に影響を与えるメカニズムの根源であるように見え^、10ヒトノロウイルスが細菌^11、12,12の表面に直接結合することが電子顕微鏡によって示されている。したがって、これらの相互作用を特徴付けるのは、細菌がウイルス感染に影響を与えるメカニズムを決定する上で重要になってきました。この特性評価は、古典的に、宿^,主微生物叢^{7、12、1312}の構成要素である細菌種の配列に対⁷するウイルス結合を定量化することで始^まった。これらの付着アッセイは、細菌に結合するウイルスの量を明らかにするだけでなく、この相互作用がウイルスの適性および生存に及ぼす影響を決定するのに役立ちます。

ウイルスの付着を定量するために、伝統的に採用される方法としては、ウイルスゲノム¹²または放射性標識ウイルスの生成を定量するPCRベースのアッセイと、ウイルス粒子^{7、8、9、138,9}を定量するためのシンチ⁷レーションカウントの使用が含まれる。^,13これらの方法を使用するには、一般的に高い刺激性ウイルス株へのアクセスとそれらを生成するためのインビトロ栽培技術が必要です。ヒトノロウイルス用の培養システムは^{22、14、1514}に存在するが^、15ヒトノロウイルス/細菌相互作用を定量化するためにPCRおよびシンチレーションカウントの使用を制限または排除するこれらの高濃度のストックを生成するために必要な堅牢な複製をサポートするものはない。

この問題を回避するために、ウイルス様粒子(VLPs)は、ヒトノロウイルスと細菌^16、17,17との相互作用を調査するために生きたウイルスの代理として使用することができる。Vlps は、派生元のウイルスによく似た非感染性の粒子です。ヒトノロウイルスの場合、これらの粒子はVP1(そしていつかVP2)タンパク質の発現から生成され、遺伝物質を欠いた無傷のウイルスキャプシド(すなわち、ノロウイルスのRNA)を作成するために自己集合する。これらのVLPは、よく特徴付けられており、それらが由来する野生型ウイルスに構造的および抗原的に類似している18、19、20、21、22、23。^{18,19,20,21,22,23}したがって、VLPは、ヒトノロウイルスとコメンサルバクテリアの表面相互作用を調べるための理想的な代理として機能します。VLPには遺伝物質が欠けているため、PCRベースのアッセイはウイルス結合の定量化には使用できません。抗体ベースのフローサイトメトリー法は、先に説明したものであり、半定量的に¹⁶の方法で細菌に結合する低レベルのVLPを検出することができる。この方法は、グラム陰性およびグラム陽性の共生菌¹⁶の両方に結合するヒトノロウイルスVLPの正確な定量を可能にするように最適化された。

プロトコル

注:プロトコルに概説されている細菌の増殖条件は、エンテロバクタークロアカエとラクトバチルスガッセリの標準的な培養条件です。ウイルス:細菌の付着アッセイを他の細菌種と行うためには、細菌に適した標準的な条件下で培養する必要があります。

1. 細菌増殖培地の準備

1. エンテボバクター・クロアカエ成長培地
   1. 10gのトリプトン、5gの酵母エキス、10gの塩化ナトリウム(NaCl)を1Lの脱イオン化(DI)水に溶解して液体培地を調製する(材料表参照)。すべてのメディアを完全に混合し、30分間オートクレーブで滅菌します。
   2. 10gのトリプトン、5gの酵母エキス、10gのNaCl、および1LのDI水中の寒天の15gを溶解して固体培地を調製する。すべてのメディアを完全に混合し、30分間オートクレーブで滅菌します。
2. 乳酸菌ガッセリ成長培地
   1. デマン、ロゴサ、シャープ(MRS;材料表を参照)の55gをDI水1Lに溶解させて液体培地を調製する。準備から1ヶ月以内に培地を使用してください。殺菌するには、沸騰するまで15分間熱し、その後15分間オートクレーブする。
   2. MRS粉末55gと1Lの寒天を1LのDI水に溶解して固体培地を調製する。殺菌するには、沸騰するまで15分間熱し、その後15分間オートクレーブする。

2. 光学密度(OD)と細菌濃度を相関する標準曲線の確立

1. 適切な液体培地の5mLを寒天プレート(E.クロアカエ)から単一の単一の単一の分離コロニー(E.クロアカエ)または冷凍グリセロールストック(L.ガッセリ)から直接接種する。
2. 適切な大気条件下で一晩細菌を成長させる(エンテロバクター・クロアカエ:200rpmで好気的な揺れで37°C。L.ガッセリ:気密容器内で揺れのない37°Cの水浴)。
3. 一晩培養した2 x 1.3 mLのアリコートを、10,000 x gの2つの別々の1.5 mL遠心管と遠心分離細菌に5分間移す。
4. 上清を取り除き、滅菌1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の1mLでサンプルを洗浄します。この洗浄手順を合計 2 回の洗浄に繰り返します。
5. サンプルを5分間10,000 x gで再び遠心分離し、上清を取り除き、1.3 mLの無菌1x PBSで再懸濁します。
6. 洗浄培養液の0.5 mLから始まり^{、10-1から10-4}に1x PBS^-4で細菌を連続して希釈する。
7. 分光光度計を用いて、洗浄された未希釈培養と4つの希釈液のそれぞれを600nm(OD600)で測定する₆₀₀。
8. ステップ2.6からの希釈ごとに1x PBSで10倍のシリアル希釈を行います。各シリーズの最後の3つの希釈液のプレート100μLを適切な固体媒体に広げ、各サンプルの1ミリリットル当たりのコロニー形成単位(CFU/mL)の数を決定する。各希釈液を三重に盛り付けます。
9. プレートを室温で5分間乾燥させ、プレートを反転させ、適切な大気条件下でインキュベートします(E.クロアカエ:37°Cの好気性、プレートを一晩インキュベートします)。L.ガッセリ:37°Cで嫌気性、アネロビキュエア袋付き気密容器内の48時間のプレートをインキュベート(材料表を参照))。
   注:2.5 Lの瓶ごとに1つの嫌気性エアサシェまたは7.0 Lの瓶ごとの3つの袋を使用してください(材料表を参照)。
10. プレート数を使用して、5つのサンプルのそれぞれについてCFU/mLを決定します(すなわち、希薄化されていない、10^{-1、10-2、10 -3、10-3-4)。}OD₆₀₀と CFU/mL を比較した標準曲線を生成します。この線の方程式は、VLPバクテリアアタッチメントアッセイで使用され、OD₆₀₀に基づいてCFU/mLを決定します。

3. VLPバクテリアアタッチメントアッセイ

注意: ヒトノロウイルスVLPはバイオセーフティレベル(BSL)-2危険であり、VLPを含むすべての作業はバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細菌培養物の調製は、付着アッセイの前に、生物に適した安全条件を用いて行われるべきである。

1. 試薬の準備
   1. 1x リン酸緩衝生理食塩分 (PBS)
      1. 1LのDI水にパケット全体を溶解して10x PBSの1Lを準備します。
      2. 30分間のオートクレーブソリューション。
      3. 上記溶液1:10をDI水に希釈して1x溶液を調製した。
      4. フィルターは0.22 μmフィルターを通して溶液を殺菌し、室温で貯える。
   2. 5% BSA
      1. 5 g のウシ血清アルブミン (BSA) 粉末を PBS の 100 mL に加えて 5% (w/v) 溶液を生成します。
      2. 塊が溶解するまで金属攪拌棒を使用してボルテックスまたは攪拌板上で溶液を混合する。
      3. 0.22 μmフィルターを使用して滅菌します。
      4. 溶液を4°Cで保存してください。
   3. フローサイトメトリー染色バッファー(FCSB)
      1. 0.22 μm フィルターを使用して、購入した FCSB (材料表を参照) をフィルターします。
      2. 残りの溶液を4°Cで保存します。
   4. 5% ブロッキング バッファ (BB)
      注:毎回新鮮な準備をしてください。
      1. 無菌FCSBの10 mLにBSAの0.5 gを加えます。
      2. 渦は完全にサンプルを混合し、使用するまで氷の上に残します。
2. 抗体コンジュゲーション
   1. メーカーの指示に従ってR-PE抗体標識キットを使用して、ヒトノロウイルスGII抗体(材料表を参照)とR-PE抗体標識キットを使用して抗体をコンジュゲート(材料表を参照)を使用します(材料表を参照)。
   2. コンジュゲート抗体を4°Cの暗闇の中に保管し、VLP-細菌の付着アッセイ分析で将来使用します。
      注: 一次抗体は、フローサイトメトリー解析に必要な適切な濃度を決定するために、VLP-バクテリアアタッチメントアッセイで使用する前に滴定する必要があります。抗体滴定は、結合反応が行われるたびに、および添付ファイルアッセイに使用される各細菌について行われるべきである。
3. 抗体滴定
   1. 共役した抗ヒトノロウイルスGII抗体を100倍に希釈し、1:100の希釈を開始し、1:600(合計で6希釈)の希釈を終了します。
   2. 以下に説明するウイルス付着アッセイを実行するが、ステップ3.5.7では、細菌ペレットを5%BBの350μLで再懸濁する。
   3. サンプルを7つの50 μLアリコートに分けます。
   4. 各抗体希釈液を1本のチューブに50μL加えます。
   5. 5%BBの50 μLを7番目の管に加え、未染色のコントロールとして使用します。
   6. 以下に説明するように、すべてのサンプルに対してフローサイトメトリーを実行します。
   7. 希釈された抗体サンプルを、染色されていないコントロールと互いに比較します。陽性シグナルの減少または損失をもたらさない最も低い抗体濃度は、その後のアッセイでの使用のために選択されるべきである。
4. 細菌の調製
   1. 細菌が静止期になるまで、適切な大気条件下で適切な液体培地の40 mLで細菌を成長させます。
      1. 37°Cでルリアブロスで気に一晩E.クローカエ培養を成長させ、200rpmで揺れ、静止段階に達する。
      2. 18時間の間、37°Cに設定された水浴で揺れることなく、黒いスクリューキャップチューブでMRSスープのL.ガッセリ培養物を成長させ、静止段階に達します。
   2. 静止相培養液を移し、50 mLの円錐管および遠心分離物サンプルを2,288 x gで10分間細菌をペレットに洗浄する。
   3. 上清を取り除き、滅菌1x PBSの13 mLで再懸濁します。この洗浄手順を合計 2 回の洗浄に繰り返します。
   4. 再度サンプルを遠心分離し、上清を取り除き、20 mLのPBSの中でサンプルを再懸濁します。
      注:細胞ペレットが小さい場合は、リサスペンション量を減らすことができます。
   5. 培養物の_OD600を測定する。
   6. 先に調製した標準曲線を用いて、洗浄培養液のmL当たりのCFUを決定する。
   7. 必要に応じて1x PBSで細菌を希釈し、培養濃度を1 x 10⁸ CFU/mLに調整します。
   8. 1 x 10⁸ CFU/mL細菌培養物の1 mLを必要数の1.5 mL遠心分離チューブに移します。
   9. チューブを10,000 x gで5分間遠心します。
   10. 細菌ペレットを無菌5%BSAの1 mLに再懸濁する。
   11. 一定の回転で37°Cで1時間チューブをインキュベートします。
5. ウイルスの添付ファイル
   1. BSL-2バイオセーフティキャビネット内で作業し、PBSに再懸濁した細菌を含む各チューブにHuNoV VLPs(材料表を参照)を10μg加え、ピペットで十分に混合します。
      注: VLP 濃度は、VLP の各準備によって異なります。したがって、細菌に添加される容積は調製バッチによって異なり、実験の各管に10 μgが加えられるように調整する必要があります。細菌のみのコントロール(例えば、VLPのないサンプル)の場合は、実験サンプルに添加されたVLPの体積に等しいPBSのボリュームを追加します。
   2. 一定の回転で37°Cで1時間インキュベートチューブ。
      メモ:チューブリボルバー(材料表を参照)を40 rpmに設定すると、インキュベーション中に使用されます。
   3. インキュベーション後、サンプルを10,000 x gで5分間遠心分離します。
   4. 上清を捨て、PBSの1 mLで細菌ペレットを再懸濁します。
   5. 洗浄手順3.5.3と3.5.4を繰り返します。
   6. サンプルを10,000 x gで5分間遠心します。
   7. 上清を捨て、5%BBの150 μLで細菌ペレットを再懸濁します。
6. 抗体染色
   1. 新鮮な5%BBを準備します。
      注:蛍光タグ付き抗体を使用するすべての作業は暗闇の中で行われるべきであり、抗体、BBおよびFCSBは氷の上に保たれるべきです。
   2. 希釈ヒトノロウイルスGII抗体1:125(E.クロアカエサンプル用)、L.ガッセリサンプルの場合は1:150を5%BBで、サンプル当たり50μLの希釈抗体を調製した。
   3. アイソタイプ抗体を、ヒトノロウイルスGII抗体を5%BBで各細菌に対して希釈したのと同じ方法で希釈し、サンプル当たり50μLの希釈アイソタイプコントロールを調製する。
   4. ステップ3.3.7の各取り付けアッセイサンプルを3つの50 μLアリコートに分け、清潔な1.5 mL遠心管に移します。
   5. サンプルの最初のセットに、BBの50 μLを加えます。このセットは、非ス染色 (Uns) コントロールになります。
   6. 第2のセットにGII抗体希釈液の50μLを加える。これにより、最終的な抗体濃度は、E. cloacaeの場合は 1:250、L.ガッセリの場合は 1:300 です。このサンプルセットは染色(AB)サンプルになります。
   7. 第3セットに、希釈アイソタイプ抗体の50μLを加える。このセットはアイソタイプコントロール(IC)になります。ピペットでよく混ぜます。氷の上と暗闇の中で30分間サンプルをインキュベートします。
   8. 遠心分離機 10,000 x gで 5 分間のすべてのサンプル。
   9. 上清を捨てて、FCSBの100 μLでサンプルを再中断します。
   10. 5分間10,000 x gですべてのサンプルを遠心分離します。
   11. 遠心分離機 10,000 x gで 5 分間のすべてのサンプル。
   12. 上清を捨てて、FCSBの150 μLでサンプルを再中断します。
   13. 400 μL の FCSB バッファーを含む FCSB チューブに各サンプルを移し、合計容量 550 μL を取り出します。
   14. サンプルは、フローサイトメトリーで分析されるまで4°Cに保ちます。
       注:フローサイトメトリーは、抗体染色の4時間以内に行われます。

4. フローサイトメトリー

注: 以下に説明する電圧設定は、材料表に記載されているフローサイトメーターとソフトウェアに基づいており、フローサイトメーターによって異なる可能性があります。各細菌に対して設定を最適化する必要があります。すべてのグラフの軸が二重指数位であることを確認します。

1. ワークスペースの設定
   注: ワークスペースの設定は、ゲージやデータ解析で使用されるプロットとは異なります。ワークスペースを設定する目的は、細胞集団を可視化し、下流解析に影響を与える可能性のある細菌細胞の過度の凝集がないことを確認し、データが収集されている間に染色細胞と染色されていない細胞を区別することです。
   1. 細菌が一緒に束ならないようにするために、一連の密度プロットを設定します。
      1. 前方散乱領域 (FSC-A) と側散布領域 (SSC-A) を生成して、総人口を視覚化します。
      2. 前方(FSC-W)と側散乱幅(SSC-W)と前方散乱幅(FSC-H)と側面散乱高さ(SSC-H)をそれぞれ比較する2つのグラフを作成して、単一セルとセルの束を評価するプロットを設定します。
      3. PE 正母集団(PE-A と SSC-A)のみを表示するプロットを作成します。
   2. ベースライン電圧をE.クロアカエの場合は500、L.ガッセリでは340に設定します。これらは後でさらに調整されます。
   3. イベント数の合計を 10,000 イベントに設定します。
2. サンプルの実行
   1. SSC-A、FSC-A、またはPE-Aに対してプロットされたカウントを示す3つの別々のヒストグラムプロットを作成します。
   2. フローサイトメーターに染色されていないサンプルを配置し、サンプルイベントを取得し、SSC-Aのヒストグラム上の最大ピークが10 2〜10^{2 3}以内であり、FSC-Aのヒストグラム上の最大ピークがX軸上の104〜105の間であることを確認する。^{4 5}指定されていない場合、ピークは指定された範囲内に収まらず、FSCおよびSSCの電圧を適宜調整します。
   3. 染色サンプル(AB)をフローサイトメーターに配置し、電圧PEを調整して、X軸上で最大ピークが10³を超えるようにします。
   4. これらの測定値に基づいて、正の PE ゲートを設定し、PE-A 対 SSC-A 密度グラフにゲートを設定します。
   5. 低または中速度で決定された設定の下ですべてのサンプルを実行します。

結果

ヒトノロウイルスVLPをコメンサルバクテリアに結合する定量化に用いる格言戦略を図1に示す。代表的な密度ドットは、単一集団でVLP付着が決定されるように、細胞の破片および細胞塊を排除するためにサンプルがどのようにゲートされたかの概要を提供する(図1A)。代表的なヒストグラムは、イソタイプ対照抗体で染色されたVLP-細菌サンプルのノロウイルスVLPおよび低バックグラウンドシグナルを欠くサンプルのみを含む細菌における低レベルの抗ノロウイルス抗体シグナルを示す(図1B)。同じサンプルを抗ヒトノロウイルスGII抗体で染色すると同時に、アイソタイプ制御ピークは未染色サンプルと重なり合い、ピークに有意なシフトをもたらします。

ディスカッション

腸内ウイルスの細菌への結合を定量化する能力は、これらの細菌がウイルス感染を変化させるメカニズムを解明するための重要な第一歩である。本明細書に記載されている方法は、E.クロアカエ(グラム陰性細菌)およびL.ガッセリ(グラム陽性細菌)の両方とのヒトノロウイルスVLP相互作用を測定するために最適化されているが、目的の任意の哺乳類ウイルスおよび細菌との使用に適合することができる。VLPsは、添付ファイルアッセイに使用する生きたウイルスに代わる理想的な代替手段であり、これらの粒子はフローサイトメトリーを用いて容易に定量することができるが、P粒子はヒトノロウイルスと細菌²⁴との相互作用を調べるためにも使用されてきた。本研究では、ここで報告されているように、細菌集団とは対照的に細菌に結合するウイルスの量を定量化した。P粒子は、VLPsと野生型ウイルス^24,25,25の両方に抗原類似性を提...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5ml ポリストレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ	コーニング	352235	抗体染色後、サンプルをチューブに移し、フローサイトメトリー分析を行います。
寒天	培地シグマ	A7002	培地調製に使用
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	ラクトバチルス・ガセリの培養に使用 嫌気性ガスパック
BD FacsDiva ソフトウェア
BD LSR Fortessa フローサイトメーター
ウシ血清アルブミン	フィッシャーバイオ試薬	BP1605	フローサイトメトリーに使用
フローサイトメトリー Stain Buffer (FCSB)	BD Biosciences 554657		フローサイトメトリー
マウス IgG2b κ アイソタイプコントロール (eBMG2b)、PE、eBioscience	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12473281	アイソタイプコントロールに使用されます。この抗体は、標識型でメーカーから購入しています。
MRS	パウダーBDバイオサイエンス	288130	培地調製およびラクトバチルス・ガッセリの培養に使用されます。
ノロウイルス キャプシド G2 モノクローナル抗体 (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	ノロウイルス GII 抗体.この抗体は非標識型でのみ入手可能であるため、概説されているフローサイトメトリーアッセイで使用する前に蛍光標識する必要があります。このプロトコールでは、PEが選択された蛍光剤でしたが、研究者が使用するフローサイトメーターに最も適した他の蛍光分子を選択することができます。
ノロウイルスGII.4 VLP	Creative Biostructure	CBS-V700	ヒトノロウイルス様粒子、VLPをバキュロウイルス系を用いて作製し、10%グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。著者たちは、VLPの粒子濃度を決定するために、独立したナノサイト追跡分析を実施した。濃度はミリリットルあたり約1011VLPsです。VLPのタンパク質濃度に基づいて、VLP付着アッセイでは細菌あたり約200個の粒子が追加されます。
PBS 10X	Fisher Bioreagents	BP665	使用前に1倍に希釈してください。
SiteClick R-PE 抗体ラベリングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S10467	非標識抗体の標識に使用される標識キットです。
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S271	培地調製に使用
トリプトン	オキソイド	LP0042	培地調製に使用
チューブリボルバー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88881001	ウイルス:細菌付着アッセイに使用。最高速度(40 rpm)に設定します。
酵母エキス	BD Biosciences	212750	地調製に使用