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方法論記事

腎動脈狭窄におけるレニン調節の修正された2つの腎臓1つのクリップマウスモデル

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DOI:

10.3791/61058

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2020年10月26日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

この記事について

サマリー

修正された2腎臓1クリップ(2K1C)ゴールドブラットマウスモデルは、腎動脈狭窄を開始し、レニン発現および腎臓損傷の増加を誘導するためにポリウレタンチューブを使用して開発された。ここでは、再現可能で一貫性のある2K1Cマウスモデルを生成するために、袖口を準備して腎動脈上に配置する詳細な手順について説明します。

要約

腎動脈狭窄は、レニンアンジオテンシンアルドステロン系(RAAS)が過剰に活性化されている冠状動脈または末梢血管疾患の患者における一般的な状態である。この文脈では、RAASにおける律速プロテアーゼであるレニンの発現および放出の増加を刺激する腎動脈の狭窄がある。結果として生じるレニン発現の上昇は、腎血管性高血圧症の既知のドライバーであり、しばしば腎臓損傷および末端器官損傷に関連する。したがって、この状態に対する新規治療法の開発に大きな関心がある。腎動脈狭窄におけるレニン制御の分子および細胞機構は完全には理解されておらず、さらなる研究が必要である。マウスにおいて腎動脈狭窄を誘導するために、改変2腎臓1クリップ(2K1C)ゴールドブラットマウスモデルが開発された。右腎臓を野生型マウスで狭窄し、偽手術マウスを対照として使用した。腎動脈狭窄後、レニン発現と腎障害を判定した。腎臓を採取し、新鮮な皮質を用いてレニンのタンパク質およびmRNA発現を決定した。この動物モデルは再現性があり、腎血管性高血圧症および腎損傷に関与する病態生理学的応答、分子および細胞経路を研究するために使用することができる。

概要

腎動脈狭窄症(RAStenosis)は、65歳以上の人々の約6%および冠状動脈または末梢血管疾患を有する人々の最大40%に影響を及ぼす難治性の問題である1,2。この疾患の現在の治療法は限られています;したがって、RAStenosisによって誘発される腎血管性高血圧症または抵抗性高血圧症を治療するための新しい治療法を開発することが決定的に必要である。レニンアンジオテンシンアルドステロン系(RAAS)は、RAStenosis誘発性高血圧症または腎血管性高血圧症の病因に関与する重要な経路である3,4。ACE阻害剤またはアンジオテンシン受容体遮断薬などのRAASを標的とする既知の治療法は、高血圧を緩和するが、腎不全および高カリウム血症について綿密に調べる必要がある5,6,7。レニンはRAASの律速ステップを触媒する。それはアンジオテンシノーゲンをアンジオテンシンIに変換する。アテローム性動脈硬化症では、プラーク形成はレニン分泌を駆動する腎動脈の狭窄を引き起こし、腎血管性高血圧症および腎臓損傷をもたらす8。多くの研究がヒトにおける腎血管性高血圧症中の酸化ストレスのレベルの増加を報告しており、これは2つの腎臓1クリップ(2K1C)マウスモデルならびに他の高血圧動物モデル2、9、10、11、12、13、14、15、16で裏付けられた.RAStenosis誘発性腎血管性高血圧症におけるレニン発現制御の分子機構は十分に理解されておらず、さらなる研究が必要である。

RAStenosisを確実かつ再現性よく再現性よく再現する実験動物モデルは、新規治療法の開発のためにレニン発現制御の細胞・分子機構を解明する上で重要です。2K1Cマウスモデルは、腎血管性高血圧症の病因を研究するための十分に確立された実験モデルである17、18、19、20。このモデルは、クリップ17、20、21を用いた腎動脈の狭窄によって生成され、したがってレニン発現および高血圧の増加をもたらす腎動脈閉塞を生じる17、19、20、21。しかしながら、動物モデルにおいて腎動脈狭窄を発生させるための段階的な手順を記述する技術報告は入手できない。

従来のU字型銀クリップ、ポリウレタンチューブおよび他のクリップは、腎動脈狭窄を誘発するために腎動脈を狭窄させるために使用されてきた。いくつかの研究は、クリップの設計と材料が、2K1C動物モデルで信頼性が高く再現可能なデータを得るために重要であることを示しています。Lorenzらによると、従来のUデザインの銀クリップを使用すると、高血圧の成功率が低い(40〜60%)21。クリップ設計のために、腎動脈は横方向に押され、いくつかのくびれを引き起こし、腎動脈から取り除かれる可能性が高くなります。銀の可鍛性と延性により、クリップ幅の変更が可能になる場合があります。したがって、マウス間で異なる高血圧レベルを引き起こす。クリップ上の二酸化銀は、血管周囲炎症、内膜増殖、および組織肉芽形成を引き起こし、腎動脈の直径22を変化させる可能性がある。従来のUデザインシルバークリップで得られた高血圧レベルの変動性のために、WarnerらおよびLorenzらは、ラウンダーデザインポリウレタンチューブを使用してマウスの腎動脈狭窄を開始し、2つの腎臓1つのクリップ動物モデルのより信頼性が高く一貫した誘導を生成することに成功した20、21。

この報告では、腎動脈を狭窄させるためにポリウレタンチューブを使用して、マウスにおいて実験的RAStenosisを生成するための外科的プロトコールについて記載する。ポリウレタンラウンドデザインのカフは、マウスに狭窄を発生させるための、より再現性が高く、信頼性が高く、低コストのクリップです。この実験モデルの目的は、腎動脈狭窄症におけるレニン発現制御の分子および細胞機構を研究し、定義することである。我々は、レニン発現および腎障害マーカー好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(N-GAL)を測定することによりRAStenosisマウスモデルの成功を確認した。

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プロトコル

マウスは、米国国立衛生研究所(NIH)のガイドラインおよび米国保健福祉省の実験動物の世話と使用のためのガイドに従って、ヴァンダービルト大学医療センター(VUMC)動物ケア部門で飼育され、世話をされました。すべての動物手順は、実験を開始する前にVUMC機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. 動物の準備と解剖

  1. 手術を開始する前に、加熱パッドの発芽器とウォーターポンプを約30分オンにします。
  2. 長さ0.5mmのポリウレタンチューブを鋭いメスで切断します。袖口を作るために縦に切って円周の0.2mmを外します。
    注:これは、腎動脈狭窄手順の重要な部分であり、極端な精度、細部への注意、忍耐が必要です。一度に数本のポリウレタンチューブを切断してみてください。顕微鏡下でこの手順のすべてを実行します。
  3. 先に進む前に、手術用滅菌手袋と手術用マスクを着用してください。
  4. 6〜8週間のC57BL/6野生型(WT)マウスを使用する。性的な偏見を避けるために、同じ数の雄と雌のマウスを使用してください。
  5. 手術を行う前にマウスの体重を記録する。ポリウレタンチューブで腎動脈狭窄を行うのに理想的な体重は18〜22gです。マウスを優しく扱い、麻酔を注入しながら攪拌しないでください。術前鎮痛薬(ケトフゲン、5mg / kgボディウィーヒト)を投与する。
    注:マウスを収容室から手術室に移す際は、動揺を避けるために、非常に優しさと注意を払ってマウスを運んでください。トロリーの代わりにマウスケージを手に持ち歩くことを強くお勧めします。
  6. 腹腔内(I.P.)注射により、ケタミン(100mg/kg BW)とキシラジン(10mg/kg BW)の混合物でマウスを麻酔する。
  7. 完全に麻酔がかかるまでマウスをケージの中に戻します。マウスが完全に意識を失うまでに約4〜5分かかります。鉗子で尾やつま先をつまんで、マウスが完全に意識不明で手術の準備ができているかどうかを確認します。
  8. マウスをペーパータオルの上に置きます。育毛の反対方向に沿って電気バリカンを使用して側腹部の毛を除去します。手術部位を剃った後、ヨウ素(またはクロルヘキシジン)を含む外科用スクラブで領域を清掃し、続いて70%エタノール(または滅菌生理食塩水)ですすいでください。 これを3回繰り返します。
    注:脱毛手順は、手術手順中の毛髪の干渉や毛髪汚染を避けるために、ある程度の距離で、または好ましくは手術手順ベンチとは異なるベンチで実行する必要があります。
  9. 加熱パッドを滅菌シートで覆います。マウスを手術台に持ってきて、マウスの右側の側面を顕微鏡に向けて滅菌シートの上に置きます。循環水で37°Cの一定のパッド温度を維持します。
  10. すべての手術器具が入った滅菌袋を開けます。解剖顕微鏡と滅菌鋭利はさみを使用して、小さな側面切開(マウスの最後の肋骨である13番目の 胸部肋骨に近い)を椎骨から約0.5cm離します。腰椎に沿って進み、1インチの切開を行います。
  11. 皮膚と筋肉を後ろに引いて腎臓を露出させます。
  12. 腎動脈を隔離するために滅菌綿棒を使用して周囲の脂肪をきれいにし、除去します。湾曲した鉗子を使用して腎動脈から腎神経を単離する。
  13. 偽の手術を行うときは、縫合糸を塗って皮膚を閉じ、閉じた創傷に抗生物質を塗布し、 術後ケアに進みます。 そうでない場合は、次のセクションに進んで動脈を圧迫します。
    注:すべての実験は、外科的処置のコントロールとして偽の動物を持つべきです。偽の動物は、袖口を置かずに腎動脈を露出させる外科的処置を経たマウスからなる。

2.右腎動脈狭窄症

  1. 2つのナイロン縫合糸を右腎動脈の下に置き、ゆるい結び目を作り、次に腎臓と大動脈の分岐の間にほぼ等距離にある主腎動脈の周りに袖口を置きます
  2. ナイロン縫合糸を使用して袖口を閉じます。手術後に縫合糸を失う可能性を避けるために、縫合糸ごとに4つの結び目を作ります。
  3. 簡単な連続縫合糸を適用して筋肉の切開部を閉じる。
  4. 皮膚を閉じるために簡単な中断縫合糸を作ります。
  5. IACUC承認鎮痛剤を投与する。
    注:使用する前にオートクレーブ手術器具を保管してください。一度に複数の手術を行う場合は、使用済みのすべてのツールを滅菌アルコールゲージで拭き取り、すべての手術後15〜30秒間熱い発芽器に入れます。滅菌手袋もマウスごとに交換してください。

3. 術後ケア

  1. マウスをケージに戻し、ケージを半分オン、ハーフオフ、循環水加熱パッドで2〜3時間放置します。ケージの中にゲルダイエット回復食品を追加します。
  2. 鎮痛剤(ケトプロフェン)を翌日腹腔内投与(投与量:5mg / kg BW)する。
  3. 次の2日間マウスを計量する;一部のマウスが体重の20%以上を失った場合は、獣医師に相談し、適切なIACUC認定手順に従って動物を安楽死させる必要があるかどうかを判断してください。
  4. マウスを毎日監視して、発赤、腫れ、痛み、感染を評価します。
  5. IACUCの制度的方針に従って、術後の合併症について獣医の相談を受ける。

4. 組織採取

  1. 外科的処置の3週間後に組織を採取する。各マウスの体重を記録します。
  2. IACUCが承認した手順でマウスを安楽死させる。
  3. マウスを仰臥位の滅菌プラットフォームに置き、解剖する。
  4. 手足を固定して伸ばし、動きを制限します。
  5. マウスに70%エタノールを十分に噴霧する。
  6. 鋭いはさみを使用して腹部と胸部を開くために正中線切開を行います。
  7. 皮膚と腹膜壁を引き戻します。
  8. 慎重に心臓を露出させ、右心室を穿刺し、マウスを放血する。
  9. 鉗子を使用して両方の腎臓を削除します。腎臓はマウスの背中にあります。
    注:両方の腎臓を混ぜないでください。狭窄、偽、および対側腎臓に注意してください。
  10. 腎臓カプセルを取り出し、脂肪からそれらをきれいにし、各腎臓の重量を別々に記録します。
  11. 両腎臓の縦切片を切り取り、パラフィン包埋のために後で処理する4°Cで一晩4%PFAで固定し、in situハイブリダイゼーション(ISH)および免疫組織化学(IHC)を行う。報告されたようにISHおよびIHCプロトコルに従ってください23,24.
  12. 残りの腎臓の皮質を単離し、液体窒素中でフラッシュフリーズしてウェスタンブロットを行う。分析までサンプルを-80°Cで保存します。
  13. 文献23、24に記載されているように、レニン、およびN-GAL発現をウェスタンブロットで定量化する。

5. 統計

  1. 3つ以上の条件を持つ実験には一元配置分散分析または二元配置分散分析を使用し、その後、個々のグループ間の比較のためにボンフェローニ事後検定を使用します。p値が0.05以下であれば有意であると考えてください。ソフトウェア(グラフパッドプリズム8.2など)を使用して、すべての統計分析を実行します。

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結果

腎動脈狭窄は、対側腎臓における発現を抑制しながら、狭窄した腎臓におけるレニン発現を増加させる。狭窄の2つの腎臓1つのクリップ(2K1C)またはGoldblattモデルは、レニン発現の増加および腎臓損傷を誘導する。これは、ヒトにおける片側腎動脈狭窄の最良の代表モデルとして認識されている。

レニンおよびプロレニン(レニンの前駆体)の発現は、イムノブロッティングを用いて測定した。このデータは、狭窄した腎臓では、対側腎臓や偽腎臓と比較してレニンとプロレニンの発現が増加したことを示しており、袖口が腎動脈を狭窄させ、腎灌流の変化を引き起こしていることを示唆しています(図1)。レニン発現の局在化を可視化するために、IHCを実施した。IHCは、クリップされた腎臓におけるレニンの発現の増加を示すイムノブロッティングデータを裏付けた(図2)。また、求心性細動脈に沿った傍糸球体(JG)細胞の動員が狭窄腎臓において見られた(図2...

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ディスカッション

腎動脈狭窄は、二次性または抵抗性高血圧症、および腎臓損傷の重要な原因である1,29。この2つの腎臓1つのクリップ(2K1C)ゴールドブラットモデルは、RAStenosis誘発性腎血管性高血圧症を研究するために採用されている1、17、18、19。様々な動物モデルを用いた多くの先行研究は、腎動脈における狭窄がレニン過剰発現および放出、ならびに腎臓傷害の強力な刺激因子であることを示した18、30、31、32、33、34

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開示事項

金銭的またはその他の利益相反は、著者によって宣言されていません。

謝辞

研究は、NHLBIリサーチサイエンティスト開発助成金(1K01HL135461-01)によってJAGに支援されました。David Carmona-BerrioとIsabel Adarve-Rengifoの技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダイエットジェルクリアH2Oダイエット-ジェル76A手術回復ダイエット
EMC加熱ハードパッドHallowell000A2788B加熱パッドはマウスを暖かく保つために使用されました
エチロンナイロン縫合糸Ethicon662G4-0(1.5メートル法)、この縫合糸は腹膜を閉じるために使用され、皮膚
エチロンナイロン縫合糸Ethicon2815 G8-0(0.4メートル法)、この縫合糸は、動脈を結び、収縮するために袖口を閉じるために使用されました
Germinator 500Braintree Scientific Inc.GER 5287手術間の手術器具の滅菌
ケトプロフェンゾエティスケトフェン鎮痛剤
ポリウレタンブレインツリー サイエンティフィックMRE-025このチューブは、狭窄を開始するために使用されました
ポビドンヨード消毒スワブスティックメドラインMDS093901それは脱毛と皮膚の手術後に適用されました
反射 7 クリップ アプライヤーロボズ 外科用器具株式会社204-1000このクリップ アプライヤーは、1 つ以上の縫合糸が外れた場合にクリップを適用するために使用されました
滅菌タオル ドレープダイナレックス4410手術中にマウスのベッドシーツとして使用されました
トリプル抗生物質軟膏Medi-First22312
ウォーターポンプストライカーT/ポンプ プロフェッショナル手術中および手術後にマウスを暖かく保つために、加熱ハードパッドで水を温めて循環させるために使用されます

参考文献

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