修正された2腎臓1クリップ(2K1C)ゴールドブラットマウスモデルは、腎動脈狭窄を開始し、レニン発現および腎臓損傷の増加を誘導するためにポリウレタンチューブを使用して開発された。ここでは、再現可能で一貫性のある2K1Cマウスモデルを生成するために、袖口を準備して腎動脈上に配置する詳細な手順について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
腎動脈狭窄は、レニンアンジオテンシンアルドステロン系(RAAS)が過剰に活性化されている冠状動脈または末梢血管疾患の患者における一般的な状態である。この文脈では、RAASにおける律速プロテアーゼであるレニンの発現および放出の増加を刺激する腎動脈の狭窄がある。結果として生じるレニン発現の上昇は、腎血管性高血圧症の既知のドライバーであり、しばしば腎臓損傷および末端器官損傷に関連する。したがって、この状態に対する新規治療法の開発に大きな関心がある。腎動脈狭窄におけるレニン制御の分子および細胞機構は完全には理解されておらず、さらなる研究が必要である。マウスにおいて腎動脈狭窄を誘導するために、改変2腎臓1クリップ(2K1C)ゴールドブラットマウスモデルが開発された。右腎臓を野生型マウスで狭窄し、偽手術マウスを対照として使用した。腎動脈狭窄後、レニン発現と腎障害を判定した。腎臓を採取し、新鮮な皮質を用いてレニンのタンパク質およびmRNA発現を決定した。この動物モデルは再現性があり、腎血管性高血圧症および腎損傷に関与する病態生理学的応答、分子および細胞経路を研究するために使用することができる。
概要
腎動脈狭窄症(RAStenosis)は、65歳以上の人々の約6%および冠状動脈または末梢血管疾患を有する人々の最大40%に影響を及ぼす難治性の問題である1,2。この疾患の現在の治療法は限られています;したがって、RAStenosisによって誘発される腎血管性高血圧症または抵抗性高血圧症を治療するための新しい治療法を開発することが決定的に必要である。レニンアンジオテンシンアルドステロン系(RAAS)は、RAStenosis誘発性高血圧症または腎血管性高血圧症の病因に関与する重要な経路である3,4。ACE阻害剤またはアンジオテンシン受容体遮断薬などのRAASを標的とする既知の治療法は、高血圧を緩和するが、腎不全および高カリウム血症について綿密に調べる必要がある5,6,7。レニンはRAASの律速ステップを触媒する。それはアンジオテンシノーゲンをアンジオテンシンIに変換する。アテローム性動脈硬化症では、プラーク形成はレニン分泌を駆動する腎動脈の狭窄を引き起こし、腎血管性高血圧症および腎臓損傷をもたらす
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プロトコル
マウスは、米国国立衛生研究所(NIH)のガイドラインおよび米国保健福祉省の実験動物の世話と使用のためのガイドに従って、ヴァンダービルト大学医療センター(VUMC)動物ケア部門で飼育され、世話をされました。すべての動物手順は、実験を開始する前にVUMC機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 動物の準備と解剖
- 手術を開始する前に、加熱パッドの発芽器とウォーターポンプを約30分オンにします。
- 長さ0.5mmのポリウレタンチューブを鋭いメスで切断します。袖口を作るために縦に切って円周の0.2mmを外します。
注:これは、腎動脈狭窄手順の重要な部分であり、極端な精度、細部への注意、忍耐が必要です。一度に数本のポリウレタンチューブを切断してみてください。顕微鏡下でこの手順のすべてを実行します。 - 先に進む前に、手術用滅菌手袋と手術用マスクを着用してください。
- 6〜8週間のC57BL/6野生型(WT)マウスを使用する。性的な偏見を避けるために、同じ数の雄と雌のマウスを使用してください。
- 手術を行う前にマウスの体重を記録する。ポリウレタンチューブで腎動脈狭窄を行うのに理想的な体重は18〜22gです。マウスを優しく扱い、麻酔を注入しながら攪拌しないでください。術前鎮痛薬(ケトフゲン、5mg / kgボディウィーヒト)を投与する。
注:マウスを収容室から手術室に移す際....
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結果
腎動脈狭窄は、対側腎臓における発現を抑制しながら、狭窄した腎臓におけるレニン発現を増加させる。狭窄の2つの腎臓1つのクリップ(2K1C)またはGoldblattモデルは、レニン発現の増加および腎臓損傷を誘導する。これは、ヒトにおける片側腎動脈狭窄の最良の代表モデルとして認識されている。
レニンおよびプロレニン(レニンの前駆体)の発現は、イムノブロッティングを用いて測定した。このデータは、狭窄した腎臓では、対側腎臓や偽腎臓と比較してレニンとプロレニンの発現が増加したことを示しており、袖口が腎動脈を狭窄させ、腎灌流の変化を引き起こしていることを示唆しています(図1)。レニン発現の局在化を可視化するために、IHCを実施した。IHCは、クリップされた腎臓におけるレニンの発現の増加を示すイムノブロッティングデータを裏付けた(図2)。また、求心性細動脈に沿った傍糸球体(JG)細胞の動員が狭窄腎臓において見られた(図2.......
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ディスカッション
腎動脈狭窄は、二次性または抵抗性高血圧症、および腎臓損傷の重要な原因である1,29。この2つの腎臓1つのクリップ(2K1C)ゴールドブラットモデルは、RAStenosis誘発性腎血管性高血圧症を研究するために採用されている1、17、18、19。様々な動物モデルを用いた多くの先行研究は、腎動脈における狭窄がレニン過剰発現および放出、ならびに腎臓傷害の強力な刺激因子であることを示した18、30、31、32、33、34
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開示事項
金銭的またはその他の利益相反は、著者によって宣言されていません。
謝辞
研究は、NHLBIリサーチサイエンティスト開発助成金(1K01HL135461-01)によってJAGに支援されました。David Carmona-BerrioとIsabel Adarve-Rengifoの技術支援に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ダイエットジェル | クリアH2O | ダイエット-ジェル76A | 手術回復ダイエット |
| EMC加熱ハードパッド | Hallowell | 000A2788B | 加熱パッドはマウスを暖かく保つために使用されました |
| エチロンナイロン縫合糸 | Ethicon | 662G | 4-0(1.5メートル法)、この縫合糸は腹膜を閉じるために使用され、皮膚 |
| エチロンナイロン縫合糸 | Ethicon | 2815 G | 8-0(0.4メートル法)、この縫合糸は、動脈を結び、収縮するために袖口を閉じるために使用されました |
| Germinator 500 | Braintree Scientific Inc. | GER 5287 | 手術間の手術器具の滅菌 |
| ケトプロフェン | ゾエティス | ケトフェン | 鎮痛剤 |
| ポリウレタン | ブレインツリー サイエンティフィック | MRE-025 | このチューブは、狭窄を開始するために使用されました |
| ポビドンヨード消毒スワブスティック | メドライン | MDS093901 | それは脱毛と皮膚の手術後に適用されました |
| 反射 7 クリップ アプライヤー | ロボズ 外科用器具株式会社 | 204-1000 | このクリップ アプライヤーは、1 つ以上の縫合糸が外れた場合にクリップを適用するために使用されました |
| 滅菌タオル ドレープ | ダイナレックス | 4410 | 手術中にマウスのベッドシーツとして使用されました |
| トリプル抗生物質軟膏 | Medi-First | 22312 | |
| ウォーターポンプ | ストライカーT | /ポンプ プロフェッショナル | 手術中および手術後にマウスを暖かく保つために、加熱ハードパッドで水を温めて循環させるために使用されます |
参考文献
- Kashyap, S., et al. Blockade of CCR2 reduces macrophage influx and development of chronic renal damage in murine renovascular hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (5), 372-384 (2016).
- Wang, W., et al.
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