本手法はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)RNAサンプルから得ることができる配列データの質と量を改善するステップを説明する。我々は、FFPE-RNAサンプルの品質をより正確に評価し、シーケンシングライブラリを準備し、FFPE-RNAサンプルからのデータを分析するための方法論を説明する。
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方法論記事
分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
RNAシーケンシング(RNA-seq)による遺伝子発現解析により、臨床サンプルに対する独自の洞察が可能となり、さまざまな疾患の基礎や抵抗性や感受性のメカニズムを機械化的に理解する可能性があります。しかし、臨床検体における組織形態を保存する最も一般的な方法を表すFFPE組織は、遺伝子発現プロファイリング分析の最良の情報源ではありません。このようなサンプルから得られたRNAは、しばしば分解され、断片化され、化学的に修飾され、最適ではないシーケンシングライブラリにつながります。さらに、これらは、遺伝子発現解析や変異発見に信頼性がない可能性のある低品質のシーケンスデータを生成します。FFPEサンプルを最大限に活用し、低品質のサンプルから可能な限り最良のデータを得るためには、実験計画、シーケンスライブラリの準備、データ分析中に、一定の予防措置を講じる必要があります。これには、正確なサンプル品質管理(QC)、シーケンスライブラリ生成中のさまざまなステップに最適な方法の特定、および慎重なライブラリQCのための適切なメトリックの使用が含まれます。さらに、RNA-seqデータのアーチファクトを特定し、汚染や低品質の読み取り、遺伝子被覆の均一性を評価し、生物学的複製物間で遺伝子発現プロファイルの再現性を測定するためには、正しいソフトウェアツールと配列データ解析パラメータを適用することが重要です。これらのステップは非常に異質なRNAサンプルのプロファイリングのための高精度および再現性を保障できる。ここでは、サンプルQC、ライブラリ調製およびQC、シーケンシング、およびFFPE-RNA組織から得られるような低品質RNAから得られる有用なデータの量を増加させるデータ分析のための様々なステップを説明します。
概要
次世代シーケンシングアプローチを利用することで、さまざまな種類のサンプルから豊富な情報を収集することができました。ただし、古くて保存が不十分なサンプルは、一般的に使用されるシーケンスデータの生成方法では動作しないため、確立されたプロトコルを変更する必要が生じることが多い。FFPE,組織は、臨床検体1、2、32に広く利用されてきたこのようなサンプル型を表す。13FFPE保存は組織形態を維持するが、FFPE組織の核酸は通常、広範囲の損傷および分解を示し、様々な障害の根底にある分子メカニズムに関する重要な洞察につながる可能性のあるゲノム情報を取り出すことを困難にする。
RNAシーケンシングによって生成される遺伝子発現データは、疾患や抵抗のメカニズムの研究に役立ち、DNA変異解析を補完することがよくあります。しかし、RNAは分解の影響を受けやすく、FFPE組織から正確な遺伝子発現データを生成することがより困難になります。さらに、シーケンシングの幅広い可用性と手頃な価格が比較的最近であるため、古い標本はRNAの完全性を維持するために必要な条件で保存されなかったことが多かった。FFPEサンプルの問題のいくつかは、パラフィンに埋め込むことによるRNAの分解、シーケンシングに必要な酵素プロセスに対する断片化....
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プロトコル
1. RNA量と品質評価
- 事前定義された基準に従ってFFPEサンプルを選択し、適切な方法(例えば、FFPE-核酸抽出キット、材料表)を用いてRNAを抽出する。
注:FFPE-RNA抽出には、非常に少ない組織で動作し、良質のRNA12、13、14を抽出できる新しいマイクロディスセクション法を含む、13,14いくつかの異なる方法があります。 - RNAの完全性を全ての段階で維持するために、細心の注意を払う必要があります。これには、RNaseフリー脱イオン水の使用、RNaseフリーのプラスチック製品の使用、およびRNase除染試薬でFFPEブロックに接触するすべての機器の洗浄が含まれます。
- RNAは、取り扱い中の分解を最小限に抑えるために特に指定しない限り、常に慎重に取り扱い、氷の中に保管する必要があります。
- 十分な材料が利用可能な場合は、FFPEブロック内の複数の領域からRNAを抽出し、できるだけ多くのサンプルから生物学的複製を生成します。十分なRNA収率を有するサンプルの中には、抽出したRNAを2つに分割して、技術的な複製として処理します。
- 可能であれば、少量のサンプルをQC(すなわちQCアリコート)用抽出後に別々....
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結果
上記の方法論は、7~32年間のさまざまな条件下で保存されていた67個のFFPEサンプルに適用されました(サンプル保存時間の中央値は17.5年でした)。ここで示したデータセットと解析結果は、Zhaoら11で既に説明および公開されています。先に説明したサンプル品質(例えば図2のトレース)をチェックする上で、DV100は、高分解RNAサンプルに対する小さな断片サイズの割合を正確に測定する方が感度が高いため、DV200よりも有用であることが判明した。
与えられたサンプルセットでは、サンプルの10%未満(67の7)は、イルミナ34が推奨するDV200カット30%を上回った。サンプルの約26%(67の19)はDV100 > 60%(すなわち、良好なシーケンスデータを生成する可能性が高い)、40%(67の27)はDV100の40.......
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ディスカッション
ここで説明する方法は、FFPE-RNAサンプルから良好な配列データを得るために必要な主なステップを概説する。この方法で考慮すべき主なポイントは、(1)サンプルの取り扱いおよび凍結および解凍のサイクルを最小限に抑えることによって、抽出後にRNAを可能な限り保存することを確認することです。別々のQCアリコートは非常に便利です。(2) 所定のサンプル・セットに最適な QC メトリックを使用します。RIN 値および DV200は、劣化サンプルの場合には役に立たないことが多く、DV100は所定のサンプル セットの品質を評価するメトリックとなる場合があります。(3) より劣化したサンプルの場合は、高いサンプル入力を使用するのが最適です。入力量が高いほど、最終的なライブラリの多様性が向上し、重複が少なくなり、データ品質が向上します。酵素プロセスに対する高い分解および屈折性のためにFFPE-RNAサンプルのすべてのRNAが使用できるわけではないため、これらの効果は新鮮な凍結RNAと比較してFFPE-RNAでより顕著です。(4) オリゴdTまたは特定の配列をプライマーとして使用するのとは対照的に、逆転写ステップ.......
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開示事項
この研究は、国立がん研究所(NCI)、国立衛生研究所(NIH)によって資金提供されました。レイドスバイオメディカルリサーチ社は、NIHが全額出資するフレデリック国立がん研究研究所の運営および技術サポート請負業者です。いくつかの著者(YZ、MM、KT、YL、JS、BT)はレイドスバイオメディカルリサーチ社と提携していますが、著者の給与や研究資料を含む国立がん研究所から全額出資されています。Leidosバイオメディカルリサーチ社は、著者(YZ、MM、KT、YL、JS、BT)または研究のための材料に給与を提供しておらず、研究の設計、データ収集、分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持っていませんでした。
謝辞
ダニエル・キャリック博士(国立がん研究所がん対策人口科学部門)は、特にこの研究を始め、サンプルを提供し、データ分析中に役立つ提案をしてくれたことに感謝しています。フレデリック国立がん研究研究所のCCRシーケンシング施設のメンバー全員が、サンプル調製とシーケンシング中の支援、特にサンプルQC、オクサナドイツ語の図書館QC、テクサイダーを運営するためのタチアナ・スミルノワの支援に心から感謝します。また、シーケンシング・ファシリティ・バイオインフォマティクス・グループのツァイ・ウェイ・シェンとアシュリー・ウォルトンが、データ分析とRNA-seqパイプラインの実装を支援してくれたことに感謝します。また、RNaseq分析パイプラインおよびベストプラクティス開発に関する支援に対するCCBRおよびNCBRに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2100 バイオアナライザー | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 キット | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent 高感度 DNA キット | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano キット | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE キット | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 タッチシステム | バイオ・ラッド | 1855195 | |
| ライブラリー定量キット v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEB次 rRNA 枯渇キット (ヒト/マウス/ラット) | ニューイングランドBiolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 シーケンシングシステム | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 システムガイド: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | ||
| 20024907 10X Genomics マグネティックセパレーター | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | の E 20024907 | |
| 緩衝液カートリッジと試薬カートリッジ | イルミナ | 20024907 | |
| 水酸化ナトリウム溶液 (0.2N) | ミリポアシグマ | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL 緩衝液 1.0M, pH 7.0 | フィッシャーサイエンティフィック | 50-151-871 |
参考文献
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
- Hedegaard, J., et al.
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再版と許可
