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方法論記事

水生生態系における微生物行動を調べるSitu chemotaxisアッセイで

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DOI:

10.3791/61062

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2020年5月5日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zürich, 2Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 3School of Oceanography, University of Washington

この記事について

サマリー

ここで提示される、環境中の微生物行動の研究を直接可能にする最近開発されたマイクロ流体装置であるin situ chemotaxisアッセイのプロトコルです。

要約

運動性や動性(細胞が化学勾配に応答して動きを変える能力)などの微生物行動は、細菌および古細菌領域に広がっています。Chemotaxisは、異機種環境において、リソース獲得のメリットを大きく引き出すことができます。また、生物地球化学サイクリングなどの共生相互作用、疾患、グローバルプロセスにおいても重要な役割を果たしています。しかし、現在の技術は、研究を実験室に限定し、現場で容易に適用できるものではありません。ここで提示されるのは、自然環境で直接微生物の走気軸の強い調合を可能にする装置であるin situ chemotaxisアッセイ(ISCA)の展開のためのステップバイステップのプロトコルです。ISCAは、目的の化学物質をロードすることができる20の井戸アレイからなるマイクロ流体装置です。水性環境に展開すると、化学物質が井戸から拡散し、微生物が感知し、気胸を介して井戸に泳ぐことによって応答する濃度勾配を作成します。次に、(1)フローサイトメトリーを介して特定の化合物に対する化学戦術応答の強度をサンプリングし、定量化することができ、(2)分離および培養応答性微生物、および(3)分子技術を通じて応答集団の同一性およびゲノム電位を特徴付ける。ISCAは、海洋、淡水、土壌環境など、水性の段階を持つあらゆるシステムに導入できる柔軟なプラットフォームです。

概要

多様な微生物は運動性と走性を利用して、パッチ状の栄養環境を利用したり、宿主を見つけたり、有害な条件11、2、32,3を避けたりします。これらの微生物行動は、化学変換4の速度に影響を与え、陸上、淡水、海洋生態系22、5にわたる共生パートナーシップを促進する可能性がある。

Chemotaxisは、過去60年間の実験室条件下で広範囲に研究されてきた6.この化学式を研究する第1の定量法は、毛細管アッセイ、細菌6の懸濁液に浸漬した推定化学誘引剤で満たされた毛細管チューブを含む。チューブから化学物質の拡散は化学的勾配を作成し、化学戦術細菌は、チューブ7に移行することによって、この勾配に応答します。毛,細管アッセイの開発以来、現在でも広く使用されているが、他の多くの技術は、マイクロ流体8、9、109の使用を含む最新の、ますます制御された物理的/化学的条件下8での遠隔性度を研究するために開発されてきた。10

マイクロ流体は、高速ビデオ顕微鏡と共に、慎重に制御された勾配に応答して単一細胞の挙動を追跡することを可能にする。これらの技術は、我々の化学軸に対する理解を大幅に向上させましたが、実験室での使用に制限されており、環境システムにおける現場展開に容易に変換されません。その結果、細菌の自然界が自然生態系内で化学運動を使用する能力は調べられていない。したがって、化学体系の潜在的な生態学的重要性に関する現在の理解は、人工実験室の状態と限られた数の実験室で培養された細菌分離株に偏っている。最近開発された ISCA はこれらの制限を克服します11.

ISCAは毛細管アッセイの一般原則に基づいています。しかし、現代の微細加工技術を利用して、自然環境に関心のある化合物に向けて、走性を定量化するための高度に複製された容易に展開可能な実験プラットフォームを提供します。また、直接単離または分子技術による化学戦術微生物の同定と特性解析も可能です。最初の作業装置はガラスとPDMS11で自作され、構築されたが、最新の射出成形版はポリカーボネートで構成され、高度に標準化された製造手順を使用する(最新バージョンのデバイスに関心を持つため、対応する著者に連絡することができる)。

ISCAはクレジットカードサイズで、5 x 4ウェルアレイに分布する20個の井戸で構成され、それぞれが小さなポート(直径800μm)で外部水生環境にリンクされています。 図 1)。井戸に積み込まれた推定化学誘引物質は、ポートを介して環境に拡散し、化学戦術微生物は港を通って井戸に泳ぐことによって反応します。自然環境における ISCA 実験の結果に影響を与える要因が多くあるため、このステップバイ ステップ のプロトコルは、新しいユーザーが潜在的な障害を克服し、効果的な展開を促進するのに役立ちます。

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プロトコル

結果を最適化するために、フィールド実験の前にセクション1を実行することをお勧めします。

1. 研究室の最適化

注: 最適化手順で説明されているボリュームは、単一の ISCA (20 個のウェルで構成される) に十分です。

  1. 目的の化学物質の調製
    注: 各化学誘引剤の最適濃度は、多くの場合、現場展開前に実験室条件下で決定する必要があります。化学物質濃度フィールドは、ソース(ISCAウェル)からの距離に伴って大きさが減少し、環境中の微生物が経験する濃度が装置内に存在する濃度よりも低くなることを意味します。ISCAで使用する最適濃度は、化学誘引剤の拡散速度に依存します。ウェル内の濃度が低すぎる場合(微生物の検出限界に近い)、正の走性は認められない。逆に、井戸内の濃度が高すぎると、直近の環境でも濃度が高くなり、内部ではなくISCA井戸の上に微生物の蓄積が起こります。したがって、希釈系列は、フィールド展開のための最適濃度を決定するために、各化合物の実験室条件で行われるべきである。理想的には、濃度範囲も実験室の結果を確認するために現場でテストする必要があります。
    1. 適切な塩濃度を含む適切な培地(例えば、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]または人工海水)の2.5Lを調製する。ペリスティックポンプまたは真空ポンプとオートクレーブを使用して、0.2 μmフィルターで媒体をフィルター処理します。
    2. 滅菌培地の1 mLに10mMの化学誘引剤の溶液を調製する。0.2 μmのシリンジフィルターで化学誘引液をフィルターし、粒子と潜在的な汚染物質を除去します。
      注:理想的には、化学誘引剤以外の有機化合物は、最終的な溶液に存在すべきではありません。
  2. 希釈系列による濃度範囲
    1. ろ過された化学誘起剤のストック溶液を10 mMから100 μMまで、シリーズで希釈します。
      注:テストした濃度ごとに、少なくとも0.7 mLの最終容積が必要です。
  3. ISCA のロード
    1. フィルター処理された化学誘引剤で1mLの注射器を充填し、27Gシリンジに接続します。ポートを上向きにしてISCAを保持し、小さな液滴がポートの上に現れるまでゆっくりと物質を注入します。
      注:1)各希釈または物質は、クロス汚染を防ぐために、別の注射器と針を注入する必要があります。2)この小さな液滴は、ポート内に気泡が閉じ込められず、微生物がポートを通過する能力を損なう可能性があるため、重要です。3)さらなる分析のための十分な最小量を提供するために、物質または濃度(5つの井戸)ごとに行全体を埋めることをお勧めします。4) ISCA 1 行につき 1 行は、負のコントロールとして機能し、微生物が中断されるフィルター処理された媒体で満たされる必要があります。この治療は、ISCAウェルへの微生物によるランダム運動の効果を説明し、化学誘引剤を含む治療を正常化するために使用されるべきである。
  4. 研究室での展開
    1. 一晩、1%の海洋ブロス(海洋細菌の場合)または1%リソジニーブロス(LB、淡水細菌)で濃縮された5mL培養物をインキュベートします。
      注:モタイル細菌分離物または天然細菌群集は実験室の展開のために使用することができる。
    2. 培養液を室温(RT)および180rpmで12時間培養する。12時間後、顕微鏡下で直接観察して微生物群集が動性であることを確認してください。
    3. 10分間1,500xgでg培養をスピンダウンし、適切な培地(例えば、ろ過海水、淡水を濾過した)の150mLで1/100を再懸濁する。
    4. 200 mL容量トレイの平らな表面に両面粘着テープを2枚置きます(1 mLチップボックスの蓋はこの目的に最適な寸法を持ち、簡単にオートクレーブすることができます)。ISCA を 1 つ上に置き、テープにしっかりと接続するようにします。50 mL血清ピペットを使用して、徐々にバクテリア溶液で展開トレイを充填します。
      メモ:ISCAが約1〜2cmの液体の下に沈むまでトレイを満たします。複数のトレイを使用する場合は、すべて同じボリュームを使用します。
    5. ISCAは、細菌性の化学軸を可能にするために1時間インキュベートする。1時間後、50 mL血清ピペットで非常に穏やかに培地を取り出し、乱流を最小限に抑えます。
    6. 上面に触れることなく、展開トレイから ISCA を取り出します。ピペットと使い捨てワイパーを使用して、ISCA表面に残った液体を取り除きます。
      注:圧力の変化は、井戸に外環境から細菌を除去または追加し、それによってウェル内の細菌密度と組成をバイアスすることができるので、このプロセス中にポートに触れないようにすることが重要です。
  5. サンプルの検索
    1. ポートを下向きにしてISCAを保持し、1 mLシリンジに取り付けられた滅菌27Gシリンジ針を使用してウェルの体積を取り出します。
      注:各行(同じ物質を含む場合)をプールして、約550 μLの作業サンプルを提供することができます。このサンプルは、必要なダウンストリームアプリケーションに応じて、その後別のチューブにアリクォートすることができます。
    2. フローサイトメトリー12でサンプルを分析することにより、各化学誘引剤濃度に引き付けられる細菌の数を決定する。後続のフィールド展開で、走気性を最大化する化学誘引剤の濃度を選択します。

2. フィールド展開の準備

注: フロー減衰エンクロージャ(セクション 2)の材料の準備と構築は、展開前に行う必要があります。

  1. 材料の準備
    1. 表 1に示すすべての資料を準備します。
      注: 1 つの ISCA に対して材料数量が提供されます。
  2. フロー減衰エンクロージャの構築と準備
    注: フロー減衰エンクロージャは、不要な乱流を最小限に抑え、ISCA から発生する化学勾配の確立を妨げる原因となります。
    1. 3 mm アクリルシートからレーザーカッターで配置エンクロージャのピースをカットします。
      注: この作品のファイルは、次のリンクを使用して見つけることができます Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments。
    2. 図2に示すように、アクリル接着剤を使用してレーザーカットピースを組み立てます。
      注:注意して作品を組み立てます。穴や位置のずれは、配置時にリークを発生させる可能性があり、データ品質に直接影響します。
    3. 組み立てたエンクロージャを一晩乾燥させます。
    4. 脱イオン水でエンクロージャを洗浄します。
    5. 脱イオン水をエンクロージャに注ぎ込み、漏れの可能性を特定します。アクリル接着剤を追加して潜在的な漏れ関節を修正し、ステップ2.2.3-2.2.5を繰り返します。
    6. ねじ糸を、ISCAを固定するために使用するアクリル部分に切り込みます。これは、取付けねじに一致する直径とピッチを備えたタップを使用して達成することができます。
      1. まず、タップレンチにタップを貼り付け、ベンチトップバイスでタップするアクリル部分を固定します。最良の結果を得るには、アクリル部分ができるだけレベルであることを確認してください。タップがアクリル部分に対して垂直であることを確認し、タップレンチを(時計回りに)回し始め、タップに軽い圧力をかける。
      2. アクリルピースで数回のフル回転の後、タップからアクリルをクリアするために回転の4分の1のタップ(反時計回り)の回転を逆にします。アクリル部分の奥行き全体がタップされるまで、このプロセスを繰り返します。
      3. 最後に、タップを取り外し(反時計回りに回す)、ねじを使ってねじをテストします。

3. フィールド内の手順

  1. 水のろ過
    1. 実験を開始する準備ができたら、フィールドサイトから水を収集します。0.2 μmのシリンジフィルター(50 mLシリンジ付き)を通して、50 mLの円錐形遠心分離管に5mLの水をフィルターします。
      注:ISCAのすべての井戸を満たすために約3 mLのろ過水が必要です。しかし、4倍の濾過プロセス中の損失を考慮して1)1)フィルター1デバイスあたり5mL、および2)濾液のアリコートをフローサイトメトリーと分子手順の両方の陰性対照として保存することが推奨されます。
    2. 濾液を0.2 μm親水性GPフィルターカートリッジ(同じ1回、両方の時間を使用)で2回濾過し、新しい50 mL円錐形遠心管に新しい50 mLシリンジを付けます。0.02 μmのシリンジフィルター(新しい50 mLシリンジ)を通して濾過液を新しい50 mL円錐形チューブにフィルターします。
      注:この4倍のろ過は、ほぼすべての微生物と粒子を水から取り除く必要があります。使用するまで、最終的な濾過を熱源から遠ざけてください。この水は、ISCAで使用されるすべての化学物質を再懸濁するために使用され、配備現場の水と同じ温度に維持する必要があります。ISCAウェルと外部環境の温度差によって引き起こされる対流が発生する可能性があります。
    3. 濾液のアリコートを使用して、関心のあるすべての化学誘引物質(典型的には乾燥)を15 mL円錐形遠心分離管内の所望の濃度に再懸濁させる。
    4. 再懸濁された化学誘引物質を0.2 μmのシリンジフィルターで0.2 μmのシリンジフィルターで無菌15 mL円錐形遠心分離チューブにフィルターして、不要な粒子または水不溶性化合物を除去します(抽出物を使用する場合)。
      注: パーティクルがフィルターを通過しないように、フィルターを緩やかにフィルターします。フィールドサイトから超濾過水中の化学誘引物質を再中断し、他の溶液に可溶化しないことが重要です。フィールドサイトからの水を使用すると、(1)密度駆動流を防ぐためにバルク環境水と同じ井戸内の塩濃度を得るために必要であり、(2)背景栄養レベルがウェルの内外で等しいことを保証する。
  2. ISCA充填
    1. セクション 1.3 を実行して ISCA を埋めます。
      注:物質1個につき1行(5ウェル)(すなわち、ISCAあたり3つの異なる物質と1つの超濾過海水制御)を埋めることをお勧めします。
  3. フィールドでの展開
    1. ISCA (図 3A)をエンクロージャーのピース 9 にねじ込みます (図 2Kおよび 図3B)。
      注: 上で説明したフロー・ダンピング・エンクロージャーには、2 つの ISCA を並べて配置することも、その中心に配置された 1 つの ISCA を含めることができます。
    2. エンクロージャを閉じて(図3C)、粘着テープで密封します(図3D)。
      注:しわは完璧なシールを確保するために避ける必要があります。最初にすべての側面をシールし、次に(第2のステップで)サイドホールを密封し、サンプリングの終わりにエンクロージャから水を排出するために使用されます。上部と下部の穴を密閉しないでください。密度主導の流れが化学誘引物質を含む井戸で起こり得るため、ISCAを逆さまにしないでください。
    3. エンクロージャは展開中は安定している必要があるため、バンジーコードを使用して人工構造物(ポンツーン、はしごなど)に取り付けることをお勧めします。
      注:エンクロージャは、水に浸す前にバンジーコードを使用して展開アーム(ここでは垂直プラットフォームを備えた修正クランプ)に取り付けることができます。あるいは、エンクロージャは浅い基質の小さい重量と満たされ、固定することができる。遠洋での展開を意図している場合、エンクロージャは片側にブイを持ち、もう一方の側に飛び込み重量を持つネットに取り付けることができます。
    4. 充填を開始するには、エンクロージャを完全に水没させます。充填中は、エンクロージャをしっかりと保持し、内部の過度の水の動きを防ぎます。水のレベルがエンクロージャの上部に達したら、空気が内部に閉じ込められないようにしてください。
      注:いくつかの気泡が閉じ込められている場合は、気泡が逃げるのを可能にするベント穴を上向きにエンクロージャを緩やかに傾けます。
    5. 完全に満杯になったら、シリコンまたはゴムから作ることができる2つのプラグで底と上の穴を密封するか、または20 μLピペットチップの先端を密封することによって(図4)。
      注: この手順では、サンプリング中にエンクロージャ内のフローを防止します。
    6. ISCA は 1 ~ 3 時間のサンプリング用にそのままにしておきます。
      注:理想的な展開時間は、主に水の温度と細菌群の倍増時間によって決まります。水温が20°Cを超える場合、1.5~2.0時間後に化学誘引物質を含むウェルで細胞分裂が起こる可能性があるため、ISCAを1時間以上配備することはお勧めできません。しかし、ISCA実験の前に、積み込まれた化学物質で自然界を修正し、時間をかけて細胞の数を定量化することで、最適な展開時間をテストすることができます。
    7. 水からエンクロージャを取り外します。容器の上に置き、水をエンクロージャから排出できるようにします。
    8. 粘着テープの上部を前面の穴から非常に優しく取り除きます。
      注: エンクロージャーを離れる水の流れは、滴下速度でなければなりません。エンクロージャの上部から下部まで、一度に 1 つの穴を進めます。エンクロージャを完全に排出するには約10~15分かかります。
    9. 水線が ISCA の上部の下を通過したら、底栓を取り外し、残りの水を排出します。
    10. ISCA がまだエンクロージャに取り付けられている間、1 mL ピペットで ISCA の上に閉じ込められた水を慎重に取り除きます。
    11. 上面に触れることなくISCAを取り外し、使い捨てワイプを使用して表面に残っている液体を取り除きます。
      注:圧力の結果的な変化は、井戸にバルク細菌を除去または追加し、細菌の数を偏らさせることができるので、このプロセス中にポートに触れないようにすることが重要です。
    12. ステップ 1.5.1 を繰り返して、ISCA からサンプルを取得します。

4. ダウンストリームアプリケーション

メモ:ボリュームは550 μLサンプル(ISCAの1行)に基づいて与えられます。

  1. フローサイトメトリーが各誘引体に対して化学量を定量化するために、グルタルアルデヒド(2%最終濃度)で100μLのウェルコンテンツを固定します。
    注:氷の上(または4°C)に保存し、同じ日にサンプルを分析してください。あるいは、同じ日に分析が不可能な場合、サンプルは固定後の液体窒素でフラッシュ凍結することができる。フローサイトメトリーは、ISCAウェル内の細胞数を定量化する方法として推奨されています。
  2. スナップ凍結 300 μL のウェル含有量は、その後の DNA 抽出および分析11.
    注:分析まで-80 °Cでサンプルを保管してください。
  3. 90 μL のウェルコンテンツを 10 μL の TE-グリセロール バッファーに加え、単細胞ゲノミクス13のサンプルをスナップフリーズします。
  4. 細菌分離のために所望の媒体を含む寒天プレートに10-20 μLを広げる。

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結果

このセクションでは、土壌細菌14を誘致することが知られているアミノ酸であるグルタミンの濃度範囲に対する海洋微生物の化学学的応答を試験するためにISCAを用いた検査結果を提示する。実験室試験で最も強い化学戦術反応を引き出したグルタミンの濃度は、海洋環境における化学式アッセイを行うために使用された。

実験室試験を行うために、オーストラリアのシドニーの沿岸水からサンプリングされた海水群は、ステップ1.4で説明したように、単純な栄養改正4を通じて運動性細胞のために濃縮された。グルタミンは、10mMから100μMまでの最終濃度を得るために、超濾過された海水中で連続的に希釈され、5つのISCA複製物を同時に導入し、それぞれ3つの異なるグルタミン濃度(1列につき1つの濃度)とろ過された海水制御列を含んでいた。1時間の展開の後、各ISCA行(同じグルタミン濃度を含む)の内容物をプールし、約550μLの作業サンプルを提供した。この体積はグルタルアルデヒド(2%最終濃度)で固定し、応答菌数をフローサイトメト...

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ディスカッション

水生微生物の規模では、環境は均質から遠く離れており、多くの場合、微生物群集1、15,15を構成する物理的/化学的勾配によって特徴付けられる。また、行動を用いるための運動性微生物の能力(すなわち、走性)は、これらの異種微小環境1内での採餌を容易にする。環境中で直接走性を研究することは、重要な相互特異的相互作用と化学的好みを特定する可能性があり、これは生地球化学的プロセスへの特定の微生物の貢献を解き放つのに役立ちます。提示されたプロトコルは、ISCAを環境11に展開し、その中での走性に関する再現性のある研究の取得を容易にする。

ISCAを用いて、グルタミンは実験室の条件および分野の両方で肯定的な化学戦術応答を引き出す。現場でのグルタミンのISCA導入は、実験室よりも低い化学戦術応答をもたらす(図5)。実験室とフィール...

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開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、ゴードンとベティムーア財団海洋微生物学イニシアチブによって、J.R.S.とR.S.にGBMF3801を付与することによって部分的に資金提供されました。 R.S.に対する調査官賞(GBMF3783)、オーストラリア研究評議会フェローシップ(DE160100636)、サイモンズ財団からB.S.L.(594111)への賞、サイモンズ財団(542395)からR.S.への助成金

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクリルのりエボニック1133Acrifix 1S 0116
アクリル シートMcMaster-Carr8505K725または別の会社
粘着テープスコッチ3M 810スコッチ マジック テープ
オートクレーブSystecD-200または別の会社
ベンチトップ遠心分離機フィッシャー サイエンティフィック 75002451または別の会社
バンジーコードパラコード プラネット667569184000または別の会社
遠心分離管 - 2 mLシグマ アルドリッチBR780546-500EAエッペンドルフ管
円錐形遠心分離管 - 15 mLフィッシャーサイエンティフィック11507411ファルコンチューブ
円錐形遠心分離管 - 50 mLフィッシャーサイエンティフィック10788561ファルコンチューブ
展開アームアーウィン1964719または別の会社
展開エンクロージャープラグフィッシャーサイエンティフィック21-236-4原稿の代替案を参照してください
使い捨てワイパーKimtech - フィッシャーサイエンティフィック06-666キムワイプ
フローサイトメーターベックマンC09756CYTOFlex
グルタルアルデヒド 25%シグマ アルドリッチG5882または別の会社
緑色蛍光染料Sigma AldrichS9430SYBR Green I - 1:10,000 最終希釈
親水性 GP フィルターカートリッジ - 0.2 & マイクロ;mメルクC3235Sterivex フィルター
In Situ 走化性アッセイ (ISCA)--連絡先 責任著者
レーザーカッターEpilog レーザーフュージョン プロ 32または別の会社
Luria Bertani ブロスシグマ アルドリッチL3022または別の会社
マリンブロス 2216VWR90004-006ディフコ
ナイロンマイナス付きフラットヘッドネジMcMaster-Carr92929A243M 2 × 4 × 8 mm
ピペットセットフィッシャーサイエンティフィック05-403-151または異なる会社の
ピペットチップ - 1 mLフィッシャーサイエンティフィック21-236-2Aまたは異なる会社の
ピペットチップ - 20 & マイクロ;LFisher Scientific21-236-4または別の会社の
ピペットチップ - 200 & マイクロ;Lフィッシャーサイエンティフィック21-236-1または別の会社の
海塩シグマ AldrichS9883人工海水
血清ピペット用 - 50 mLシグマ アルドリッチSIAL1490-100EAまたは別の会社の
シリンジ フィルター - 0.02 µmWhatmanWHA68091002Anatopフィルター
シリンジフィルター - 0.2 & マイクロ;mFisher Scientific10695211または別の会社の
シリンジ針 27GHenke Sass Wolf47100040200.4 × 12 mm
シリンジ - 1 mLCodau329650インスリン ルアー U-100
シリンジ - 10 mLBD303134または別の会社の
シリンジ - 50 mLBD15899152または別の会社の
チューブラック - 15 mLThomas Scientific1159V80または別の会社
チューブラック - 50 mLThomas Scientific1159V80または別の会社
コーティングされていない高速度鋼汎用タップMcMaster-Carr8305A77または別の会社
真空フィルター - 0.2 & マイクロ;mメルクSCGPS05REステリトップフィルター

参考文献

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  2. Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
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