方法論記事

骨造形メカノダクタ化を刺激し、骨改造の機能的成果を解析するためのラボオンチッププラットフォーム

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DOI：

10.3791/61076

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2020年5月21日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

この記事について

サマリー

ここでは、ラボオンチッププラットフォーム内で骨のリモデリングを分析するためのプロトコルを紹介します。3Dプリントされた機械的ローディング装置は、細胞マトリックスを変形させることによって骨細胞のメカノストランスダクションを誘導するプラットフォームと組み合わせることができます。このプラットフォームは、破骨細胞および骨芽細胞(吸収/形成)からの骨リモデリング機能の結果を定量化するためにも使用できます。

要約

骨のリフォームは、骨格の成長と修復だけでなく、機械的環境の変化に適応するために必要とされる厳しく調整されたプロセスです。この過程で、メカノセンシティを受けた骨細胞は、異化破骨細胞と同化破骨芽細胞との間の対立する応答を調節する。このプロセスを調節する非常に複雑なシグナル伝達経路をよりよく理解するために、私たちの研究室は、小規模システム内の骨改造の機能的成果(形成および吸収)を分析するための基礎的なラボオンチップ(LOC)プラットフォームを開発しました。骨のリモデリングは数週間から数ヶ月の順序で起こる長いプロセスであるため、我々はシステム内で長期的な細胞培養プロトコルを開発しました。骨芽細胞および破骨細胞は、LOC内の機能的活性基質上で成長し、最大7週間維持した。その後、チップを分解して骨形成と吸収の定量化を可能にした。さらにLOCプラットフォームと組み合わせた3Dプリント式メカニカルローディングデバイスを設計し、細胞マトリックスを変形させることで骨細胞メカノトランスダクションを誘導することができます。LOCプラットフォーム内で骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞の細胞培養プロトコルを最適化し、無菌性と細胞毒性の問題に対処してきました。ここでは、LOCの製造と滅菌、機能基質上の細胞の播種、機械的負荷の誘導、およびLOCを分解してエンドポイントの結果を定量化するためのプロトコルを紹介します。これらの技術は、骨のリモデリングのための真のオルガンオンチップを開発するための基礎を築いたと考えています。

概要

骨は、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞の3つの主要な細胞タイプ間の複雑な調整を必要とする非常に動的な組織です。これらの細胞間の多細胞相互作用は、麻痺および長期不動の間に起こる骨の損失、および成長と運動に応答して起こる骨形成の原因である。骨細胞は、最も豊富な骨細胞型であり、骨に適用される機械的刺激に対して高感度である。機械的刺激は骨細胞の代謝活性を変化させ、主要なシグナル伝達分子11,22の増加をもたらす。このプロセスを通じて、メカノトランスダクションとして知られている骨細胞は、骨芽細胞(骨形成細胞)および破骨細胞(骨再生細胞)の活動を直接調整することができる。骨恒常性を維持するには、骨形成と骨吸収率の間に厳しい調節が必要です。しかし、このプロセスの中断は、骨粗鬆症や骨化などの疾患状態をもたらす可能性があります。

これら3種類の細胞間の相互作用の複雑さは、マイクロ流体およびラボ・オン・チップ(LOC)技術を利用した調査に適しています。そのために、私たちの研究室は最近、骨のリフォームプロセスにおける骨吸収と形成(機能的結果)を分析するためのLOCプラットフォームの概念実証を確立しました。このプラットフォームは、細胞間相互作用、変化したローディング環境、および治験薬スクリーニングの研究に使用できます。近年、骨のリモデリングを調節する分子シグナル伝達経路を調べるための様々なマイクロ流体デバイスが開発されています。しかし、これらのシステムの多くは、機能的な活動を示す間接的なマーカーを通してリモデリングを定量化する3,,4,5,6,,7.当社のシステムの利点は、機能的な結果を直接定量化するために使用できることです。骨の改造は長期的なプロセスです。したがって、骨吸収および形成の直接定量化には、少なくとも数週間から8ヶ月、9、10、119,10,の間維持できる培養システムが必要である。11このように、LOCプラットフォームを開発する際に、形成および吸収に必要な長期培養プロトコルを確立し、システム内の細胞を最大7週間11に維持しています。さらに、我々はプラットフォームに両方の細胞タイプの適切な培養基質を組み込んだ。破骨細胞を骨上で直接培養し、プラスチック付着であることが知られている骨芽細胞をポリスチレンディスク上で培養した。さらに、我々は、再モデリング解析11,12,12のための無菌性、長期細胞毒性および欠け分解に関する問題に対処した。

LOCプラットフォームは、マトリックス変形による骨細胞メカノトランスダクションを誘導するためにも使用できます。LOCとペアリングし、セル13を伸ばすために平面外の静電気を適用するために3Dプリントされた機械的ローディングデバイスが開発されました。この機械的負荷に対応するために、LOC内のウェルの深さが増加しました。この小規模でシンプルな機械的ローディングデバイスは、エンジニアリング経験が限られているラボで簡単に製造することができ、以前は3Dプリントコンポーネント13の図面を共有しています。現在の研究では、LOCの使用成功に必要な新しい技術のいくつかを実証します。具体的には、チップ製造、機能基質上の細胞播種、機械的ローディング、および再モデリングのためのチップ分解を実証しています。これらの手法の説明は、視覚的な形式から利益を得ると考えています。

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プロトコル

1. チップマスクの準備

注: ステップ 1.1 ~ 1.3 は、チップ マスクを最初に受け取った時点で 1 回だけ実行する必要があります。彼らはマスクが使用中に弓をしないようにします。マイクロ流体マスクの設計は、前に11,14,14を説明した。マスクは、高解像度のステレオリソグラフィを使用して社内で設計され、商業的に製造された(図1A)。

  1. マスクの上面をプラスチックシートで覆い、この表面を接着剤から保護します。スプレー接着剤を使用して、同じサイズのアクリルシートにチップマスクを固定します。接着剤が完全に治癒できるように、一晩一緒にピースをクランプします。接着剤が乾いた後、マスクの上部からプラスチックシートを取り除きます。
  2. 両面テープを使用して、アクリルシートの底部を3Dプリントされたレベリングボックス(補足図1、補助ファイル1-4)に取り付けます。しっかりと押して、しっかりと結合を確保します。
  3. 防水シーラントでレベリングボックスの取り外し可能な壁の近くに小さな開口部をシールします。シーラントを24時間硬化させる。
  4. 70%エタノール(EtOH)でマスクの表面を洗浄してください。オーブンに目的のチップマスクとレベリングボックスを置きます。デジタル分度器を使用して、マスクの上部がレベルであることを確認します。必要に応じて、レベリングねじを調整します。

2. PDMSの製造

注:浅いウェル(1 mm)チップ設計は機能活性(形成および再吸収)アッセイに使用され、深層(10mm)チップ設計は機械的ローディング研究に使用されます。深層ウェルの底部は、別の薄いPDMS膜を付着させることによって形成される(図1B)。

  1. リッド層(レイヤ 1)
    1. プラスチックカップにPDMSプレポリマー63gと6.3gの硬化剤(10:1比)を組み合わせます。使い捨てのセルスパチュラと脱気を真空デシケーターで30分間十分に混ぜます。
    2. 準備されたレベリングボックスにゆっくりと混合物を注ぎます。PDMSを30分間座らせてから、45°Cで18時間焼きます。
    3. 先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、レベリングボックスからポリマーシートを取り除きます。
    4. メスと3Dプリントテンプレートを使用して、個々の蓋をサイズ(70 mm x 34 mm)にカットします。
    5. バイオプシーパンチ(1mm直径)で各蓋を通して穴を開けます。
    6. 表面は包装テープでふたをきれいにする。
      注:蓋がすぐに使用されていない場合は、それぞれを包装テープで包み、室温(RT)で保管してください。
  2. ウェルおよびマイクロチャネル層(レイヤー2)
    1. PDMSプリポリマーと硬化剤(10:1比)をプラスチックカップに組み合わせます。浅い井戸設計は、プレポリマーの43 gと硬化剤の4.3 gを必要とし、深い井戸設計には227gのプレポリマーと22.7 gの硬化剤が必要です。ポリマーを激しく混ぜ、30分間脱気します。
      注: これは、152.4 mm x 152.4 mm のマスク寸法を想定しています。
    2. 適切な事前レベルのマスクの上にゆっくりと混合物を注ぎます。PDMSを30分間座らせてから、45°Cで18時間焼きます。
    3. 先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、慎重にマスクから離れてポリマーを剥がします。個々のチップを切り取るためにメスと3Dプリントテンプレートを使用してください。
      注:積み込み試験では、チップ寸法(70 x 34 mm)が正確であり、ウェルがチップの中央に位置することが重要です。
    4. 表面は包装テープでPDMSをきれいにする。
      注:チップがすぐに使用されていない場合は、各チップをテープに包み、RTに保管します。
  3. 薄いPDMS膜(層3)
    注: このレイヤーは、深い井戸設計にのみ使用されます。
    1. プラスチックカップに12.7gのPDMSプレポリマーと1.3gの硬化剤(10:1比)を加えます。激しく混ぜ、30分間脱気します。
    2. 準備されたレベリングボックスにポリマーをゆっくりと注ぎ、プラスチックカップを十分に削ってできるだけ多くのPDMSを取り除きます。
    3. セルスパチュラを使用して、PDMSを全面に広げます。
      注:ポリマーが手動で広がっていない場合、表面張力はポリマーが均一なシートを形成するのを防ぐのに十分です。
    4. PDMSを30分間座らせてから、45°Cで18時間焼きます。
    5. 先細りのヘラで PDMS の端を緩め、PDMS シートをレベリング ボックスから慎重に取り外します。レイヤー 2 の寸法に一致する個々の膜をカットします。
    6. キャリパーを使用して、膜の中心にある膜の厚さを測定します。所望の厚さ(0.5 mm ±0.1 mm)の外側にある膜を捨てます。
    7. 包装テープで慎重にきれいな膜を、パラフィンフィルムの一部に置きます。
      注:膜がすぐに使用されていない場合は、包装テープで膜の上部を覆い、RTに保管してください。

3. 機能活動の基質

注:ポリスチレンディスクと骨ウエハーは、それぞれ骨芽細胞および破骨細胞培養に使用される井戸の底部に取り付ける必要があります。

  1. ポリスチレンディスク(図1C)
    1. マスキングテープを、ポリスチレンカバースリップを処理した組織培養の裏側に置きます。シャープにしたコルクボーラー(直径5.4mm)を使用して、カバースリップから円形のディスクをカットします。70%のEtOHでディスクを水没させ、一晩放置します。
    2. 70%のEtOHに浸した綿の先端アプリケーターでディスクの上面を静かにこすります。ディスクの外縁が完全にクリーニングされていることを確認します。
    3. 2組の鉗子を使用して、ディスクを保持し、マスキングテープのバッキングを取り外します。ディスクを下に置き、綿の先端のアプリケーターで裏側をきれいにします。
    4. 綿の先端アプリケーターの木製の端を未硬化PDMSの脱ガス混合物に浸し、所望の井戸の底に少量のポリマーを置きます。
      注:残りの未硬化PDMSは-20°Cで保存することができます。
    5. 取り扱ったポリスチレンディスクを井戸に上げ、綿棒でディスクを軽く押し下げます。未硬化のPDMSがディスクの処理された側に接触しないようにします。
      メモ:PDMSがディスクの処理された表面に接触する場合は、井戸からディスクを取り出し、手順3.1.4と3.1.5を新しいディスクで繰り返します。
    6. チップを30分間レベルの表面に置き、65°Cで4時間焼きます。
  2. ボーンウエハース
    1. 100 mm 皿の底部に骨ウエハ(直径6mm、厚さ0.4mm)を配置するために鉗子を使用しなさい。鉗子でウエハーをしっかり持ち、メスでウエハーの背面に「X」をそっとエッチングします。
      注: イメージングプロセスでは、'X' を使用して、ウエハの背面と、細胞をシードしたサーフェスを区別します。
    2. 所望の井戸の底に少量の未硬化PDMSを加えるために綿の先端の塗布器の木製の端を使用してください。側面を下にマークした骨ウェーハを井戸に入れ、綿製のチップアプリケーターを使用してウエハーを押し下げる。
    3. チップを30分間レベルの表面に置き、65°Cで4時間焼きます。

4. チップアセンブリと滅菌

  1. 中型無線周波数(RF)電源設定(約10.2 Wに相当)を使用して、30 sのプラズマクリーナーでレイヤ1とレイヤ2の表面をアクティブにします。
  2. レイヤ 1 のアクセス ホールをレイヤ 2 のマイクロチャネルに合わせ、2 つのレイヤをしっかりと押します。
  3. ディープウェル設計の場合、レイヤー 2 とレイヤー 3 でステップ 4.1 を繰り返します。プラズマ処理の際、両面テープを使用して、層3のパラフィンフィルムを平らな表面に取り付けます。
  4. PDMS膜から余分な材料を切り取るためにメスを使用してください。慎重にチップの底からパラフィンフィルムのシートを剥がします
  5. 65°Cでチップを10分間焼き、PDMS層間の結合強度を高めます。
  6. 角度付きの分配の先端(18ゲージ、0.5のin、90°)を蓋のアクセス穴に挿入する。2部エポキシで蓋に分配の先端を固定します。各分配チップの周りにエポキシを適用するためにマイクロピペットの先端を使用してください。
  7. エポキシが完全に硬化した後、表面は70%のEtOHでチップをきれいにし、バイオセーフティキャビネットに置きます。バイオセーフティキャビネット内の後続の手順をすべて実行します。
  8. 5 mL シリンジを無菌シリコーンチューブ(1/32'ID、長さ約10 cm)で分配チップに接続し、チップ全体に少なくとも30の70%EtOHを充填します。浅い井戸の設計のために、4 mL/hの流量に設定されたシリンジポンプとすべての液体を管理する。深い井戸の設計のために、ゆっくりと手で注射器を分配することによってすべての液体を管理する。
  9. チップからEtOHを取り出し、一晩UV光でチップを殺菌します。
  10. チップをdH2Oで3回洗浄し、チップをdH2Oで満たし、分配チップからチューブを取り除き、37°Cで少なくとも48時間インキュベートします。

5. 機械式ローディング装置アセンブリ

注: 3D プリントされた機械式ローディング デバイス (図2A-C)の設計および製造プロセスは、前に説明されており、印刷されたコンポーネントのすべての設計ファイルは、以前は13.

  1. 121 °Cで30分間、ローディング装置のすべてのコンポーネントをオートクレーブします。
    注:印刷されたコンポーネントの歪みを避けるために、各部分をホイルで個別にラップし、オートクレーブプロセス中に硬い平らな表面に置きます。金属ハードウェアは、一緒にラップすることができます。バイオセーフティキャビネット内の後続の手順をすべて完了します。
  2. プティンのシャフトの周りに圧縮スプリングを配置し、ベースの底部の中央の穴にプティンを挿入します(図2D)。
  3. 4 本のセルフタッピングねじを使用して、ダイヤル ブロックを底面の底に取り付けます。
  4. 中央のネジの周りに第2の圧縮スプリングを配置します。ダイヤルの底部にある六角形の穴にネジを挿入し、ダイヤルブロックの中央にあるネジ穴にアセンブリをねじ込みます。
  5. 4人の男性と女性のスタンドオフをベースの底にねじ込みます。
  6. プテンの上部がベースの上部を下回るまでダイヤルを反時計回りに回して、デバイスから緩みを取り除きます。次に、盤板の上部がベースの上部と同じレベルになるまで、ダイヤルを時計回りにゆっくりと回します。

6. 実験

注: 機能アクティビティ実験用のプロトコルは、以前は11,,12で提供されていました。

  1. ローディング スタディ (図 3)
    1. ステップ4.9に続いて、5 mLのシリンジを使用して、深いウェルチップからdH2Oを取り除きます。ウェルの底部に0.15 mg/mL I型コラーゲン(CTI)を0.02 Mの酢酸で1時間コーティングします。
    2. Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水をカルシウムとマグネシウム(DPBS++)で3回洗浄します。
    3. チップホルダーにチップを入れ、MLO-Y4骨細胞をMLO-Y4骨細胞に入れ、5%の子牛血清、5%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補った最小必須アルファ培地(MEMα)で2 x 104細胞/mLの密度でシードします。
    4. 分配チップからチューブを取り出し、チップを深層培養皿(150 mm x 25 mm)に入れます。細胞を37°Cで、5%CO2で272時間培養する。
    5. 滅菌チューブを分配の先端に取り付け、5 mLシリンジを使用して、使用済み培地をチップから取り除きます。新鮮な培養培地でゆっくりと分配し、チップを補充します。
    6. チップホルダーをローディングデバイスベースの上部にある長方形のインセットに入れます。ローディングデバイスの蓋にあるスロットを通してチューブを供給し、4つのパンヘッドネジと六六本ナットで蓋をベースに固定します。
      注: 蓋のレベルを保つには、まず、2 本のネジを互いに対角線で固定してから、残りの 2 本のネジを固定します。
    7. 希望のプラメンの変位に達するまでダイヤルを時計回りに回してセルに荷重を適用します。
      メモ:このデバイスは、ダイヤルの1回転が1mmのプッキの変位に相当するように設計されています。PDMS膜の上部に発生したひずみ場は、有限要素解析(FEA)13を用いてプッキーン変位の13関数として以前モデル化した。
    8. 積み込み装置を空のP1000マイクロピペットチップボックスに入れます。15分間、塗布した負荷で細胞をインキュベートします。
      注: ここで使用する読み込み時間は、例として機能します。代替の読み込み時間を使用できます。
    9. インキュベーションに続いて、プ盤が元の開始位置に戻るまでダイヤルを反時計回りに回してセルから負荷を取り除きます。装置から蓋を取り出し、チップホルダーを深層培養プレートに入れます。90分間のポストロード回復期間の細胞をインキュベートします。
      注: ここで使用する復旧期間を例として使用します。代替の回復時間を使用できます。長期研究では、72時間ごとに細胞を供給する。
    10. 5 mL のシリンジを使用して、調整された媒体をチップから取り出します。
      注:この培地は、保存して-80 °Cで保存することができます。
    11. チップホルダーからチップを取り出し、テーパー付きヘラを使用してPDMS蓋とウェル層の結合を破ります。
      注:細胞アッセイは、細胞培養プレートに対して確立されたプロトコルに従って実行できるようになりました。

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結果

浅い井戸構成は骨芽細胞および破骨細胞の機能活性を分析するために使用することができる。骨芽細胞を介した骨形成と破骨細胞による吸収は、数週間から数ヶ月のオーダーで培養時間を必要とする。MC3T3-E1前骨芽細胞からの骨形成は、アリザリン赤とフォンコッサ染色11、15,15を用いて定量した。49日目において、アリザリン赤色で染色された平均表面積は10.7%±2.2%(平均平均±標準誤差)11であった。フォン・コッサで染色された平均表面積は6.4%±1.611であった。図4Aは、アリザリンレッドとフォンコッサで染色された49日目の骨芽細胞培養の典型的な形成結果を示す。生骨細胞からの骨吸収は、トルイジンブルー染色11,15...

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ディスカッション

この記事では、骨細胞、破骨細胞、および骨芽細胞を培養するための骨リモデリングLOCプラットフォームを製造するための基礎について説明します。チップ内のウェルの深さと大きさを変更することにより、骨細胞を機械的負荷で刺激し、骨のリモデリングの機能的結果を定量化するために複数の構成が開発された(図1B)。

チップアセンブリの間、プラズマ酸化プロトコルの最適化は、漏れ問題を排除するために重要でした。我々は、PDMS表面を、約10.2Wに相当する中程度のRF電力設定(ステップ4.1)を用いて発生した30秒の酸素プラズマに曝露するだけで、層間に強い結合を生み出すのに十分であることがわかった。露出時間が長くなったり、RF電源設定が高くなったりすると、ボンディングの完全性が低下しました。これは、PDMSの酸素プラズマへの過度の暴露が表面粗さを増加させ、粘着性を低下させた17,18,18を指摘...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、グラント・ノーズ(CBET 1060990およびEBMS 1700299)の下で国立科学財団によって支援されました。また、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(2018250692)の支援を受けた研究成果を基にしています。この資料で表明された意見、調査結果、結論、または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクリルシートOptix--厚さ3.175ミリメートル
角度付きディスペンシングのヒントジェンセングローバルJG18-0.5X-90使用前にプラスチックコネクタを取り外す
バイオプシーパンチロビンスインスツルメンツRBP-10直径1mm
の骨ウェーハBoneslices.com 厚さ0.4mm牛皮質骨
牛の子牛血清ハイクロン
SH30072ノギスグローバルインダストリアルT9F534164
セルスパチュラTPP99010
チップマスクProtoLabsカスタムデザイン印刷素材:Accura SL 5530
コルクボーラーフィッシャーサイエンティフィック07-865-10B
コットンチップアプリケーターピューリタン806-WCL
カルチャーディッシュ (100 mm)コーニング430591滅菌済み、非組織培養処理済み
培養ディッシュ (150 mm)コーニング430597滅菌済み、非組織培養処理済み
両面テープ3M 会社スコッチ 237
ウシ胎児血清ハイクロンSH30910
鉗子フィッシャーサイエンティフィック22-327379
レベリングボックスカスタムメイド--3Dプリント
マスキングテープ3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblastsATCCCRL-2593Subclone 4
メカニカルローディングデバイスカスタムメイド--3Dプリント
Minimum essential alpha mediumGibco12571-063
MLO-Y4 osteocytes----リンダ・ボネワルド博士からの贈り物
包装テープダックブランド-標準包装テープ
パラフィンフィルムBemis ParafilmPM999
ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogenp4333
プラズマクリーナーHarrick PlasmaPDC-001エキスパンドプラズマクリーナー
ポリジメチルシロキサンキットダウコーニングシルガード184
ポリスチレンカバースリップNunc Thermanox174942滅菌、組織培養処理
オーブンクインシーラボ12-180
RAW264.7 破骨前ATCCTIB-71
メスBD メディカル372611
シリコーンチューブサンゴバンタイゴンABW00001ID:1/32インチ (0.79 mm)、OD:3/32インチ (2.38 mm)
SolidWorksのソフトウェアDassault Systèmes--3Dプリントモデルの生成とFEAスプレー接着剤の実行に使用
ロックタイト2323879多目的接着剤
シリンジ(5ml)BDメディカル309646滅菌
シリンジポンプハーバード装置70-2213ポンプ11 Pico Plus
テーパード実験用ヘラフィッシャーサイエンティフィック21-401-10
2部構成expoxyLoctite13953915 minute quick set
Type I コラーゲンCorning354236ラットテールコラーゲン
真空デシケーターBel-ArtF42010-0000
防水シーラントGorilla 8090001100% シリコンシーラント
の

参考文献

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