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方法論記事

HT29由来癌幹細胞様腫瘍球におけるドライバ遺伝子の発見

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DOI:

10.3791/61077

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2020年7月22日

 ,  ,  , 
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

この記事について

サマリー

ここで提示される、大腸HT29細胞由来の確立された癌幹細胞様細胞を維持する過剰発現ドライバ遺伝子を発見するためのプロトコルである。RNAAseqは、標的腫瘍細胞の生存に関与する潜在的なメカニズムを解明するための遺伝子発現網を調査およびスクリーニングするために実施した。

要約

がん幹細胞は臨床療法に対して重要な役割を果たし、腫瘍の再発に寄与する。腫瘍形成と癌幹細胞性の開始に関与する多くの腫瘍遺伝子があります。大腸癌由来腫瘍球の形成における遺伝子発現は不明であるため、一度に1つの遺伝子に作用するメカニズムを発見するのに時間がかかる。本研究は、インビトロで大腸癌幹細胞様細胞の生存に関与するドライバ遺伝子を迅速に発見する方法を示す。スフェロイドとして培養し、増加したCD133ステムネスマーカーに伴うLGR5を発現する大腸HT29癌細胞を選択し、本研究で使用した。提示されるプロトコルは、大腸HT29由来の茎様腫瘍球の形成における過剰発現ドライバー遺伝子を迅速に明らかにするために、利用可能なバイオインフォマティクスを用いてRNAseqを実行するために使用される。方法論は、他の疾患モデルの潜在的なドライバー遺伝子を迅速にスクリーニングし、発見することができます。

概要

大腸癌(CRC)は、世界的に高い罹患率と死亡率を有する主要な死因である1,,2。遺伝子変異や増幅のために、癌細胞は増殖制御なしで増殖し、細胞生存に寄与する3、抗アポトーシス4、及び癌幹細胞5、6、7。6,75腫瘍組織内では、腫瘍の不均一性により、腫瘍細胞は治療治療中に適応し、生き残ることができる8.癌幹細胞(CSC)は、形切れ癌タイプよりも自己再生率および多能性の割合が高く、主に腫瘍再発99、10および10転移性CRC11を担う。CSCは、より多くの薬剤耐性12、13、1413,14および抗アポトーシス特性15、16を提示し、16したがって腫瘍化学療法を生き残る。12

ここで、選択したCRC幹細胞における幹細胞の潜在的な機構を調べるため、RNAseqは腫瘍スフェロイド中の微分発現遺伝子をスクリーニングするために行った。癌細胞は、低い付着条件で増殖し、EGF、bFGF、HGF、およびIL6を含む培養培地に添加された成長因子によって刺激されたときにスフェロイド(腫瘍球とも呼ばれる)を形成することができる。そこで、オキサリプラチンとイリノテコン17で処理した場合にリン酸化STAT3の増加に伴う化学療法に抵抗するCRC HT29腫瘍細胞を選択した。また、HT29は、記載した培養条件で培養した場合に、より高いステムマーカーを発現した。HT29由来のCSCモデルは、より多量のロイシンを含む反復含有Gタンパク質共役受容体5(LGR5)18を発現し、CRC幹細胞1819,20,20の特異的マーカーである。また、CD133は、がん幹細胞の一般的なバイオマーカーと考えられ、HT29細胞株21においても高発現している。このプロトコルの目的は、個々の腫瘍遺伝子22を調査するのではなく、バイオインフォマティクスデータセットに基づいて確立された癌幹様腫瘍球中のドライバ遺伝子群を発見することである。RNAseq分析を通じて潜在的な分子メカニズムを調べ、その後、利用可能なバイオインフォマティクス分析を行います。

次世代シーケンシングは、高スループット、容易に入手でき、かつ、計算助けに基づく信頼性の高いDNAシーケンシング法であり、腫瘍療法23を導くためにドライバ遺伝子を包括的にスクリーニングするために使用される。この技術は、単離されたRNAサンプル24の逆転写から遺伝子発現を検出するためにも使用される。しかし、RNAseqでスクリーニングする場合、治療を標的とする最も重要な遺伝子は、実験サンプルと対照サンプルの間で最も高い発現差を有しない可能性がある。したがって、いくつかのバイオインフォマティクスは、創意工夫経路解析(IPA)29およびNetworkAnalyst30を含むKEGG29 25、GO26、27、,27またはPanther28などの現在のデータセットに基づいて遺伝子を分類し、同定するために開発された。このプロトコルは、RNAAseqとNetworkAnalystの統合を示し、親のHT29細胞と比較して、選択したHT29由来のスフェロイドの遺伝子群を素早く発見します。この方法を他の疾患モデルに適用することは、重要な遺伝子の違いを発見するためにも示唆される。

個々の遺伝子発現の調査と比較して、ハイスループット技術は、腫瘍精密医療のための潜在的なドライバー遺伝子を容易に見つける利点を提供します。KEGG、GO、パンサーなどの有用なデータセットを使用すると、疾患モデル、シグナル伝達経路、または特定の機能に基づいて特定の遺伝子を同定することができ、これにより特定の重要な遺伝子に迅速に焦点を当て、時間と研究コストを節約できます。同様のアプリケーションは、以前の研究で使用されています,14,18,,31.特に、腫瘍の種類が異なるため、腫瘍は生存および増殖のための遺伝子と経路を区別する発現するので、より複雑である。したがって、このプロトコルは、異なる状況下で異なる腫瘍タイプを区別する遺伝子を拾うことができる。特定の遺伝子発現のメカニズムを理解することで、がんに対する効果的な戦略を見つける可能性があります。

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プロトコル

1. 細胞培養と腫瘍球形成

  1. 10%胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質(P/S)とダルベックの修飾ワシ培地(DMEM)を含む10cmの皿中の培養HT29細胞。
  2. 無菌条件下で5%CO2と95%の湿度で37°Cのインキュベーターで細胞を80%の合流まで増殖させます。
  3. HT29細胞を37°Cで5分間0.25%トリプシンの1 mLでトリプシン化し、10%FBSと1%P/Sで2mLのDMEMを加えてトリプシンを中和します。
  4. ヘモサイトメーターを使用してHT29細胞を数えます。
  5. 2,000個の細胞/ウェルを低く取り付けられた6ウェルプレートに加え、2 mLの無血清DMEMを1%P/Sで、0.2%B27で補い、 表皮成長因子(EGF)の20 ng/mL、線維芽細胞増殖因子(bFGF)の20 ng/mL、肝細胞増殖因子(HGF)の20ng/mL、インターロイキン6(IL6)の20 ng/mL。
  6. 無菌条件下で5%CO2と95%の湿度で37°Cで細胞を成長させます。
  7. 腫瘍球が直径100μm以上を測定するまで、2日ごとに0.5mLの癌幹細胞培地を7日間加える。
  8. デジタル細胞イメージングシステムを用いた反転顕微鏡を用いて、腫瘍球径を観察・測定します。
  9. 腫瘍球が直径100μmに達すると、37°Cで5分間0.25%トリプシンで腫瘍球をトリプシンし、成長培地の2倍の体積を加えてトリプシンを中和する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
  10. 10分間1,200rpmで遠心分離機を出し、上清を取り除く。
  11. 抗LGR5-PEの42μLと2μLの抗CD133-PEを室温で30分間、室温で30分間個別にインキュベートし、200rpmで振る。
    注:CD133はHT29細胞で高発現している一般的な癌幹細胞バイオマーカーです。
  12. 900 μLのPBSを加え、フローサイトメトリーを用いてLGR5とCD133の発現を解析します。FL2-Hチャネルにおける蛍光の変化は、遺伝子発現を示す。

2. RNAの単離

注:メーカーの指示に従ってRNA分離のための迅速なコラムと商業キット(材料表を参照)を使用してください。

  1. 50 μL の PBS を採取した細胞(2 x 105細胞)に加え、ピペット処理で再懸濁します。
  2. β-メルカプトエタノール(β-ME)を2μL含有する200μLのリシスバッファーを加えます。素早く渦を出し、5分間放置します。
  3. 16,000 x gで溶液を 10 分間遠心分離し、上清を集め、200 μLの 70% エタノールと混ぜます。
  4. 14,000 x gで遠心分離して溶媒を 1 分間除去するために、付属のカラムを使用します。
  5. 洗浄液1及び2を用いて洗浄し、14,000xgで遠心分離により非RNAをg1分間完全に除去する。
  6. 2分間14,000xgで再びg遠心分離機を用いて残留エタノールを除去した。
  7. 蒸留水50μL、14,000xgで1分間遠心分離機をg加え、溶液を回収します。
  8. 分光光度計を用いてOD260を用いてRNA濃度を測定する。
    RNA濃度(μg/mL)=(OD260)x(40μg RNA/mL)およびOD260/OD280 > 2.RNA サンプルは RNA 完全性の数値 (RIN) > 7 を持つ必要があります。

3. RNAseqプロファイリングとバイオインフォマティクス分析

注:RNAAseq分析は、親のHT29細胞と比較してHT29由来の腫瘍球における微分遺伝子を調べるため、商業的に行った(材料表を参照)。

  1. ライブラリの構築、ライブラリの品質管理、DNA シーケンシングなど、RNAseq の手順に商用サービスを使用します。
  2. データ レポートには、読み取り数、log2 の折り返し変更、p 値などの重要な情報が含まれている必要があります。HT29腫瘍球群の読み取りカウント>100を持つ>1 log2折り返し変化を持つ遺伝子、およびHT29ペアレンタル群の読み取り数>100で遺伝子<-1 log2折り返し変化の各パラメーターに従って、微分遺伝子を選択します。この場合、p 値 < 0.05 が許容可能であると見なされ、データが使用されました (表 1)。
    注: ここでは、特定の遺伝子の研究を継続し、その発現を検証するためのしきい値として、遺伝子数 >100 が使用されました。
  3. 統計解析ソフトウェア (材料表を参照) を使用して、ヒートマップを表示し、過剰発現遺伝子 >1 およびダウンレギュレートされた遺伝子 < 1 を log2 の折り返し変化で識別します。
  4. Rソフトウェアを使用して、x:log2折りたたみ変更で火山プロットを描画します。y: -log10 (p値) を示す遺伝子の差を示す。
    1. R ライブラリのインストール
      パッケージ(ライブラリ(キャリブレーション))
    2. 次のプログラムで RStudio でデータを読み取ります。
      res <-read.csv("/ユーザー/xxx.csv"、ヘッダー=T)
      ヘッド(レス)
      (res, プロット (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, メイン="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0")
      (サブセット、pvalue<.05&log2FoldChange>1)、ポイント(ログ2フォールドチェンジ、-log10(pvalue)、pch=19、コル="赤")
      (サブセット、pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)))、ポイント(ログ2フォールドチェンジ、-log10(pvalue)、pch=19、コル="ブルー")
      (サブセット、pvalue>.05)、ポイント(ログ2フォールドチェンジ、-log10(pvalue)、pch=19、コル=#444444")
      アバーリン(h=1.3,lty=2)
      アバーリン(v=1,lty=2)
      アバリン(v=(-1),lty=2)
    3. 火山プロットを取得するために実行を実行します。

4. ドライバー遺伝子の選択

  1. ネットワークアナリストで単一遺伝子入力を選択します。
  2. 表1から選択した過剰発現遺伝子を、生物とID型の公式遺伝子シンボルとして指定した「ヒト」でコピーして貼り付ける。
    注: または、コピーと貼り付けにはEnsembl ジーン IDを使用します。
  3. [アップロードして続行] をクリックしてデータを挿入し、遺伝的 PPI に続くタンパク質相互作用 (PPI) を使用して分析します。
  4. STRING interactome データベースを 900 の信頼度スコアカットオフで使用して、アップロードされた遺伝子を交差リンクするシード遺伝子を示します。より多くの個々の遺伝子と関連付ける種子遺伝子を、HT29由来の腫瘍球の形成維持に関与し得るドライバ遺伝子として選択した。
    メモ: 使用する 3 つの対話データセットがあります: IMEx、STRING、およびロールランド。STRING には、より高い信頼度の実験的証拠が含まれています。アップロードされた遺伝子数が少ない場合、IMExを選択して、interactomeネットワーク内のドライバ遺伝子を予測およびピックアップすることができます。
  5. マッピングの概要で [続行] を選択します。
  6. [背景の白]を選択し、[レイアウト]ノブで[アトラスを強制]を選択します。
  7. パンサーBPを選択して、アップレギュレーション遺伝子群を分析します。
    注: この研究では、HSPA5 が HT29 由来の腫瘍球における抗アポトーシスの原因であったことを示しています (図 3A)。特定の機能分野を絞り込むために、KEGG、GO、またはパンサー分類を使用して、特定のドライバ遺伝子を選択することができる。

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結果

癌幹細胞の機構を調べるモデルを確立するために、大腸HT29細胞を用いて、B27、EGF、bFGF、HGF、およびIL6を含む低結合プレートでインビトロで癌幹細胞様腫瘍球を培養した。直径100μmの腫瘍球は7日間で形成された(図1A)。腫瘍球を単細胞にトリプシンして、フローサイトメトリーを用いてLGR5およびCD133発現を検出した。LGR5はHT29駆動腫瘍球において1.1%から11.4%に増加し、細胞はフローサイトメトリーを用いて検出された(図1B)。もう一つのステムネスマーカー、CD133は、親のHT29細胞と比較して培養されたHT29由来の腫瘍球において61.8%から81.1%に増加した(図1C)。その後、腫瘍球はRNAEqの調査の準備ができていた。

RNAAseqは、親のHT29細胞と比較して、HT29由来の腫瘍球における遺伝子発現プロファイルを調べるのに用いた。ヌクレオチド読み取りにおける誤差率...

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ディスカッション

本研究では、培養された癌幹細胞様腫瘍球を、利用可能なバイオインフォマティクスを用いてRNAEqデータを解析するモデルとして用いた。疾患モデルでは、HT29由来の腫瘍球が使用された。腫瘍球は腫瘍療法に対する薬剤耐性を有するため、遺伝子発現の違いを調べ、耐性の詳細なメカニズムを調べることができる。さらに、RNAseqを利用したゲノム技術は、研究モデルを迅速に理解し、潜在的に関与する遺伝子をより高い信頼で検証できるようにします。また、腫瘍球の形成に関与する遺伝子の種類を同定することができる。

RNAの品質は、RNAseq解析32にとって重要です。サンプルの読み取り、マッピング遺伝子、FPKM の間の確実性が高まるので、サンプルに RIN >7 が含まれているようにしてください。RNAEqデータを分析する際、IPA29とNetworkAnalyst30は、潜在的な遺伝子およびシグナル伝達経路を同定するために利用可能であった。しかし、実験群では読み取...

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開示事項

著者らは関連する財務上の開示を持っていません。

謝辞

著者らは、チャン・グン記念病院放射線研究所放射線生物学コア研究所に技術支援を感謝する。この研究は、チャン・グン記念病院(CMRPD1J0321)、チェンシン総合病院(CHGH 106-06)、マッカイ記念病院(MMH-CT-10605およびMMH-106-61)からの助成金によって支えられました。資金調達機関は、研究の設計やデータ収集、データの分析と解釈、または原稿の執筆に影響を与えませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
iRiS デジタル セル イメージング システムLogos Biosystems, IncI10999腫瘍球の形成を観察
フローサイトメトリーBD バイオサイエンスFACSCalibur腫瘍球中の LGR5 および CD133 を検出するための
抗 LGR5-PEバイオレジェン373803LGR5 検出試薬
抗 CD133-PEバイオレジェンド372803CD133 検出腫瘍
球の培養のためのEGFGenScriptZ00333
bFGFGenScriptZ03116腫瘍球
HGFGenScriptZ03229腫瘍球の培養
IL6球の培養のためのGenScriptZ03034
PureLink RNA抽出キットInvitrogen12183025分離RNAseq分析のための全RNA
RNAseqのパフォーマンスBiotools、台湾RNAseq分析はBiotools、Ttaiwan
NetworkAnalystInstitute of Parasitology、McGill University、モントリオール、ケベック、カナダhttp://www.networkanalyst.ca/
PrismGraphPadソフトウェア統計分析ソフトウェア
ド 試薬の培養のためののための 腫瘍によって共同で行われます

参考文献

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