HT29由来癌幹細胞様腫瘍球におけるドライバ遺伝子の発見

Summary

ここで提示される、大腸HT29細胞由来の確立された癌幹細胞様細胞を維持する過剰発現ドライバ遺伝子を発見するためのプロトコルである。RNAAseqは、標的腫瘍細胞の生存に関与する潜在的なメカニズムを解明するための遺伝子発現網を調査およびスクリーニングするために実施した。

Abstract

がん幹細胞は臨床療法に対して重要な役割を果たし、腫瘍の再発に寄与する。腫瘍形成と癌幹細胞性の開始に関与する多くの腫瘍遺伝子があります。大腸癌由来腫瘍球の形成における遺伝子発現は不明であるため、一度に1つの遺伝子に作用するメカニズムを発見するのに時間がかかる。本研究は、インビトロで大腸癌幹細胞様細胞の生存に関与するドライバ遺伝子を迅速に発見する方法を示す。スフェロイドとして培養し、増加したCD133ステムネスマーカーに伴うLGR5を発現する大腸HT29癌細胞を選択し、本研究で使用した。提示されるプロトコルは、大腸HT29由来の茎様腫瘍球の形成における過剰発現ドライバー遺伝子を迅速に明らかにするために、利用可能なバイオインフォマティクスを用いてRNAseqを実行するために使用される。方法論は、他の疾患モデルの潜在的なドライバー遺伝子を迅速にスクリーニングし、発見することができます。

Introduction

大腸癌(CRC)は、世界的に高い罹患率と死亡率を有する主要な死因^{である1,,2}。遺伝子変異や増幅のために、癌細胞は増殖制御なしで増殖し、細胞生存に寄与する^3、抗アポトーシス^4、及び癌幹細胞^{5、6、7。6,75}腫瘍組織内では、腫瘍の不均一性により、腫瘍細胞は治療治療中に適応し、生き残ることができる^8.癌幹細胞(CSC)は、形切れ癌タイプよりも自己再生率および多能性の割合が高く、主に腫瘍再発^{99、10および10}転移性^CRC11を担う。CSCは、より多くの薬剤耐性^{12、13、1413,14}および抗アポトーシス特性^15、16を提示し^、

Protocol

1. 細胞培養と腫瘍球形成

1. 10%胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質(P/S)とダルベックの修飾ワシ培地(DMEM)を含む10cmの皿中の培養HT29細胞。
2. 無菌条件下で_5%CO2と95%の湿度で37°Cのインキュベーターで細胞を80%の合流まで増殖させます。
3. HT29細胞を37°Cで5分間0.25%トリプシンの1 mLでトリプシン化し、10%FBSと1%P/Sで2mLのDMEMを加えてトリプシンを中和します。
4. ヘモサイトメーターを使用してHT29細胞を数えます。
5. 2,000個の細胞/ウェルを低く取り付けられた6ウェルプレートに加え、2 mLの無血清DMEMを1%P/Sで、0.2%B27で補い、 表皮成長因子(EGF)の20 ng/mL、線維芽細胞増殖因子(bFGF)の20 ng/mL、肝細胞増殖因子(HGF)の20ng/mL、インターロイキン6(IL6)の20 ng/mL。
6. 無菌条件下で_5%CO2と95%の湿度で37°Cで細胞を成長させます。
7. 腫瘍球が直径100μm以上を測定するまで、2日ごとに0.5mLの癌幹細胞培地を7日間加える。
8. デジタル細胞イメージングシステムを用いた反転顕微鏡を用いて、腫瘍球径を観察・測定します。
9. 腫瘍球が直径100μmに達すると、37°Cで5分間0.2....

Results

癌幹細胞の機構を調べるモデルを確立するために、大腸HT29細胞を用いて、B27、EGF、bFGF、HGF、およびIL6を含む低結合プレートでインビトロで癌幹細胞様腫瘍球を培養した。直径100μmの腫瘍球は7日間で形成された(図1A)。腫瘍球を単細胞にトリプシンして、フローサイトメトリーを用いてLGR5およびCD133発現を検出した。LGR5はHT29駆動腫瘍球において1.1%から11.4%に増加し、細胞はフローサイトメトリーを用いて検出された(図1B)。もう一つのステムネスマーカー、CD133は、親のHT29細胞と比較して培養されたHT29由来の腫瘍球において61.8%から81.1%に増加した(図1C)。その後、腫瘍球はRNAEqの調査の準備ができていた。

RNAAseqは、親のHT29細胞と比較して、HT29由来の腫瘍球における遺伝子発現プロファイルを調べるのに用いた。ヌクレオチド読み取りにおける誤差率.......

Discussion

本研究では、培養された癌幹細胞様腫瘍球を、利用可能なバイオインフォマティクスを用いてRNAEqデータを解析するモデルとして用いた。疾患モデルでは、HT29由来の腫瘍球が使用された。腫瘍球は腫瘍療法に対する薬剤耐性を有するため、遺伝子発現の違いを調べ、耐性の詳細なメカニズムを調べることができる。さらに、RNAseqを利用したゲノム技術は、研究モデルを迅速に理解し、潜在的に関与する遺伝子をより高い信頼で検証できるようにします。また、腫瘍球の形成に関与する遺伝子の種類を同定することができる。

RNAの品質は、RNAseq解析³²にとって重要です。サンプルの読み取り、マッピング遺伝子、FPKM の間の確実性が高まるので、サンプルに RIN >7 が含まれているようにしてください。RNAEqデータを分析する際、IPA²⁹とNetworkAnalyst³⁰は、潜在的な遺伝子およびシグナル伝達経路を同定するために利用可能であった。しかし、実験群では読み取.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
iRiS デジタル セル イメージング システム	Logos Biosystems, Inc	I10999	腫瘍球の形成を観察
フローサイトメトリー	BD バイオサイエンス	FACSCalibur	腫瘍球中の LGR5 および CD133 を検出するための
抗 LGR5-PE	バイオレジェン	373803	LGR5 検出試薬
抗 CD133-PE	バイオレジェンド	372803	CD133 検出腫瘍
球の培養のための	EGF	GenScript	Z00333
bFGF	GenScript	Z03116	腫瘍球
HGF	GenScript	Z03229	腫瘍球の培養
IL6	球の培養のための	GenScript	Z03034
PureLink RNA抽出キット	Invitrogen	12183025	分離RNAseq分析のための全RNA
RNAseqのパフォーマンス	Biotools、台湾		RNAseq分析はBiotools、Ttaiwan
NetworkAnalyst	Institute of Parasitology、McGill University、モントリオール、ケベック、カナダ		http://www.networkanalyst.ca/
Prism	GraphPadソフトウェア		統計分析ソフトウェア