Method Article

高スループットコルティカル骨サンプルの採取と分析のための断面化、スコアリング、画像処理ガイド

DOI:

10.3791/61081

⸱

June 12th, 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

In This Article

Summary

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ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。

Abstract

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骨は、人間の寿命にわたって構造を変化させる動的で機械的に活性な組織です。骨のリモデリングプロセスの産物は、従来の二次元技術を用いて実質的に研究されてきた。デスクトップマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)およびシンクロトロン放射微小断層撮影(SRμCT)によるX線イメージング技術の最近の進歩により、他の3Dイメージング技術(例えば、SEM)よりも大きな視野(FOV)の高解像度3次元(3D)スキャンを取得することができました。ただし、データ分析に影響を与えるストリークアーティファクトの外観を制限するために、標本はFOV内で正確に中心に配置する必要があります。これまでの研究では、不規則な形状の直線的な骨ブロックの調達が報告され、エッジの不均一や画像切り捨てによるイメージングアーティファクトが発生しています。ヒトの女性の前側面からSRμCT実験用に一貫して大きさの皮質骨コア標本を調達するために、地質サンプリングプロトコル(スコア)を適用しました。このスコアリング方法は、効率的で、組織に対して最小限の破壊です。回転中に等角体であること、および走査中のX線ビームに均一なパス長を提供する性質によって、イメージングアーティファクトを減少させる均一な円筒形サンプルを作成します。X線の断層データの成形および不規則な形状のサンプルの画像処理は、皮質骨マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する技術の可能性を確認する。このプロトコルの目標は、さまざまなタイプの高解像度骨イメージング実験に適応可能な皮質骨コアの抽出のための信頼性と再現性のある方法を提供することです。この作業の包括的な目標は、手頃な価格で一貫性があり、簡単なSRμCTの標準化された皮質骨調達を作成することです。この手順は、生物人類学、地球科学、材料科学などの硬質複合材料を一般的に評価する関連分野の研究者によってさらに適応され得る。

Introduction

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近年のイメージング技術の進歩により、非常に高い解像度でX線イメージングデータを取得することが可能になりました。デスクトップマイクロCT(μCT)システムは、非破壊性の性質に起因する、消光骨を撮像するための現在の標準である1.しかし、皮質骨の微細構造特徴をイメージングする場合、μCTの使用はより限定的であった。解像度の制約により、デスクトップシステムは、骨細胞ラクナエのような皮質毛穴よりも小さい微細構造特徴を画像化するために必要な解像度を達成できません。このアプリケーションでは、SRμCTは、これらのシステムの解像度が高いため理想的です1.例えば、バイオメディカルイメージングおよび治療(BMIT)ビームライン2のカナダ光源(CLS)での実験では、ボクセルが0.9μmの小さな画像を生成しています。これまでの研究1、3、4、5は、この解像度を使用して、人間の長い骨(図1)からの皮質骨標本から投影とその後の3次元(3D)レンダリングを取得し、骨細胞ラクナー密度

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Protocol

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すべての標本は、トレド大学、医科生命科学部、ノースイーストオハイオ医科大学(NEOMED)のエンバーミングされた死体ドナーから、ドナー自身またはドナーの次の親族のインフォームド・コンセントを得て調達された。アクロン大学人間被験者保護のための機関審査委員会(IRB)は、これらの標本が生きている個人から調達されなかったため、完全なIRBレビューから免除されていると考えました。年齢、性別、死因などの人口統計情報は、すべてのドナーに提供されていました。選択された個体は、死亡時に骨改造に影響を与えた可能性のある骨影響状態や治療レジメンへの暴露を文書化していなかった。皮質骨サンプルは、19歳から101歳までの年齢を持つカダビリック現代男性および女性の女性の女性から得られた(平均= 73.9歳)。大腿部ミッドシャフトは、皮質多孔性20、21、22、23、24および骨組織25、26、27の材料密度の変動の検査を含む広範囲に研究されており、微小構造解析に一般的に使用される部位となっている。....

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Results

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コアサンプリングの記載された方法は、非常に効果的かつ効率的であることが判明しました。このプロトコルを使用した試料の採点は、1.49 μmボクセルサイズで約2mmのFOVを有するCLS BMIT-BMビームライン2での実験用に、一貫してサイズのサンプルを>300の調達に可能にした。コア直径の一貫性を検証するために、人間の前大腿心のサブセットの長さ(上、中央、下)に沿って3つの測定値を測定しました(n=69)。コアの平均直径は1.96±0.11mmで、コアの長さに沿った平均薄化は0.06±0.06mm/mm他の硬質複合材料への適用性を強調するために、この方法をドロマイト(n=32)のサンプルに対して試みたため、平均直径は1.06±0.02mmでした。コアサンプルの長さに沿って間引きは0.01±0.005 mm/mmとして記録されました。ステップ4.2.3で説明したように、硬化した試料とロータリーツールを用いて調達した1本(例えば、ドレメル)の画像処理ワークフローを比較した代表的な図は、図7に示.......

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Discussion

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限られたFOVセットアップで高解像度のSRμCTイメージング用の均一および円筒形皮質骨コアサンプルを調達するための包括的で標準化されたプロトコルはありませんでした。ここで詳述するプロトコルは、SRμCTイメージングのための一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法と、その後のマイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出に関する包括的なチュートリアルを提供することによって、その空隙を埋めます。我々のプロトコルは、任意の次元の直線的な骨ブロックを断面化する以前の記述よりも、皮質骨コアを調達するためのより標準化された信頼性の高い方法を提供することを示した。したがって、不規則な大きさの骨ブロックを除去するためにハンドヘルドロータリーツール(例えばDremel)に頼ってきた研究者は、イメージング中にサンプルセットアップ時間がはるかに長くなり、分析中の閾値および皮質毛穴抽出におけるより大きなエラーが発生した可能性が高い。この不一致は、骨サンプルの調製、その後の可視化と分析、および解釈結果に関するこの標準化されたプロトコルの必要性と重要性を強調しています。

ここで概説する手順は、生物人.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この論文に記載されている研究は、カナダイノベーション自然科学工学研究評議会、サスカチュワン大学、サスカチュワン州政府、カナダ西部経済多様化カナダ、カナダ国立研究評議会、カナダ保健研究所の支援を受けたカナダ光源のBMIT施設で行われました。著者らは、カナダ光源、特にアダム・ウェッブ、デニス・ミラー、セルゲイ・ガシロフ、寧ズーのビームライン科学者に、SkyScan SRμCTと白いビーム顕微鏡システムのセットアップとトラブルシューティングに協力してくれたことに感謝したいと考えています。また、トレド医科生命科学大学のベス・ダルツェルと、オハイオ州北東部医科大学のジェフリー・ウェンストルップ博士に感謝したいと考えています。JMアンドロノフスキは、アクロン大学と国立司法科学法医学研究所が提供するスタートアップ研究資金(2018-DU-BX-0188)を通じて支援されています。RAデイビスは、アクロン大学が提供する大学院助手によってサポートされています。採点および鋸で使用される装置および供給は、アクロン大学とNSFが、CW HolyokeにEAR-1624242を交付するスタートアップ資金によって購入された。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8 "合成物のための炭化物を切る戦士6181228.6mmの急落
70%のエタノールフィッシャー科学BP82015003.8リットル
鈍い先端の鉗子フィッシャー科学10-300
遠心分離管サーモフィッシャー55398
結晶結束509-3 エポキシテッドペラ821-3
CTAnalyserダウンロードして
https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html デンタルツールキットAmazonでインストール787269885110
複合材料用ダイヤモンドウェーハ鋸刃Buehler#11-4247
ドリルプレスジェットミル/ドリル350017モデル:JMD-15、ベンチトップドリルプレスは適切な代替品ですが、通常、ドリルステムの下にサンプルを配置するための翻訳可能な機械テーブルがありません
細い先端の鉗子フィッシャーサイエンティフィック22-327379
ミル/ドリル用XYマシンテーブル用固定クランプMSCインダストリアルサプライ#04804571
ガラス顕微鏡スライドテッド・ペラ2600575x50mmスライド、厚さ1mm
スライドガラスチャックBuehler#11248875x50mmのスライドを保持するのに十分な大きさ
140°に達することができるホットプレート;CThermoScientificHP88850105
インキュベーターNAPCOModel 4200
Isocut FluidBuehler111193032潤滑剤; 30mL
宝石商用ダイヤモンドコアリングドリルビットOtto Frei#119.050内径 2mm 中空ステムコアリングビット
NReconBruker microCTv.1.6.10.2https://www.bruker.com/products/microtomography.html でダウンロードしてインストール
振動鋸ハーバーフレイト62866
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ブルカーmicroCTv.1.15.4.0します

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al.

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