カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、プロテオームの適切な機能およびフォールディングを維持する細胞能力として定義される。プロテオスタシスに対する本質的な課題は、すべてのタンパク質が適切に折り畳まれ、天然の立体構造で維持されることを保証するものであり、タンパク質サイズ、アミノ酸組成、構造立体構造、安定性、ターンオーバー、発現、細胞区画化、および修飾の多様な性質によってさらに増幅^される。プロテオスタシスは、プロテオーム^2,3内で適切な合成、フォールディング、人身売買、分解を調節する約2000個のユニークなタンパク質からなる、大規模なプロテオスタティックネットワークの協調作用によって維持される。プロテオスタティックネットワークの働く馬の構成要素は、分子シャペロン⁴の9つの主要なファミリーである。すべての組織および細胞型は、分子シャペロンの特定のサブセットを優先的に利用し、おそらく異なるプロテオーム⁵の異なる要求と一致する。

正常な生物老化の特徴の1つは、細胞プロテオスタシスの進行性の衰退と崩壊であり、これは増加する年齢関連疾患の発症および進行の基礎であると考えられている。例えば、アルツハイマー病、 パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、それぞれ共通の特徴を共有する:神経変性の各症例において、変異タンパク質の凝集を起こす遺伝子変化(アミロイドβ/タウ、α-シヌクレイン、HTT、FUS/TBD-43/SOD-1、^{それぞれ)}.老化の間、タンパク質静電ネットワークの完全性と可分化性が低下し、細胞機能障害および神経変性をもたらすタンパク質毒性凝集体の蓄積をもたらす。なお、タンパク質立体構造疾患は、II型糖尿病、多発性骨髄腫、および嚢胞性線維症^{11、12、13、14}によって強調されるように、ニューロンに特有のものではなく、複数の組織にわたって起こる。したがって、プロテオスタシスを保存することができるメカニズムを解明することは、疾患の治療のための標的介入の開発を促進し、健康な老化を促進する。

小さな土壌線虫カエノハブディティス・エレガンス(C.エレガンス)は、遺伝子の発見とプロテオスタシスを変える経路の解明に役立っています。プロテオスタシスを調節するタンパク質増殖ネットワークやシグナル伝達経路の多くの構成要素は進化的に保存されています。さらに、C.エレガンスは脊椎動物システムに比べて複雑さと冗長性を低下させ、遺伝子解析や遺伝子発見をより容易にしています。プロテオスタシスを研究するモデルシステムとして広く使用されているC.エレガンスの追加の利点は、強力な遺伝的および機能的ゲノミクス、短いライフサイクル(3日間)と寿命(3週間)、コンパクトでよくアノテられたゲノム、遺伝子変異体の幅広い品揃えの入手可能性、および蛍光レポーターを使用した細胞における組織特異的変化の視覚化の容易さである。

老化時のプロテオスタシスの進行性の崩壊は、C.エレガンスで容易に定量することができる。森本研究室は、黄色蛍光タンパク質(polyQ::YFP)に融合したポリグルタミン拡張が、加齢^{15、16、17、18}の間にC.エレガンスのタンパク質帯電性低下を定量化するために使用できることを最初に実証^した。YFP融合は35グルタミンに繰り返し、または細胞病理の徴候と共に蛍光病巣の年齢関連形成をもたらす。注意すべきは、グルタミン拡張のこの範囲は、ハンチントン病理がヒトで観察され始めるハンチンチンタンパク質のポリグルタミン管の長さを鏡像化する(典型的には>35 CAG反復^)19。筋肉、腸、または神経細胞の中での筋肉、腸、または神経細胞の中でのYFP株は、異なる細胞および組織の種類にわたってプロテオースタシスの年齢関連の低下が起こることを確認するために利用されてきた。筋肉特異的ポリQ::YFP発現(すなわち、unc-54p::Q35::YFP)は、蛍光病巣の蓄積が単純な蛍光解剖顕微鏡を使用して成人期の最初の数日間にわたって定量化しやすいため、組織特異的なレポーターとして最も広く使用されています(図1A-1B)。さらに、動物は中年期に麻痺し、レポーターのタンパク質毒性効果により筋肉内のプロテオームが崩壊する(図1C)。同様に、神経細胞質分解の年齢関連の低下は、動物を液体に入れた後の協調体曲げにおける病巣/凝集体形成および加齢に伴う減少を直接定量することによって(rgef-1p::Q40::YFP)に従うことができる(図2)。

ここでは 、C.エレガンスにおける神経および筋肉組織内のポリグルタミン反復の発現によって誘発されるタンパク質凝集体蓄積および関連するタンパク質毒性の年齢依存性進行を測定する方法に関する詳細なプロトコルを提示する。これらの菌株や方法を用いて生成される代表的な結果の例を提供します。また、これらの手法を活用して、プロテオスタティックネットワークの転写制御を研究する方法を紹介します。我々は、これらのレポーターが他の既存の試薬と容易に統合されるか、またはより大きいスクリーンのために適応することができる付加的な方法を議論する。

1. 試薬の調製

1. 摂食ベースのRNAiを介して不活性化される目的の遺伝子を選択する。目的のRNAiクローン²⁰を含むHT115大腸菌の株式を購入する。あるいは、対象遺伝子のcDNAをL4440プラスミドのマルチクローニング部位にサブクローニングする。
   注:細菌内のdsRNAの分解を防ぐために、HT115株を使用してください。これは、IPTG誘導性T7ポリメラーゼ活性を有するRNase III欠損 大腸菌 株である。摂食ベースのRNAiを使用しないプロテオスタシス研究では、標準NGMプレート上のHT115またはOP50 大腸菌 を使用することができます。
2. 試験条件ごとに5 x 6 cmのプレートを準備します。RNAiを用いた実験の場合、変換されたHT115 大腸菌でdsRNA産生を誘導する。RNAiを使用しない研究では、標準NGMプレート上のOP50 大腸菌 を使用することができます(標準NGMおよびRNAiプレートのレシピについては 、補足ファイル1 を参照してください)。
   注:RNAiプレートは、細菌で播種する前に、数ヶ月間4°Cで保存することができます。
3. 大腸菌の培養物を一晩(16-20時間)に37°Cで220rpmで振る培養器で培養する。アンピシリン(50 μg/mL)でルリアブロス(LB)でHT115大腸菌を成長させる。
   注:標準的なOP50 大腸菌 は抗生物質耐性ではありませんが、ストレプトマイシン耐性変異体も利用可能です。
   1. ベンチトップ遠心分離機で15〜20分間2,400 x gで遠心分離して細菌を濃縮し、上清を吸引し、皮素を再懸濁して、HT115のアンピシリンを伴うLBの開始量(すなわち、10倍の濃度)、または標準的なOP50の場合はアンピシリンを含まないLBを1/10thに再び懸濁させる。
   2. 各プレートに濃縮された10x細菌のアリコート200 μL(3-4は、汚染の場合に使用される2つの余分なバックアッププレートを有する、試験条件ごとに複製する)。
   3. すべての液体が吸収されるまで層状流れベンチなどのクリーンな環境で開いたプレートを乾燥させるか、または覆われたプレートをラボベンチで一晩乾燥させます。
4. 播種したRNAiプレートをフードで乾燥させた場合は、室温で一晩(最大24時間)、ウォームボックス内に乾燥プレートを保管します。RTで1日後、プレートは密閉された袋に最大2週間(プレートが乾燥するのを防ぐために)4°Cで保存することができます。使用前に、4°Cで保管されたプレートをジップロックバッグ内の室温に戻し、凝縮が空中真菌汚染を導入するのを防ぎます。
   1. 摂食ベースのRNAiを使用する場合は 、C.エレガンス を添加する前に少なくとも12時間室温でRNAiプレートに播種したHT115細菌を残します。RNAiプレートには、dsRNA産生を誘導するIPTGが含まれています。あるいは、IPTGは、播種の2時間前に、ステップ1.3.1の終了時に液体培養物に添加することができる。
   2. C.エレガンスが寒天に穴を開ける原因となる寒天の割れを避けるために、常温(数日以上)での播種HT115プレートの長期保存を避けてください。

2. C.エレガンスの同期

注:グラビッド成人または卵の産卵のアルカリ次亜塩素酸処理のいずれかによって C.エレガンス を同期させるかどうかを選択してください。

1. 動物の次亜塩素酸処理により動物を同期させて、胚²²の放出を促進する。
   1. 次亜塩素酸処理の場合、M9バッファーでグラビッドヘルマフロダイトを2回洗浄し、5 mL次亜塩素酸溶液(3.25mLの次亜塩素酸溶液、1 mLのM9緩衝液、5 MMNaOHの0.75 mL)で5分間再懸濁し、毎分動物を振盪します。5分後、動物をスピンダウンし、M9バッファで3回洗浄します。
      注:次亜塩素酸処理は、プロテオスタシス²¹に影響を与えることを示唆している。
   2. 次亜塩素酸処理後、胚が20°Cで回転してM9溶液の3mLで一晩孵化することを可能にする。
   3. L1溶液3xの10μLを6cmプレートに落とし、L1動物の数を数えてμL当たりのL1動物の平均数を計算することによって、μL当たりのL1動物(または代替的に胚)の密度を計算します。したがって、定期的に沈降を避けるためにL1溶液を混合する。
   4. 種子50 L1動物をプレートあたり、数をカウントして、播種数を記録し、プレートを20°Cインキュベーターに移動させます。アッセイの開始時に各プレート上の動物の実際の数を知ることが重要です。
      注:M9での一晩の孵化によってL1の動物を同期させることは、動物を食物に置いた後の発達の不均一性を最小限に抑えるため、日常的に使用されます。しかし、同期は飢餓の手掛かりに応じて発達的逮捕によって起こり、一部の研究では避けるべきである(追加の議論については²³ を参照)。別の方法として、大まかに同期した動物は、卵子を介して得ることができる、2.2を参照してください。
   5. 残ったL1動物を液体窒素または-80°Cの冷凍庫に凍結して保管します。このようにして、実験時の各菌株のサンプルが保存され、将来の研究のための貴重な資源を創出し、再現性を向上させる。
      注:次亜塩素酸塩とM9ソリューションのレシピについては、補足ファイル1を参照してください。
2. 卵の産卵を介して動物を同期させるには、20匹の若いグラビッド成動物(成人期の1日目)を各プレートに4〜6時間置き、1皿あたり約50個の卵が入るまで卵を産ませる。すべてのグラビド大人を削除し、20°Cインキュベーターに卵とプレートを移動します。
   注:大人の動物は成人の初日に同期する必要があります。古い動物は、子宮に保持されている卵を産み、より高度な発達段階にある卵の放出を引き起こす可能性があります。

3. プロジェニー生産

注: 子孫の生産を防ぐか、同期された開始母集団を子孫から分離する手順を実行する必要があります。前生産生を防ぐことは、ここで説明するプレートに5-Fluoro-2'-デオキシウリジン(FUdR)を添加することで化学的に達成することができる。いくつかの研究は、FUdRがプロテオスタシス^24、25を変更することができることを報告しています。子孫の生産を防ぐための代替アプローチは、以下で説明します。

1. FUdRの1 gを超純粋なH_{2 O.}フィルターの10 mLに溶解して、FUdRの1000xストック溶液を作り、0.2 μmフィルターと10 mLシリンジでストックFUdRを殺菌します。アリコート1 mLの在庫を無菌1.5mLチューブに入れ。凍結し、-20°Cで保存します。
2. L4段階まで20°Cで動物を成長させる。次亜塩素酸処理から同期L1から飼育されたN2動物は、L4に到達するために20°Cで約40時間の成長を必要とします。他の株の成長速度は、実験の前に経験的にテストする必要があります。 正確にC.エレガンス をステージングする方法の詳細については^、26を参照してください。
   1. L4動物を持つ各6 cmプレートに、80x FUdRの100 μLを加えます。L4 段階で FUdR を追加することが重要です。
3. プレートをワームボックスに戻し、その箱をジップロックバッグに入れます。適切なインキュベーターに戻す。

4. ポリグルタミン発現動物を用いた筋肉組織のプロテオスタシスの減少の測定

注:筋肉細胞のプロテオスタシスの減少を同定する方法は、老化時のタンパク質凝集体の形成を画像化し(4.1)、麻痺の発症を通じてこれらの凝集体が引き起こすタンパク質毒性を測定する(4.2)。。

1. 老化時の筋肉のポリグルタミン凝集体形成のイメージング
   注:筋肉細胞におけるタンパク質凝集の年齢依存性の進行は、黄色の蛍光タンパク質(YFP)に融合したポリグルタミン(polyQ)を使用して繰り返し画像化されます。このプロトコルは、株AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP]の使用を概説しますが、他のポリグルタミン変異株も使用することができます。 ポリQ::YFP トランスジーンは 、筋肉特異的に54筋 特異的プロモーターを用いて筋肉で発現する。同期した UNC-54p::p olyQ:::YFP 発現動物は成人期の1日目、2日目、3日目、4日目に視覚化されます。 54p::p olyQ::YFP 凝集体を可視化するには、蛍光用の化合物顕微鏡または蛍光解剖顕微鏡を使用してください。AM140は、カエノアハブディティス遺伝学センター(CGC)から入手可能です: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
   1. イメージングの日(成人期の1日目、2日目、3日目、4日目)に、20匹の動物を選び、3%のアガロースパッドと10mMナトリウムアジド(M9バッファで希釈)の5μLドロップで顕微鏡スライドセットアップに取り付けます。
   2. すべての動物がアジドナトリウム(〜5分)で固定化された後、10倍の拡大レンズを使用して動物の全身を画像化する(図1A)。イメージングには、FITCフィルターと同じ露出を使用して、すべての動物に対して。イメージング後にスライドを破棄します。
      注:あるいは、YFPの病巣はプレート上で直接定量することもできますが、スコアリング中に二酸化炭素の流れをプレートに塗布することで動きを抑制する必要があります。この代替方法は、多数の条件をスクリーニングする場合に最も適しています(詳細については、説明を参照)。
   3. 画像の取得後、動物全体の体壁筋の病巣数をカウントします。Fociは、バックグラウンドで調光可溶性信号と区別することができるより明るい句読点信号である。
   4. 日1、2、3および4からのYFP病巣蓄積の進行をプロットする。X が成人期の日を表し、Y が unc-54p::p olyQ::YFP 病巣 (図 1B)の数を表す XY グラフをプロットします。実験条件における病巣の数(例えば、遺伝子の制御下または過剰発現)は、制御動物と比較される。各試験で観察された各時点でグループ間の統計分析を行います。
      1. 2つの条件に対してのみ病巣数を比較する場合は、各時点で独立したサンプルt検定を実行します。
      2. 3 つ以上の条件について病巣数を比較する場合は、その時点でのすべての条件のデータを含む、各時点のオムニバス一方向 ANOVA 分析を実行します。オムニバス ANOVA が有意な p 値(p < 0.005)を生じる場合は、ペアワイズ独立サンプル t 検定を使用して 事後 分析を実行し、病巣の有意な差が検出された特定の条件を決定します(例えば、A、B、C のグループ A、B、B と B と C を比較します)。
2. 筋肉細胞におけるポリグルタミン毒性の代理として動物の麻痺率を測定する
   注: 筋肉の polyQ 凝集体の年齢依存性の増加は、運動を駆動する筋肉機能の低下を引き起こします。この移動性における欠陥は、ポリQ発現動物における進行性の麻痺率を測定することによって測定することができる。麻痺アッセイの場合、同期した UNC-54p::p olyQ:::YFP 発現動物は成人期の3日目、5日目、7日目、9日目に採点される。必要に応じて、スコアリング範囲を拡張するために、遺伝的摂動の影響を評価できるように、追加のタイム ポイントを追加します。
   1. 採点日(成人期3日目、5日目、7日目、9日目)には、50匹の動物を含む6cmプレートを見て、麻痺した動物の数を記録します。プレートから麻痺した動物を取り除きます。動物が皿から這い落とされた場合、または死んだ場合、彼らは検閲されるべきです。イベントを記録して、分析で考慮できるようにします。
      注:動物は、光や穏やかなタッチ刺激にさらされた後に動きが見られないと麻痺していると考えられます。咽頭ポンプ活動は、動かない動物が生きているか死んでいるかを判断するために使用されます。
   2. 実験が完了したら、各条件の麻痺率を計算します。この時点で、麻痺した動物の割合を、その時点でその状態で観察された動物の総数で割ることによって行います。時間ポイントごとに条件ごとに複数のプレートを観察する場合(すなわち、プレートを複製する)、各反復ごとに比率を計算します。
   3. XYグラフ(散布図)で麻痺率の進行をプロットします。Xは成人期を表し、Yは麻痺率を表す。 54p::p olyQ:::YFP 動物の麻痺率は、コントロール動物と比較されます(図1C)。グループ間の統計分析を実行します。複数の試験の場合は、個別に試験を扱う。Cox比例ハザード回帰とウォルド検定を使用します。生存解析をサポートするデータ解析ツールのほとんどは、Cox モデリングもサポートしています。
      1. データの変換: 各条件には、時間と "event" の 2 つの列を含める必要があります。観察された各時点で、各麻痺動物に対して「0」の行を追加し、各検閲動物に「1」を追加します。行の合計数は、その条件のプレート上の開始動物の数と等しくする必要があります。
      2. 統計的ソフトウェアの指示に従って、Cox比例ハザードモデリングを実行し、続いてWald検定を実行します。一般的な実験計画には、単変量モデルが適しています。3 つ以上の条件の場合、すべての条件を含むテストが有意な結果 (つまり、p < 0.005) を示す場合、条件間のペアワイズテストを実行して、特定の有意な条件ペアを決定できます。
         注: Cox モデルは、テスト条件が時間の経過に比例して事象の確率を変調するという仮定に依存しています。これは、例えば、Coxモデルは、ほとんどの動物が1日目に麻痺している状態と、ほとんどの動物が9日目に麻痺している状態とを比較するのには適切ではないことを意味します。Coxモデルの拡張、および各時点で麻痺した比率を比較するための他のアプローチは、比例ハザード仮定が保持されない場合に利用可能である^{、27、28、29、30を}参照。

5. ポリグルタミン発現動物を用いて、神経組織におけるプロテオスタシスの減少を測定する。

注:2つの相補的な方法は、老化の間にタンパク質凝集体(蛍光病巣)の形成を定量化することによってニューロン(1)のプロテオスタシスの減少をアッセイし、(2)運動ベースのアッセイを介してニューロンプロテオームの年齢関連の低下を測定することによって使用される。

1. 老化時のニューロンにおけるポリグルタミン凝集体形成のイメージング
   注:筋肉組織で既に議論されているアッセイと同様に、ニューロンにおけるタンパク質凝集の年齢依存性の進行は、rgef-1の汎ニューロン組織特異的プロモーターによって駆動されるポリQ:::YFP融合タンパク質を発現させることによって画像化される。具体的には、AM101:rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP]、YFP¹⁶に40のグルタミン融合を使用しています。rgef-1p::p olyQ:::YFPを可視化するには、40 倍の拡大レンズを使用して蛍光を実現する複合顕微鏡を使用します。AM101はCGCから入手可能です: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
   1. イメージングの日(成人期の4日目、6日目、8日目、10日目)には、20匹の動物を摘み取り、5μLのアジドナトリウム(M9バッファーで希釈)の3%アガロースパッドを含む顕微鏡スライドに取り付けます。
   2. すべての動物がアジドナトリウム(〜5分)で固定化された後、40倍の拡大レンズを使用して動物の頭部のzスタック画像を撮る(図2A)。イメージング後にスライドを破棄します。
   3. 画像の取得後、zスタックを処理して最大の投影を取得し、神経環領域に位置するニューロンの病巣数を定量化します。Fociは、バックグラウンドで調光可溶性信号と区別することができるより明るい句読点信号である。
      注:ほとんどのニューロンがシナプス接続を行うために収束する領域であるため 、rgef-1p::p olyQ::YFP 凝集体を定量化するために神経リング領域を具体的に選択しました。しかし、運動ニューロンの凝集形成レベルを測定するために 、rgef-1p::p olyQ:: 側側神経または腹側神経コード上に位置するYFP凝集体を定量化することができる。
   4. D4、D6、D8、D10からのYFP病巣蓄積の進行をプロットします。X が成人期の日を表し、Y が rgef-1p::p olyQ::YFP 病巣 (図 2B)の数を表す XY グラフでこれを行います。実験条件における病巣の数(例えば、遺伝子の制御下または過剰発現)は、制御動物と比較される。ニューロンの病巣数の統計分析は、筋肉ポリQ病巣と同じ方法で行われます。ステップ 4.1.4 および関連するメモを参照してください。
2. ニューロンにおけるポリグルタミンタンパク質毒性の代理尺度として身体が曲がる測定。
   注:ニューロンポリQの進行性凝集集から誘導されるタンパク質毒性ストレスは、スラッシングアッセイを通して運動ニューロン欠損を見ることによって決定されます。M9生理学的緩衝液(補足ファイル1)に懸濁しながら30秒の期間で身体の曲がりの数を定量化する。
   1. 成人期の2日目に、プレートから10匹の同期動物を選び、顕微鏡スライドのM9バッファの10μLドロップに置きます。40匹以上の動物のサンプルを得るために、このステップを少なくとも4回繰り返します。
   2. ビデオカメラで実体顕微鏡で30秒の期間M9バッファの10 μLで顕微鏡スライドに置かれた10匹の動物の動きを記録します。サンプル数の合計 40 回、この手順を 4 回繰り返します。ズームと位置は、すべての動物がフレーム内で30秒間表示されるように調整する必要があります。
   3. 分析対象の動物とすべてのビデオが記録されたら、ビデオを再生し、各動物の体の曲がりのスコア。1つの身体の曲げは、動物の外陰部が片側から反対側に向かい、開始位置まで戻るときと定義されます。
      注:私たちは、野生型の動物は、通常、30秒で49±0.79ボディベンドを持っていることを発見しました。
   4. 各ドットが X 軸でテストされたさまざまな条件で 30 s (Y 軸) のボディ ベンド数を表す縦棒グラフで、各動物のボディ ベンド数をプロットします。制御動物と比較して 、54p::p olyQ::YFP 動物の身体曲げ数を比較する(図2C)。各試験のためにグループ間の統計分析を個別に行う;アッセイが複数の時点で繰り返される場合は、各時点でデータを個別に分析します。
      1. 2つの条件のみを考慮する場合は、独立サンプルt検定を実行します。
      2. 一度に複数の条件を考慮する場合は、まず、そのタイムトライアル/タイムポイントのすべての条件のデータを含むオムニバス一方向ANOVA分析を実行します。オムニバス ANOVA が有意なp値(すなわち、p < 0.005)をもたらす場合は、ペアワイズ独立サンプル t 検定を用いて 事後 分析を行い、ボディベンド数の有意差が検出された特定の条件を決定します。

C.エレガンスでは、ポリグルタミン反復モデルは、タンパク質静力学ネットワークを調節する遺伝子の同定に役立っています。例えば、我々は以前に、ホメオドメイン相互作用タンパク質キナーゼ(hpk-1)が、転写補因子であり、オートファジーおよび分子シャペロン31の発現を調節することによって老化中のプロテオスタシスに影響を及ぼすことを示した。我々は、RNAiサイレンシングまたはhpk-1(pk1393)ヌル変異動物のいずれかでhpk-1の喪失が、老化の間に蓄積されるQ35::YFP集合体の数を増加させることがわかった。2日目の成体対照動物は18.0±2.7集合体を表示し、hpk-1(pk1393)ヌル突然変異体とhpk-1 RNAi処理Q35:::YFP動物はそれぞれ平均28±5.3および26.0±5.1集合体を示した(図3A-D)。同様に、成人期の8日目までに、hpk-1(RNAi)およびhpk-1(pk1393)の77~78%が麻痺し、対照Q35の50%::YFP動物が麻痺した(図3E)。さらに、hpk-1のユビキタス過剰発現はQ35の数を減少させるのでHP-1のタンパク質凝集体形成を調節するのに十分である::筋肉組織のYFP病巣はQ35から::YFP-老化の間の麻痺に関連する(図3E)。これらの結果は、HPK-1がプロテオスタシスを調節し、ポリQ::YFPモデルを老化中のプロテオスタシスの変化の逆遺伝子解析にどのように利用できるかを強調していることを示している。

図1:ポリQの発現::C.エレガンス筋内のYFPは、老化時に進行性の病巣蓄積および麻痺をもたらす。(A) C. エレガンス unc-54p::Q35::成人期の 1 日目と 4 日目の YFP 発現 (それぞれ上下パネル)。矢印は代表的な病巣を示す。(B) 成人期の最初の4日間における蛍光病巣の定量化。Fociは不溶性の蛋白質集合体と一致するFRAP15、32、33に対して抵抗力がある。誤差範囲は、平均(SEM)(C)の標準誤差を表し、54p:::Q35:::YFP動物は老化時に麻痺する。誤差範囲は、比率の標準誤差を表します。(B-C)の生データは補足表 1に示されています。スケールバーは、すべてのパネルで100 μmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:C.エレガンスニューロン内のYFPの発現は、正常な身体の曲がりの進行性病巣蓄積および破壊をもたらす。(A, 上) C. エレガンス前部のDIC画像.咽頭は、180ニューロンの相互接続されたクラスターである神経環に囲まれた動物の頭部の二LOB構造である。赤い括弧は、頭部ニューロン内の病巣をスコアする領域を示す。(A, 中央)rgefp-1::Q40::YFPは成人期の2日目蛍光を発する。YFP 式は、時折集計(矢印)を除いて、大部分が拡散されることに注意してください。(A, 下)rgefp-1::Q40::YFPは成人期10日目の蛍光を発する。フォシ/集計が示されています(赤い矢印)。(B) 成人の最初の10日間における蛍光病巣の定量化Fociは不溶性の蛋白質集合体と一致するFRAP15、32、33に対して抵抗力がある。誤差範囲は、平均の標準誤差を表します(C)野生型およびrgef-1pの身体屈曲の典型的な周波数:::YFP動物は、成人期の2日目に空のベクトルRNAi(L4440)に20°Cの給餌で維持される。増加したグルタミンの膨張は、移動欠陥15と相関する。誤差範囲は平均の標準誤差を表します。(B-C)の生データは補足表 1に示されています。スケールバーは、すべてのパネルで20 μmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:HPK-1はプロテオスタシスを促進する。(A-C)hpk-1活性は、Q35:::筋肉細胞におけるYFP病巣の蓄積に影響を与える。示されているPunc-54::p olyQ::YFP動物の代表的な画像は、(A)コントロールRNAiまたは(B)hpk-1RNAi、および(C)hpk-1を過剰に発現するトランスジェニック動物(Psur-5::HPK-1:CFP)で処理された。 (D) ポリQの時間経過::YFP病巣蓄積と連動: コントロールRNAi (黒丸) 、hpk-1 RNAi (白い円) (白い円) (白い四角形) 、またはhpk-1過剰表現 (オープントライアングル) との治療。 データポイントは、生物学的複製ごとに少なくとも15匹の動物の平均±標準偏差(S.D.)を表示します。少なくとも5つの独立した実験が行われた。(E) Punc-54::p olyQ::YFP動物の麻痺の時間経過:コントロールRNAi(黒丸)、hpk-1 RNAi(白い円)、hpk-1(pk1393)(白い正方形)、またはhpk-1過剰発現(オープントライアングル)と組み合わせた治療。プロットされたデータは、1つの代表的な試用の結果を表示します。この図は、クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション(CC BY)ライセンスを介して許可を得て、リファレンス31から転載されています。スケールバーは、すべてのパネルで100 μmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:結果の生データ 表には、 図 2 および図 3 の病巣、麻痺、およびボディ ベンド データが 含まれます。 こちらの表をダウンロードしてください。

補足ファイル1:ルーチン C.エレガンス 作業のための一般的な試薬。 一般的な試薬には、様々な種類のプレートとバッファーを調製するためのレシピが含まれます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。