マウスの心臓移植のためのカフ技術の最適化

サマリー

マウス子宮頸部異所性心臓移植のためのカフ技術にインナーチューブアプローチを導入し、カフ上の血管をエバートするのに役立ちます。我々は、2人の経験豊富な外科医間の協力が著しく手術時間を短縮することを発見した。

要約

マウス心臓移植は40年以上行われてきた。マイクロサージャストの進歩に伴い、外科的効率を向上させるために特定の新しい技術が使用されています。私たちの研究室では、2つの主要なステップでカフテクニックを最適化しました。まず、内部管技術を用いて、外的頸静脈および頸動脈血管に一時的な内管を挿入し、カフ上の血管の切開を容易にした。第2に、2人の経験豊富な外科医の協力を通じて、完全な異所性心臓移植を行った。これらの変更により、運用時間が25分に短縮され、成功率は95%となりました。このレポートでは、これらの手順を詳細に説明し、補足ビデオを提供します。この改善されたカフ技術に関するレポートは、マウス異所性心臓移植のための実用的なガイダンスを提供し、基礎研究のためのこのマウスモデルの有用性を高めると信じています。

概要

1973年に腹部内のエンドツーエンド吻当を介したマウス異所性心臓移植の確立は、基礎移植免疫学研究¹における大きなマイルストーンであった。このモデルは、虚血再灌流傷害^2、免疫不全、および許容範囲^33、44のメカニズムを分析するための重要かつ有効なツールを提供した。しかし、複雑で時間のかかる手術の性質と感染症の可能性は、重度の周術期腹部癒着および炎症反応をもたらし、異所性心臓移植モデルの効率が低い結果をもたらす。

子宮頸部異所性心臓移植技術は、1991^年5年に陳によって最初に記述された。このモデルでは、レシピエントの外部頸静脈は移植片の肺動脈に吻着され、頸動脈は上昇大動脈に吻着される。この方法の主な利点は、モニタリングの利便性とレシピエントへの外傷の軽減である。同年、松浦は改良された技術を説明し、外的頸静脈と頸動脈の末端をテフロンカフ上にエバートし、周縁絹合字⁶で固定した。一部の研究者はまた、レシピエント7の外部頸静脈に袖口を挿入する前に、ドナー心臓の右肺動脈にカフを固定^した。これまでカフ技術は、肺^8、肝臓^9、腎¹⁰移植を含む様々な血管ペディクル移植モデルに広く適用されてきた。

現在までに、カフ技術に関連するいくつかの困難があります。例えば、頸動脈は、追加の弾力性のためにカフ上にエバーリングすることが困難であり、その結果、組織は後方に反転する。したがって、このステップを完了するには、追加の練習と微小拡張器が必要な場合があります。さらに、子宮頸部の容器の準備は25分までかかる場合がある。

これらの問題を解決するために、カフ技術に基づく内側チューブ技術を導入し、血管壁の発流に役立つ内側のチューブを使用して外部頸静脈および頸動脈のカフを固定することを含む。また、簡単なトレーニングでは、受講者の準備は15.5分に短縮されます。この技術は、操作の複雑さを軽減し、追加の練習や血管拡張器の使用を必要としません。すべての移植免疫研究において適用することができ、特にレシピエントが2つの心臓同種移植片を受け取る第三者の免疫寛容を検証するために、1つは腹部内、もう1つは頸部¹¹に適用できる。また、2人の熟練した外科医の間で協力してこのモデルを確立し、一方の外科医がレシピエント動物を準備し、もう1人の外科医がドナー心臓を収穫して移植することを推奨する。このようなコラボレーションにより、操作時間を25分に短縮できます。この最適化された手順を使用して、我々は、同種異系、同種異^,系^{12、13、14、15、16、17、18、19、,13,}および異種マウス心臓移植モデル²⁰を確立しました。^{14,15,16,17,1819}

内部チューブ技術の開発の根拠は、マウス心臓移植モデルの確立のための運転時間を高い成功率で短縮することであった。子宮頸部心臓移植モデルの最適化は、従来の縫合糸およびカフ技術²¹と比較して、短期間の手術時間における高い成功率の獲得を促進する。また、協調モデルは、単一のオペレータで行われる手術と比較して、ドナー心臓の温かい虚血時間をさらに短縮することができる。

プロトコル

動物(BALB/c、C57BL/6、オス、8-12週)は、厦門大学実験動物センターの特定の病原体のない施設に収容されています。C57BL/6は受領者として使用され、BALB/cはドナーとして使用される。すべての手順は、制度的動物管理使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って行われます。

注:マイクロシザー、マイクロストレート鉗子、マイクロ湾曲鉗子およびマイクロ針のホールダーを含む微小外科の器械のセットは操作のために必要である(テーブルおよび材料、図1、B、D、E)。シングルユースブルドッグクランプ(図1F)が1組必要です。外的頸静脈および頸動脈のための2つの袖口は顕微鏡の下のNo.10メスでカスタマイズされたポリアミド管を切断することによって準備される。静脈と動脈カフの直径はそれぞれ0.9mmと0.55mmです。また、対応する静脈カフ用のインナーチューブの直径は0.6mmであり、対応する動脈カフ用のこれらの内管の直径は0.28mmである(図1G)。

1. 受取人の準備

1. ペントバルビタール(60mg/kg、i.p)でレシピエントマウスを麻酔します。右横頸部領域で毛髪を除去するために、外傷性の機械的なバリカンを使用してください。
2. 滅菌綿の先端アプリケーターを使用して、ヨウ素消毒剤で手術領域を拭き、その後70%エタノールを使用します。
3. 操作プラットフォームの上のsupineの位置にマウスを置きます。無菌ガーゼでマウスを覆います。
4. 眼科用はさみを使用して、下半角の首の中線から右肩鎖骨関節への横断切開を行います。
5. 右外部頸静脈をマイクロ湾曲した鉗子で分離して十分な長さを露出させ、電気凝固によって枝を切り落とし、6-0シルク縫合を使用して遠位端で容器をリゲートする。
6. ブルドッグクランプを使用して外部頸静脈を近位でクランプし、マイクロハサミを使用して静脈を合字に近似してトランセクトします。
7. 100 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理満液で容器の内腔を洗浄し、残留血液を除去します。
8. マイクロストレート鉗子を使用して静脈カフを通して外部頸静脈を引っ張る;静脈の内側のチューブをステントとして管腔に挿入し、マイクロストレート鉗子でカフの上に血管壁をエバーする(図2A)。
9. 周回8-0を使用してカフの近位端にエバートされた容器内皮を固定する絹糸縫合(図2B)。
10. 静脈容器から静脈の内管を引き出すためにマイクロストレート鉗子を使用しなさい。
11. 微小湾曲した鉗子で鈍い解剖を行い、胸膜内端に隣接する右頸動脈を分離する。
12. ブルドッグクランプを使用して右頸動脈を近位にクランプし、6-0シルク縫合糸を使用して頸動脈を遠位にリゲートし、マイクロハサミを使用して頸動脈を合字に近似して転写する。
13. 100 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理生理で頸動脈を洗浄し、残留血液を除去します。
14. 頸動脈を動脈カフを通し、マイクロストレート鉗子を用いて動脈内管を動脈血管に挿入する(図2C)。
15. マイクロストレート鉗子を使用してカフの上に容器をエバーン;周回8-0を使用して、エバートされた船内皮を固定するシルク縫合糸(図2D)。
16. マイクロストレート鉗子で動脈血管から動脈内管を引き出す。
    注: 受信者の顎腺を保持します。

2. ドナー準備

1. ペントバルビタール(60mg/kg、i.p)でドナーマウスを麻酔します。外傷性の機械的なバリカンを使用して、腹部の毛髪を除去します。
2. 操作プラットフォームの上のsupineの位置にマウスを置きます。無菌ガーゼでマウスを覆います。
3. 滅菌綿の先端アプリケーターを使用して、ヨウ素消毒剤で手術領域を拭き、その後70%エタノールを使用します。
4. 眼科はさみで腹部中線切開を行い、腹腔を露出させる。
5. マイクロカーブした鉗子を使用して下の静脈を露出させ、下の大静脈を通して体重当たり200 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理生理生理の200 μLを静脈内に注入する。
6. 眼科はさみで胸部切開術を行い、両側の中軸線切開部を通して肋骨を切断し、胸部壁の外側を裏返して胸腔を露出させる。
7. マイクロ湾曲した鉗子で胸腺を切り物にする。
8. 大動脈を露出し、大動脈弓を通して100 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理生理生理の200 μLを大動脈に浸透させた。
   注:ドナーの心臓に気泡を浸透させないようにしてください。
9. マイクロハサミを使用して、大動脈弓の始めに上昇大動脈をトランセクトします。
10. マイクロはさみで2つの主要な枝の始まりの肺動脈を移す。
11. 6-0シルク縫合糸を使用して上の大静脈と下の大静脈を近接してリゲートし、マイクロハサミを使用して合字に遠位静脈をトランセクトします。
12. 肺静脈を一緒にリゲートし、周回、単一の6-0シルク縫合糸を使用し、マイクロハサミを使用して合字に遠位に静脈枝を切断する。
13. 周囲の軟部組織から心臓移植片を除去する;0-4 °Cのヘパリン化生理焼失分に保存してください。

3. 心臓移植

1. ドナーの心臓を、受取人の右首領域に逆さまに置きます。
2. ドナー心臓の肺動脈をマイクロストレート鉗子で6-0シルクループに入力します。
3. 静脈の袖口のまわりで容器のルーメンを包み、次に袖口のまわりの6-0絹の縫合ループを締めて容器の接合をバンドにする。
4. ステップ3.2に記載のステップに従って、移植片および動脈カフの大動脈の吻合を行う。
5. クランプされた頸静脈を解放し、その後にクランプされた頸動脈を解放する。血管関節をねじれずに保ち、血流が妨げられないようにします。
   注意:1分で200回以上戻る大線のリズムは正常と見なされます。
6. 温かい(37°C)生理を使用してドナー心臓を湿らせ、移植片が出血しているかどうかを検査する。脈動する心臓移植片を皮下腔にセットし、切開を縫合する。

4. 術後ケアと移植片の評価

1. 正常な正常なしなじりリズムまでの時間と、クランプ解放後少なくとも5分間正常な正常な正常な正常なしなじりのリズムの保存を記録して、術後移植機能を監視する。
2. レシピエントが麻酔から目を覚ますまで、レシピエントを暖かい毛布の上に一人で置きます。ブプレノルフィン鎮痛、0.05mg/kg、s.c、手術終了時、手術後72時間ごとに12時間ごとに投与する。
3. 毎日、受取人の体重と術後回復状態を記録します。手術日に比べて>15%の体重減少の場合、片麻痺性麻痺、または感染は、末期イオブルラン吸入²¹を介してレシピエントを安楽死させる。
4. 毎日触診によって移植片の生存を監視する。マウス同種移植片が72時間生存した場合、手術は成功すると考えられる。前に報告したように、グラフト機能をグレード²²: スケール 3 - 激しく脈動と周波数;スケール2 - 少ない脈動;スケール1 - 細動と差し迫った拒絶;またはスケール - 0、心臓の鼓動の損失と完全な拒絶反応。

結果

手術時間

訓練後、熟練した外科医は、受け手の準備に約15.5分、ドナーの準備に10.9分、ドナー心臓のアナストモーセに4.4分が必要である内管技術を使用して35分以内に手術を正常に行うことができる。冷温および温かい虚血時間(ドナー剤調製から心臓移植まで)は、内管技術および縫合技術を伴わないカフ技術を用いた操作に比べ15.3分に短縮される(表1)21。²¹

操作の効率をさらに向上させるため、協力モデルを設計しました。図表に示すように(図3)、1人の外科医が最初にレシピエント準備を行い始め、その後、4〜5分後に第2の外科医によるドナー準備の開始を開始する。15〜16分後、最初の外科医はレシピエントの準備を終えるべきであり、その時点で2人目の外科医はドナー心臓の収穫を終え、レシピエント内でドナー心臓の吻合を始めるべきである。この協力モデルでは、各外科医はカフ技...

ディスカッション

マウスの心臓移植モデルは、このモデルの免疫機構を評価するためのツールや材料や多数の遺伝子改変マウスが利用可能な移植免疫学研究のための重要なツールです。しかし、血管縫合や脳の流れなどの微小外科的技術的課題は、その広範な使用を制限している。本研究では、マウスの心臓移植に関する特定の技術的課題を調査し、良好な成果を得ています。プロトコルの重要なステップは、袖口の上に血管壁をエバートするステントとして内腔に挿入する。この最適化ステップは広範囲の伸張のための必要性のために動脈の容器を全面化することの技術的な挑戦を解決する。微小外科的スキルを持たない個人は、このモデルの広範な適用にも役立つ2ヶ月のトレーニングの後に技術を実行し始めることができます。

私たちの経験では、適切なインナーチューブが移植結果を高めます。内管の外径は、レシピエント血管の内径よりもわずかに小さくする必要があります。さらに、滑りやすい表面を有する鈍いポリプロピレン管またはシリンダーは、血管内皮を損傷することを避けるために一時的な内核として使用されるべきである。私たちの手では、縫合技術を使用した吻合後の故障の主な要因である血栓...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動脈カフ	自作		ポリアミドチューブ 直径:0.55 mm、長さ:1.0
mm 動脈インナーチューブ	自作		ポリアミドチューブ。直径:0.28mm
マイクロ湾曲鉗子	Shanghai Medical Instruments(Group)Ltd.、Corp.外科用器具工場	WA3050	1/8アーク、フックなし0.3mm先端
マイクロニードルホルダー	Shanghai Medical Instruments(Group)Ltd.、Corp.外科用器具工場	WA2050	0.2mm先端
マイクロはさみ	Shanghai Medical Instruments(Group)Ltd.、Corp.外科用器具工場	WA1050	ストレート、ブレードの長さ:10 mm
マイクロストレート鉗子	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm チップ フックなし
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	クランプ圧力 20–25グラム
静脈カフ	自作		ポリアミドチューブ 直径:0.9 mm、長さ:1.2 mm
静脈インナーチューブ	自作		ポリアミドチューブ。直径:0.6ミリメートル