方法論記事

ウイルス誘導神経炎症反応を研究するマウスフットパッド接種モデル

DOI：

10.3791/61121

⸱

2020年6月14日

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Princeton University, 2Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フットパッド接種モデルは、生体内でウイルス誘発性神経炎症反応を特徴付けるための貴重なツールです。特に、末梢神経系において開始されたウイルス動態および関連する免疫病理学的プロセスの明確な評価を提供する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、マウスにおけるαヘルペスウイルス感染時の神経炎症反応の開始および発達を研究するために使用されるフットパッド接種モデルを記述する。αヘルペスウイルスは末梢神経系(PNS)の主な侵略者であるため、このモデルは、ウイルス複製の運動、PNSからCNSへの広がり、および関連する神経炎症反応を特徴付けるために適している。フットパッド接種モデルにより、ウイルス粒子は、フットパッド表皮の一次感染部位から、表皮、汗腺、真皮を内面化する感覚神経線維および交感神経線維に広がる。感染は坐骨神経を介して後頭根神経節(DRG)に広がり、最終的には脊髄を介して脳に広がる。ここでは、マウスフットパッドに、シュードラビウイルス(PRV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)および水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)と密接に関連するアルファヘルペスウイルスを接種する。このモデルは、PRV感染がフットパッドおよびDRGにおける好中球浸潤を特徴とする重度の炎症を誘発することを示す。高濃度の炎症性サイトカインは、ELISAによってホモジナイズ組織で続いて検出される。また、DRGにおけるPRV遺伝子とタンパク質発現(qPCRおよびIF染色による)と炎症性サイトカインの産生との間には強い相関関係が認められる。したがって、フットパッド接種モデルは、αヘルペスウイルス誘導神経障害の基礎となるプロセスをよりよく理解し、革新的な治療戦略の開発につながる可能性があります。さらに、このモデルは、多発性硬化症およびPNSに関連するウイルス誘発損傷などの末梢神経障害に関する研究を導くことができる。最終的には、医薬品開発のための費用対効果の高いインビボツールとして役立ちます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、PNSからCNSへのウイルスの複製と拡散および関連する神経炎症反応を調査するためのフットパッド接種モデルについて説明する。フットパッド接種モデルは,、ニューロン1、2、32におけるαヘルペスウイルス感染を研究するために集中的1に使用されている。3このモデルの主な目的は、神経刺激性ウイルスがCNSに到達する前にPNSを通って最大距離を移動できるようにすることです。ここでは、このモデルは、疑似狂犬病ウイルス(PRV)に感染したマウスにおける特定の神経障害(神経障害性かゆみ)の発症における新たな洞察を得るために使用される。

PRVは、いくつかのよく知られた病原体(すなわち、単純ヘルペス1型および2型[HSV1およびHSV2]および水痘帯状疱疹ウイルス[VZV])に関連するアルファヘルペスウイルスであり、それぞれ4の冷たいびらん、性器病変、および水疱瘡を引き起こす。これらのウイルスは、すべてのパントトロピックと特定の組織タイプの親和性を示すことなく、多くの異なる細胞型に感染することができます.しかし、それらはすべて、宿主種のPNS(時にはCNS)に侵入することによって特徴的な神経刺激性を示す。自然宿主は豚であるが、PRVはほとんどの哺乳動物に感染する可能性がある。これらの非自然な宿主では、PRVはPNSに感染し、「狂ったかゆみ」と呼ばれる重篤な掻痒を誘発し、その後に急性期死亡55、66が続く。PRV感染の臨床結果および病因における神経免疫応答の役割は十分に理解されていない。

フットパッド接種モデルは、PRVがフットパッドの表皮細胞に感染を開始することを可能にする。その後、感染は表皮、汗腺、真皮を内面化する感覚神経線維と交感神経線維に広がる。この感染は、約60時間以内に神経坐骨神経を介してDRGに移動するウイルス粒子によって広がる。感染は脊髄を通って広がり、動物がモリバンドになると最終的に後脳に達する(感染後82時間)。この時間枠の間に、組織サンプルはウイルス複製および免疫応答のマーカーについて収集、処理、および分析することができる。例えば、組織学的検査とウイルス負荷の定量は、PRV病原性における臨床的、ウイルス学的、および神経炎症性プロセスの開始と開発との間の相関関係を確立するために、異なる組織で行うことができる。

フットパッド接種モデルを用いて、マウスにおけるPRV誘発性掻痒の細胞および分子機構を調べることができます。さらに、このモデルは、ヘルペスウイルス感染時のウイルス誘発性神経炎症の開始および発症に関する新たな洞察を提供することができる。αヘルペスウイルス誘発性神経障害の根底にあるプロセスをよりよく理解することは、革新的な治療戦略の開発につながる可能性があります。例えば、このモデルは、ヘルペス後病変(例えば、帯状疱疹、帯状疱疹)を有する患者における神経因性かゆみのメカニズムを調べ、対応するヒト疾患に対するマウスの新規治療標的を試験するのに有用である。

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プロトコル

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すべての動物実験は、プリンストン大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によってレビューされ、承認されたプロトコル(番号2083-16および2083-19)に従って行われました。この作業は、プリンストン大学のバイオセーフティ委員会によって承認された設備の整ったラボを持っているバイオセーフティレベル2(BSL-2)要件に厳密に従うことによって行われました。マウスフットパッドの擦りやウイルスの接種、マウス解剖、組織採取などの手順は、プリンストン大学の生物含有動物施設室の生物学的安全キャビネット(BSC)で行った。処置を行う人は、使い捨てガウン、ヘッドカバー、目の保護、無菌手袋、外科用マスク、靴カバーを着用していました。

1. マウスフットパッドの摩耗

  1. イソフルランガス麻酔薬でC57BL/6マウス(5〜7週齢)を麻酔し、小さな麻酔システム(チャンバー)を介して3%の投与量で送達します。
    1. マウスを麻酔の外科面に置き、接種前に後ろ足パッドに置きます。マウスにダイヤフラム(動物の銃口に合わせて十分な大きさのスリット)と鼻コーンを取り付け、1.5%〜2.0%の一定の投与量でイソフルランガス麻酔薬を送達します。
    2. 鉗子でつま先を強引につまんで生じる痛みを伴う刺激に対する反応をマウスに注意深く監視する。
  2. 1つの後ろ足パッドを平らな鉗子で軽くつかみます。
    1. かかとと歩行パッドの間に、エメリーボード(100-180グリット)で、約20倍の後ろのフットパッドのグラブロウスの皮膚を優しくブラドします。あまりにも頻繁にブラジングしたり、あまりにも多くの圧力を加えることによって出血を誘発しないでください。
    2. 細かい鉗子を使用して、角層を摩耗で剥離して層のバサレを露出させるゆっくりと角質層を剥がします。

2. PRVフットパッド接種

  1. 2%胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(材料表)を含むDMEM培地で所望の刺激物に希釈したウイルス接種を調製する。
    1. PK15細胞のウイルスストック中のプラーク形成単位(PFU)の数を定量化し、ウイルス投与量を計算して標準化し、それに応じてウイルス接種を希釈する。
      注:本研究では、PRV(PRV-Becker)の有害株を8 x 106 PFUの用量で使用した。この用量は、すべての接種動物が82時間の接種後(hpi)で臨床症状を示したことを確認するために、以前の予備実験で最適化されました。
    2. ウイルスの接種を氷の上に置いておき、使用前に穏やかに混ぜます。
  2. 20 μL のウイルス接種液(8 x 106 PFU)を、吸盤状のフットパッドに追加します(局所投与)。模擬接種(中程度のみ)を並行して行う。
  3. 10倍の針を針のシャフトで軽くこすり、ウイルスの吸着を容易にします。針の点で引っ掻くのを避けてください。このステップを 10 分ごとに繰り返します。
  4. マウスを麻酔下で30分間、ブラッドしたフットパッドが乾くまで保管してください。
  5. 麻酔を停止した後、胸骨の不順を維持し、臨床フォローアップとサンプリングのために個々のケージに入れることができるようにマウスを監視します。

3. マウス解剖と組織採取

  1. 感染後の適切な時期に、窒息法(CO2)によりマウスを安楽死させる。
    注:この研究では、PRV-Becker感染マウスの人道的エンドポイント(動物が末期症状を示し始めるとき)は82 hpiである。コントロール動物を並行して安楽死させる。
  2. 針/ピンを使用して外科用マットの上にマウス腹側を向けます。外科用フォームボードにピンでマウスの手足を固定します。毛皮の汚染を最小限に抑えるために、マウスの腹側を70%エタノールで濡らします。
  3. 鉗子を使用して毛皮と皮膚の外層をつまみ、尿道開口部の近くに細かいはさみを使用して小さな初期切開を行います。
    1. この開口部から、顎まで中側腹側の切開を続ける。
    2. 前肢と後肢の四肢に向かって2つの横切り部を延長する。
    3. 根底にある筋肉層から皮膚を分離し、側面にピン留めします。
    4. 腹腔を開き、胸部の基部まで切開します。2つの横切り切開を行うことによって腹腔の開口部を完了します。
    5. 両側の横隔膜と肋骨を切断して胸腔を開きます。
      注:胸部の側面を切断すると、心臓を切断するリスクを防ぐことができます。
    6. 1.5 mLマイクロチューブで、心臓、肺、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓、膀胱などの露出した臓器を収集します。チューブを氷の上に置いておきなさい。
    7. かかとと歩行パッドの間に摩耗したフットパッドを切り、ステップ3.3.6で説明したように、チューブに組織片を入れる。
  4. マウスの裏側を上に置き、70%エタノールで毛皮を濡らします。皮膚層を切り倒して、椎骨柱を露出させます。
    1. 骨盤の領域に小さな切開を行います。後肢から頭に向かって皮膚を剥ぎ取ります。
    2. 両サイドの脊柱に平行かつ近いはさみで切断して脚と腕を取り除きます。
    3. 頭を頭蓋骨の基部(C1-C2レベル)で切り落とします。
    4. 頭蓋マグナムから前頭骨にはさみで頭蓋骨を切り開きます。
    5. 鉗子を使用して頭蓋骨を横方向に引っ張ります。
    6. 鉗子を使用して脳をそっとすくい取り出し、ステップ3.3.6で説明したように進みます。
  5. 湾曲したはさみを使用して筋肉、脂肪、軟部組織を切断することによって脊柱をきれいにします。尾を切ります。無菌の氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mLチューブに無傷の脊柱を入れます。脊髄とDRGがさらに解離されるまで、チューブを氷の上に置いてください。

4. 脊髄とDRGの抽出

注:マウス解剖直後に脊椎列から脊髄とDRGを抽出します。脊髄およびDRG抽出のためのプロトコルは、前の出版物7から適応された。

  1. 氷冷PBSチューブから椎骨柱を取り出し、残りの軟組織を取り除き、冷凍後に容易になります。
  2. カミソリの刃を使用して、椎骨(T1、L1、およびS2レベル)を通して柱に3つの横断カットを行います。3枚を滅菌の氷冷PBSを含む15mmのペトリ皿に入れます。後で分析するために、セグメントの原点を追跡し、マークします。
  3. 1つのセグメントを取り、鉗子、後側を上に向けて固定します。カミソリの刃を使用して、単一の縦方向のカットダウンを作り、列を2つの等しい半分に分割します。
  4. 新しい滅菌氷冷PBSを含む新しいペトリ皿に両方の半分を置きます。セグメントの正しい方向を確認して、左右の側面を区別できるようにします。
  5. 解剖顕微鏡の下で、細かい鉗子を使用して、各半分から両側から尾部方向から尾突方向に脊髄をそっと剥がします。
  6. 500 μLの無菌氷冷PBSを含む1.5 mLマイクロチューブに両方の脊髄半分を集めなさい。チューブを氷の上に置いておきなさい。
  7. 髄液を脊柱の片側からもう一方の側にそっと取り出し、DRGを露出させる。
  8. 露出した脊髄神経をつかんで各DRGを個別に取り出し、脊柱からそっと引き出します。採取したDRGを、氷冷PBSを含む15mmペトリ皿に入れます。脊柱セグメントとは別に全てのイプシラショナルおよび逆側DRGを収穫し、ステップ4.5で説明したように進む。
    注:DRGは白い脊髄神経に沿って丸い透明な構造として見える。
  9. 30~45分以内に他の2つの脊柱セグメントを使用して、ステップ4.3~4.7を繰り返します。
  10. 4°Cで3分間、高速(17,900 x g)ですべてのチューブを遠心分離します。
  11. 液体窒素中の吸気上清およびフラッシュフリーズチューブ。チューブを-80 °Cで保管し、さらに組織均質化を行います。
  12. あるいは、ステップ4.9後の組織病理学的分析および/または免疫蛍光染色のために、洗浄されたDRGおよび他のマウス組織を固定および切除する。

5. 組織均質化

  1. 凍結した組織サンプルを含むチューブを氷の上で解凍します。
  2. 組織の100mgの重量を量り、0.5 M EDTA(pH = 8.0)、1 M Tris-HCl(pH = 8.0)、5 M NaCl、10%SDS、プロテアーゼカクテル阻害剤を含む無菌鋼ビーズと500μLのRIPAバッファーを含む2mLマイクロ遠心分離チューブに入れます。
  3. 20サイクル/sで2分間ホモジナイザーを使用して室温(RT)で組織を破壊し、続いて1分の待ち時間、20サイクル/sで2分間中断します。
  4. RTで10分間、高速(17,900 x g)でチューブを遠心します。
  5. 新しいチューブに上清(500 μL)を集め、ELISAとqPCRを実行してそれぞれ炎症性マーカーとウイルス負荷を定量化するまで-20°Cで保管します。
    注:qPCRの場合、RNaseフリー材料(ビーズ、チューブなど)ですべてのサンプルを収集し、1%βmercaptoエタノールを含むRNAライシスバッファー(材料表)で組織を破壊します。

凍結したDRG切片の調製および免疫蛍光染色

  1. 組織処理
    1. 解剖し、1%パラホルムアルデヒド(PFA)でDRGを2時間RTで洗浄したDRGを固定します。
    2. PBSで10%スクロースを含む15 mLチューブに組織を移す。4°Cで一晩インキュベートする。
    3. PBSで20%スクロースを有する15 mLチューブに組織を移す。4°Cで一晩インキュベートする。
    4. PBSで30%スクロースを持つ15 mLチューブに組織を移す。4°Cで一晩インキュベートする。
    5. クリオマールを使用してOCTに組織を埋め込み、急速凍結のためにドライアイスにブロックを置きます。
    6. 使用するまで-80°Cでサンプルを保管してください。
  2. 凍結切断準備
    1. 冷凍ブロックを-80°Cから取り出し、クライオスタット室の温度で30分間平衡させます。
    2. 厚さ15μmのDRGをクライオセクションし、そのセクションをスライドに取り付けます。
    3. ペンを使用して、スライド取り付けされた組織の周りに疎水性円を描きます。
    4. スライドを染色するまで4°Cに保ちます。
  3. 免疫蛍光染色
    1. DRGセクション3xをPBSでRTで10分間洗います。
    2. 所望の一次抗体(例えば、PRV糖タンパク質Bに対するマウス抗体)の100μLを37°Cで1時間インキュベートする。10%陰性ヤギ血清を含むPBSで一次抗体を希釈します。
    3. ステップ 6.3.1 を繰り返します。
    4. 所望の二次抗体(ヤギ抗マウスアレクサフルオール488)の100 μLを37°Cで50分間インキュベートします。PBSのみで二次抗体を希釈。
    5. PBSで希釈したDAPI(4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール)の100 μLをセクションに加えます。さらに37°Cでサンプル10分をインキュベートする。
    6. ステップ 6.3.1 を繰り返します。
    7. ガラススライドに蛍光実装媒体を使用してサンプルを取り付け、カバースリップで固定してカバーします。

7. パラフィン埋め込み組織切片の調製とH&E染色

  1. 4°Cで24時間10%ホルマリンで組織を固定します。
  2. 固定組織のパラフィン埋め込みと切除のための標準的な処理スケジュールを実行します。固定組織を70%エタノールに移し、前述の8のように、アップグレードされたアルコールをキシレンに処理し、その後パラフィンを処理する。
    注:ポリエステルスポンジを使用して、DRGなどの小さな組織サンプルをカセット内に保管してください。
  3. 前述の9のように、標準的な脱パラフィンを行い、続いて組織切片をH&E染色を行う。

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結果

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マウスフットパッド接種モデルは、インビボにおけるαヘルペスウイルス感染の免疫病原性の特徴付け、接種されたフットパッドから神経系への感染の複製および広がりおよび特定の神経炎症反応の誘導を可能にする。

本研究では、まずマウス後方のフットパッドをブラドし、PRV(PRV-Becker)の有害な株で、模擬接種または接種領域のいずれかを接種した。摩耗の部位は、コントロールフットパッドに見えました。癒しの過程の一部として、摩耗部位に地殻が形成された(図1、黒矢印)。対照的に、PRVを接種したマウスは、フットパッドの腫脹および発赤を特徴とするヒトエンドポイント(82 hpi)で重篤な炎症を示した。

毒性のPRV-ベッカー株によるフットパッドの接種後、マウスは72 hpiで臨床徴候を示し始め、接種されたフットパッドの腫脹とますます頻繁な振戦を特徴とする。82 hpiによって、PRV-Becker感染マウスは、接種された脚に一定の揺れと足の激しい引っ掻きや噛み付きを含む特徴的なPRV症...

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ディスカッション

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ここで説明するフットパッド接種モデルは、αヘルペスウイルス感染時の神経炎症反応の開始および発達を調べるのに有用である。さらに、このin vivoモデルは、PNSからCNSへのαヘルペスウイルスの複製および拡散の運動学を確立するために使用される。これは、深い真皮掻き傷13に依存する腹面皮膚接種モデル、またはCNS,14、15、16,15にウイルスを直接導入する頭蓋内経路などの他の接種モデルとの代替である。16その結果、フットパッドモデルを用いて、神経系11,12,12における関連局所および遠隔免疫病理学的過程での複製および感染のウイルス動態のより詳細な評価を得ることができる。

このプロトコルでは、フットパッドの摩耗とその後のウイルス接種...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、チャールズ川研究所が組織病理学分析を実行する優れた技術サポートを認めている。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS)(RO1 NS033506およびRO1 NS060699)によって資金提供されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗体抗PRV gBラボ1/500 希釈
アクアホールド 2 パップ ペン 赤フィッシャー 科学2886909
コンパクト エメリー ボード-24 カウント (100/180 グリット ネイル ヤスリ)レブロン
コンプリート EDTA フリー プロテアーゼ阻害剤シグマ - アルドリッチ11836170001
C57BL/6 マウス (5-7 週間)ジャクソンラボラトリ
DAPI溶液 (1mg/ml)フィッシャーサイエンティフィック622481/1000
使い捨て滅菌ポリスチレンペトリ皿 100 x 15 mmシグマ・アルドリッチP5731500
ダルベッコのモディファイドイーグルメディウム (DMEM)ハイクロン、GEヘルスケアライフサイエンスSH30022
ダルベッコのリン酸塩緩衝液生理食塩水 (PBS) 溶液Hyclone, GE Healthcare life SciencesSH30028
ウシ胎児血清 (FBS)Hyclone, GE Healthcare life SciencesSH30088
細湾曲ハサミ ステンレス鋼FST14095-11
Fluoromount-G 封入剤Fisher scientific0100-01
ホルマリン溶液、中性緩衝 10%Sigma-AldrichHT501128
Isothesia IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
微量遠心チューブ 2mlDenville Scientific1000945
Microtube 1.5mlSARSTEDT72692005
陰性ヤギ血清ベクターS-1000
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco154022
精密グライド針 18GBD305196
カミソリの刃 スチールバックPersonna9412071
RNA 溶解バッファー (RLT)Qiagen79216
ステンレス鋼ビーズ、5 mmQiagen69989
スーパーフロスト/プラス顕微鏡スライドフィッシャー科学12-550-15
組織溶解剤 LTQiagen69980
Tissue-Tek OCTさくら4583
488 (ヤギ抗マウス)Life TechnologiesA110291/2000 希釈
製 カクテル ーズ 希釈

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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