方法論記事

ラット心臓の心室自由壁からの心内膜細胞と冠状動脈内皮細胞の分離

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DOI：

10.3791/61126

⸱

2020年4月15日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, Stanford School of Medicine, 2Vera Moulton Wall Center for Pulmonary Vascular Disease, Stanford School of Medicine, 3Stanford Cardiovascular Institute, Stanford School of Medicine, 4Division of Pulmonary Biology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 5Center for Stem Cell and Organoid Medicine, CuSTOM, Division of Developmental Biology, and Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

この記事について

サマリー

ラット心臓から消化バッファーにおける連続組織消化、再発遠心サイクルからの細胞採取、抗ラットCD31マイクロビーズによる細胞浄化を通じて、内心細胞と冠状動脈内皮細胞を単離するためのプロトコルを提示する。

要約

心内皮細胞(EIc)と冠状動脈内皮細胞(CECs)の起源、発達、マーカー、機能が異なったことが示されています。その結果、これら2つの細胞集団は、心臓病においてユニークな役割を果たす。孤立した内皮細胞を含む現在の研究は、EICとCECの両方からなる細胞集団を調査する。このプロトコルは、細胞固有の特性評価のためにこれら2つの細胞集団を独立して分離する方法を概説する。左右の心室自由壁の集まりに続いて、外面および内面からの内皮細胞は消化緩衝液を用いて別々に遊離される。外表面と内心内膜層の順次消化は、2つの内皮細胞集団の分離を保持した。EECsとCECの分離は、各集団に固有のマーカーの同定によってさらに検証されます。マウス心臓での以前に公開された単一細胞RNAプロファイリングに基づいて、Npr3 、Hapln1、およびCdh11遺伝子発現はEICに固有である。一方、Fabp4 、Mgll、およびCd36遺伝子発現は、CECs に固有です。qPCRデータは、これらの特性マーカーの濃縮発現をそれぞれのサンプルで明らかにし、EECおよびCECの分離の成功を示し、細胞表現型の維持と同様に、さらなる細胞特異的機能解析を可能にした。

概要

本稿では、ラット心臓からの内膜内皮細胞(EIC)および冠状動脈内皮細胞(CCs)の解剖およびその後の分離のための詳細なプロトコル(Gladkaらら1から改変)を提供する。これらの細胞集団を独立して調査する能力は、潜在的な治療標的として役立つ様々な心臓病の基礎となる細胞型特異的メカニズムの探索を可能にするであろう。しかし、これらの細胞集団のコレクションを独立して収集する方法はまだ公表されていません。

セックは、その起源、マーカー、および心臓の発達と,,,疾患11、2、3、4、5、6、72,3の間の機能に関してEICとは異なります。6,745EICは心臓中転体3の腹側表面に由来する。それらは、VEGFおよびHIFシグナル伝達に応答してFlk1+前駆細胞から生じ、発達中の心臓の3つの離散領域の最も内側の層を形成する:心房、心室、および静脈内の33、6。6+遺伝的系統トレースは、静脈内静脈の多能性心筋細胞が静脈細胞を導き出すことを示唆しており、これは、下epicardial層3を形成するために移行する。その後、亜エピカルジアル層は、末梢室自由壁33、44を横切って残るCEを含む冠状動脈および静脈に分化する。この内皮経路への心内膜は、VEGFC、ELA/APJ、およびSOX17シグナル伝達3、4、6、8、94,6,8,9によって調節される。心室心内膜は、未知のメカニズム3によって心室中隔のより少ないセクチを導き出す。続いて、EECsとCECの局所的な分化は、これらの2つの細胞集団に特有のマーカーによって示唆される、 IcのMgll、Fabp4、Cd36発現、またはNpr3、Cdh11、およびHapln1発現を含むEIc Mgll Cd36 Fabp4, 3,3、5、10,10の。

EECsとCECは、心機能において異なる役割を果たします。心筋間葉転移、弁形成、チャンバー成熟、流出路調節、および房室管の発達はEIc6に依存している。あるいは、CECsは冠状動脈11の血管運動の緊張および炎症に寄与する。これらの機能の差異は、疾患の発症における個別の役割を生じ4,12.例えば、EICの機能不全は先天性弁疾患6、非圧縮心筋6、房室性隔壁効果6、子宮内膜線維芽症13、低形成左心症候群13、心室形成不全13、および心臓肥大症12を引き起こす可能性があることを示唆している。同様に、研究は異常なCEが冠状動脈疾患14および血栓症11に寄与することを発見した。

これらの2つの細胞集団の包括的な知識を達成するには、EECsとCECの分離が成功する必要があり、研究と臨床の両方の場面で活用できます。これらの細胞集団の増殖および分化因子を決定することは、誘導多能性幹細胞(iPSC)からの内皮サブタイプの分化のための基準となるであろう。さらに、EIcやCECの開発、調節、機能の差異を完全に同定することは、細胞型特異的な方法で多数の心臓病を引き起こすゲノムおよびエピゲノム因子を理解するために不可欠である。この記事では、EECsとCECsを個別に収集するためのステップを個別に概説し、細胞型特異的マーカーの遺伝子発現レベルを評価することによって分離の証拠を提供します。

プロトコル

すべての動物の処置はスタンフォード大学の実験動物の心配の管理パネル(APLAC31608)によって承認された。

1. バッファの準備

  1. 表1に示した試薬を用いて消化バッファーを準備する。
    1. DNase Iストック溶液を準備する:2,000単位/mL(1 mg/mL)のストック溶液のためにRNaseフリー水でDNase Iを溶解します。アリコートし、-20°Cでストック液を保管してください。
    2. リベラー溶液を準備する:リベラーゼをRNaseフリー水で溶解し、5mg/mLのストック溶液を取り出します。4°Cのローラーバンクで30分間回転させ、ストック液を-20°Cに保管します。
  2. 0.5 M エチレンアミンテトラ酢酸 (EDTA) および 10% ウシ血清アルブミン (BSA) ストック溶液を 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈し、最終濃度の EDTA 2 mM および BSA の 0.5% を得て、仕分けバッファーを準備します。

2. ハートコレクション

注:このプロトコルでは、体重50~100gの6匹のスプレイグ・ドーレーラットが使用されました。男女差は認められない。

  1. ラットをCO2で安楽死させ、解剖プラットフォーム上のサピネ位置に置きます。四肢を下に固定し、70%エタノールで腹部と胸部の両方を殺菌します。
  2. 腹部をはさみで開き、腸の後ろにある後部大静脈の部分に21Gの針を挿入する。注射器プランジャーを引き戻し、肝臓が明るく見え、血液を引き出すまで静脈から血液を引き出し、十分な血を除去できることを示す。
  3. はさみを使って、胸を慎重に開いて肺や心臓を傷つけないようにします。大動脈アーチ/アトリウムを鉗子で持ち上げ、大動脈、肺動脈、肺静脈、および静脈を切断して心臓を解放し、除去する。
  4. 50 mLのコールド1xハンクスのバランス塩溶液(HBSS)バッファー3xで心臓を洗浄し、過剰な血液を除去します。
  5. マイクロディション顕微鏡下で、右心室自由壁を、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を含む5mLチューブに取り出す(図1A、B)。B
    1. 左右を識別するために、その平らな、後面の上に心を置きます。
    2. 心臓の上部から分岐する静脈および動脈の最も前部である肺動脈を見つけ、肺動脈を通って右心室まで切断する。心臓の前面で、頂点に達するまで中隔に沿って切断する。肺動脈と右心室接合点まで、心の後側を頂点から中隔に沿って切り上げ続ける(図1A)。
    3. 肺動脈と右心室接合点から始めて、心臓の前側と後側の両方を前の解剖に垂直に切断し、中隔から離れ、右心室自由壁が心臓の残りの部分から解放されるまで(図1B)。
  6. 顕微鏡下で、左心室自由壁をDMEMを含む5mLチューブに取り出す(図1C、D)。D
    1. 大動脈を見つけ、肺動脈の後ろの心臓の上から分岐し、左心室自由壁を遮断するステップ2.5に記載された方法を繰り返す。

3. EEC消化

  1. 内側の表面が平らに横たわる60cmの培養皿に、左右の心室のない壁組織を置き、下を向いている(図2)。
    注: 内面は、図 2A、Cに示すように、わずかに凹状の心室のC内側面です。
  2. 0.5~1 mLの消化バッファーを皿に加え、ピペットの先端を組織の直下に置きます。内面だけが浸るまで続けます。
  3. 5%CO2、37°Cイン2キュベーターで5分間インキュベートします。
  4. 消化を止めるために培養皿にEC培地を加えます。
    メモ:消化バッファーの量をEC培地に1:5の比率で保ちます。
  5. 1 mL ピペットを使用して、EC 媒体で心室の内面を洗い流し、40 mm ストレーナーを介して流出を 50 mL コレクションチューブに移します (図 2E)。下流の精製のために氷の上にコレクションを保管してください。

4. CEC消化

  1. 内層(図2B、D)から汚染することなく左心室の外面に沿って切Dり、消化バッファーの1mLを含む別の5mLチューブにそれぞれを入れます。
    注: 左心室は、より厚い心室として識別することができ、外面は、わずかに凹状の心室の外面として決定することができます。
  2. 解剖はさみを使用して、小さな、1 mm3個に心室の壁をミンチ。
  3. 37°Cの水浴で、約15〜20分間、ボルテックスを2〜3分ごとにインキュベートします。
  4. 5 mLチューブにEC培地のピペット4 mLを入れ、消化を終了した。
  5. 5 mL血清ピペットを用いた溶液を40mmストレーナーを通して50 mLチューブに移します(図2E)。下流の精製のために氷の上にコレクションを保管してください。

5. セルコレクション

  1. 室温(RT)で10分間300xgでチューブを遠心し、上清を吸引する。 g
  2. ペレットが赤色に見える場合、ペレットを1~2 mLの1x赤血球(RBC)のライジングバッファーに再懸濁させる(図2F)。
    注: Rbcs がない場合は、手順 6 に進みます。
  3. 37°Cの水浴で5分間チューブをインキュベートします。
  4. 50 mLチューブにPBSのピペット10 mLを入して、溶出を止める。
  5. RTで10分間300xgでチューブgを遠心し、その後上清を吸引する。

6. ECソート

  1. 50 mLチューブに90μLの仕分けバッファーと10 μLの抗CD31 PE抗体を加えます。
  2. チューブをボルテックスし、4°Cの冷蔵庫で10分間インキュベートします。
  3. チューブに10mLの仕分けバッファーを加え、十分に混ぜ合わせ、300 x gで遠心分離機を300 x gでRTで10分間追加します。
  4. 上清を吸引し、80 μLの仕分けバッファーと20 μLの抗PEマイクロビーズでペレットを再懸濁します。
  5. チューブをボルテックスし、4 °Cで15分間インキュベートします。
  6. 10 mLの選別バッファーをチューブに加えて細胞を洗浄し、十分に混ぜ合わせ、300 x gで遠心分離してRTで 10 分間洗浄します。
  7. 上清を吸引し、ペレットを500μLの仕分けバッファーに再懸濁します。
  8. 超常磁性球を含むカラムを磁気セパレータに入れ、3 mLのソートバッファでカラムをすすきます。
  9. カラムが「フローストップ」した後、500μLの細胞懸濁液をカラムに入れ、次にソートバッファでカラムを洗浄します。3倍の洗浄を繰り返し、それぞれ3mLの仕分けバッファ(図2G)を使用します。
  10. セパレータから列を取り外し、新しい 15 mL コレクションチューブの上に配置します。
  11. ピペットを使用して、5 mLのEC培地をカラムに加え、カラムプランジャーを使用して溶液を推進します。
  12. コレクションチューブをRTで10分間300xggで遠心し、上清を吸引します。
  13. メーカーの指示に従って、キットを使用してEECおよびCECサンプルの細胞ペレットからRNAを抽出します。最低500ngのRNAが得られる。
    注:RNA抽出後、サンプルは-80°Cで保存することができます。
  14. メーカーの指示に従って、ランダムプライマーとキットを使用してcDNAを得るためにRNAの500 ngを逆に書き起こす。
  15. 内心および内皮集団の検証のために定量的PCRを行う(図2H)。プライマーシーケンスは、表 2に示されています。
    1. 384 qPCR プレートのウェルに EEC または CEC cDNA (1 ng/μL) を 5 μL 追加します。EEC または CEC cDNA を十分なウェルに追加して、プライマーの数ごとに 3 つのウェルを使用できるようにします。
    2. 6 μLの2x qPCR SYBRグリーンバッファーを各10 μMプライマーの0.5 μL(フォワードプライマーとリバースプライマーの両方を含む)と混合し、各候補遺伝子に対応する単一のウェルに追加します。
    3. RTで300 x gで1分間、プラスチックフィルムと遠心分離機でプレートを密封します。
    4. プレートをqPCRマシンに入れ、95°Cで3分間プログラムを開始し、続いて15sの95°C、60sの場合は55°Cで、その後の2つのステップを45サイクル繰り返します。

結果

EEC および CEC 分離のプロセスについては、図 2を参照してください。EECsとCECsの正常な分離は、汎内皮細胞マーカーの存在と、2つのサブタイプ集団とは異なるマーカーの存在を評価することによって決定された。予測通り、qPCRは、β-actinに対して、EECsがCECsとβ比較してNpr3、Hapln1、およびCdh11の高レベルの心内膜マーカーを発現することを明らかにした(図3A)。 Hapln1,同様に、CECsは、EICと比較して高い冠状マーカー Fabp4、Mgll、およびCd36のレベルを発現する(図3B)。 Fabp4さらに、EECとCECsの両方が、CECにおいてわずかに高いレベルで、汎ECマーカー遺伝子Cdh5を発現した(図3C)。


心臓の解剖学図;ラベル付けされた大動脈、心室、動脈;血流経路研究。
図1:心臓解剖の図。(A) 最初の切断は、右心室の自由壁を中隔から分離するために作られた。(B)右心室を完全に解放するために作られた第二のカット。(C)左心室の壁を中隔から分離するために最初に作られた切削。(D) 左心室を完全に解放するために作られた第2カット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。


消化、赤血球溶解、MACSソーティング、qPCR分析による心臓細胞単離図。
図 2: CEC と EEC のダイジェストのセットアップの図と、セルの並べ替えのための次の配置(A)最も内側の自由心室壁および(B)最外心室遊離壁は、消化バッファーに浸漬された(C)または(D)それぞれ消化バッファーに消化した。(E)CD31抗体を用いた(F)赤血球(RBC)リシス及びE(G)磁気活性化細胞選別(MACS)を続けて細胞溶液を採取および濾過する。(h) 精製されたECを、qPCRを用いて遺伝子発現検証のために処理した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。


Npr3、Cdh11、Hapln1、Mgll、Fabp4、Cd36のEECとCECを示す遺伝子発現比較チャート。
図 3: qPCR データで、CE および EECs の分離を検証する。(A) EECマーカーNpr3、Cdh11、およびEECおよびCECsにおけるHapln1の遺伝子発現レベルをリアルタイムPCRによって定量した。 Npr3 Cdh11(B) EICおよびCECにおけるCECマーカーMgll、Fabp4、およびCd36の遺伝子発現レベルをリアルタイムPCRで定量した。 Mgll Fabp4(C) リアルタイム PCR により、EEC マーカー Cdh5を EEC および CECs で定量した。(n = 各グループで 3)。バーは平均 ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01 対 EEC, 非対対 t 検定を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1.消化バッファー (1.5ml)
 ストックコン。ファイナルコン。ボリューム
リベラーTM5 mg/ml0.5 mg/ml150ウル
Dnase I1 mg/ml20 ug/ml30ウル
Hepes1 M10mM15ウル
DMEM--1305 ul

表1:消化バッファーのレシピ。

表 2.プライマーシーケンス
遺伝子名転送逆
Npr3TCCTGCAATCATGTGGCCTAガアトクトクテクGCGCCTCTC
Cdh11グガートグガクトグガクトッグGTAATTCTGGGGGCTGC
ハプルン1クグクチャクトググッGCCATTTCAGCTGGATG
ムルCCCGGGGCCCAAGACガーガガグッグクトゥクトググ
ファップ4アガークトグガーグガグトクトクトCGアククトクトクガッガトガッカ
Cd36GCAAACGACTGCCCAACCCGGTCACTTGGTTCTGA
Cdh5カラットガガクアクTGTGGAACGTクトクトGCTGG
B-アクチンTCTGTGTGGGGGGCTCクグアクカキャットGTクトクッチッチ

表 2: プライマーシーケンス

ディスカッション

CECとEECsは、起源、マーカー、機能が異なるため、開発や病気において独自の役割を果たす可能性があります。内皮細胞分離のための既存のプロトコルは、大血管組織に限定され、EECの収集を無視し、CECおよびEEC固有の機能の研究を制限する。この知識は、将来の研究のために、ICおよびEICへのiPSCの分化のための参照を提供し、様々な心臓病の潜在的な治療目標のためにこれらの細胞集団の検査を容易にするので、これら2つの集団を独立して分離し、研究することが不可欠である。この新しいプロトコルは、成人ラットの心室のない壁の外表面からEICを内面およびCECから分離する方法を概説する。

このプロトコルでは、各ステップのタイミングを非常に正確に制御することが重要です。EECsの数はラットの心臓組織では非常に限られているため、細胞の損傷を防ぐために心臓の内層の消化時間を最小限に抑え、さらに重要なことに、CEC汚染を防ぎます。酵素反応を終了させるEC培地溶液の即時添加は、高い細胞生存率を維持するためにも非常に重要である。赤いペレットは、RBCsの多数の存在を示唆しています.RBC汚染の量に応じて、RBCの溶菌バッファーの1〜2 mLを添加してRBCsを劣化させることができます。現在のプロトコルを使用して、6つのラットの心臓から105 EICを分離することができました。これらの細胞は、さらなる拡張および特性評価のために細胞培養皿に播種することができる。

自由な壁のコレクションのために組織を準備するとき、心臓はHBSSで洗浄して残りのRBCsの大部分を除去する。HBSSは、フェノールレッドを含むDMEDとは対照的に、血液細胞の可視化を可能にする明確な外観のために推奨される媒体である。消化バッファーの組成は、内皮細胞の十分な解放を保証します, リベラ消化酵素が露出した細胞の組織を取り除くところ、DNase Iは死細胞からDNAを排除してDNAの接着品質によって阻害される細胞剥離を促進し、HEPESバッファーはpHのバランスをとり、DMEMはより良い細胞維持のためにアミノ酸およびビタミンの濃度が高い修飾基底培地であり、リベラーゼを活性化するために必要なカルシウムを含む。

ヒト15およびマウス心臓10の両方から得られた単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)によれば、特定のEC集団に起因するいくつかのマーカーが報告された。我々は、最も富化された遺伝子のいくつかを選択して、単離されたEECs(すなわち、Npr3、Cdh11、およびHapln1)およびEIC(すなわち、Mgll、Fabp4、およびCd36)の純度を調べた。 Cdh11 Fabp4β-アクチン、Npr3、Cdh11、およびHapln1マーカーに対して、CECsと比較してEICの発現が増加した。 Cdh11同様に、CICでは、EICと比較してMgll、Fabp4、およびCd36マーカーの発現が大きかった。 Fabp4各サンプルの一意に表現されたマーカーは、EIC と CEC に特有のマーカーとそれぞれ一致しており、分離が成功したことを示しています。

しかし、現在のプロトコルは、慎重に制御された逐次消化を伴う場合でも、分離中の2つのEC集団間の交差汚染を排除することはできません。したがって、いくつかの細胞表面マーカーは、さらなる精製のために適用することができる。例えば、NPR3は一般的に心内膜10にラベルを付け、APJはCEC16の大部分をトレースすることができます。これら2つのマーカーは細胞表面に発現するため、蛍光活性化細胞選別(FACS)や、さらに異なるEC集団を精製するために使用される抗体に使用することができます。さらに、ヒト15およびマウス10の心臓scRNA-seqはEICにおけるNpr3の濃縮を確認することができ、Cd36はCEC精製に潜在的に使用することができる。

結論として、提示されたプロトコルは、ラット心臓からのEICとCECの独立した分離を概説する。細胞分離によって可能になる細胞特性の包括的な識別は、重要な下流アプリケーションに利用することができる。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、リンリ・ワン博士が動物プロトコルを支援し、スタンフォード小児科がインフラ支援を行ったことを非常に高く評価している。この作品は、NIH/NHLBI K99 HL135258(M.G.へ)によってサポートされました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)Gibco156300801M
15mlチューブエッペンドルフ0030122151
50mlチューブNunc339652
5mlチューブエッペンドルフ30119401
ACK溶解バッファーGibcoA1049201
Anti-CD31 PEMiltenyiBiotec130-115-505
Anti-PE microbeadsMiltenyi Biotec130-048-801
ウシ血清アルブミン (BSA)Miltenyi Biotec130-091-37610%
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-rad1855485For qPCR
DNAse IWorthingtonLK 0031721 mg/mL in water
Dulbecco's ModifiedEagle Medium (DMEM)Gibco10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)LonzaCC-3162EC Medium
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)Invitrogen155750200.5 M
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1Gibco14025092
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/whiteBio-radHSP3805qPCR用
大容量cDNA逆転写キットApplied Biosystems4368813
Liberase TMSigma Aldrich54011190015 mg/mL
MACS LS カラムMiltenyi Biotec130-042-401EC分離用
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-302EC分離用
マイクロシール 'B' PCR プレート シーリング フィルム、接着剤、光学バイオ・ラッドMSB1001qPCR
ナローパターン鉗子用F.S.T11002-12心臓収穫用
ナイロン 滅菌ストレーナーファルコン35234040 mm
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) X1Gibco1001023
PowerUp SYBR グリーン マスター ミックス応用バイオシステムA25780qPCR
Quick-RNA Microprep KitZymo ResearchR1050For RNA extraction
S&T鉗子 - SuperGripのヒントF.S.T00632-11心臓の収穫用
斜視はさみ - 炭化F.S.T14574-11心臓の収穫のために
Vannas春のはさみ - マイクロ鋸歯状のF.S.T15007-08心臓の収穫用
タングステン

参考文献

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CD31 qPCR

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