方法論記事

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

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DOI：

10.3791/61146

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2020年5月13日

 ,  , 
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

この記事について

サマリー

ここでは、ジアシルグリセリルペプチドとアルキンリン脂質を基質としてクリックケミストリーを用いて、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ活性をモニターするための高感度蛍光アッセイを紹介します。

要約

プロテオバクテリア由来のリポタンパク質は、3つの内在性膜酵素の作用により膜リン脂質由来の脂肪酸によって翻訳後修飾され、トリアシル化タンパク質が得られます。リポタンパク質修飾経路の最初のステップは、ホスファチジルグリセロールからプロリポタンパク質へのジアシルグリセリル基の転移を含み、ジアシルグリセリルプロリポタンパク質をもたらす。第2の工程では、プロリポタンパク質のシグナルペプチドが切断されてアポリポタンパク質を形成し、アポリポタンパク質はリン脂質に由来する第3の脂肪酸によって修飾される。この最後のステップは、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ(Lnt)によって触媒されます。リポタンパク質修飾経路は、ほとんどのγプロテオバクテリアに不可欠であり、新規抗菌剤の開発の潜在的な標的となっています。ここで説明するのは、低分子阻害分子のハイスループットスクリーニングに適合するLntの高感度アッセイです。酵素と基質は膜に埋め込まれた分子です。したがって、in vitroテストの開発は簡単ではありません。これには、界面活性剤の存在下での活性酵素の精製、アルキンリン脂質およびジアシルグリセリルペプチド基質の利用可能性、および混合ミセルでの反応条件が含まれます。さらに、ハイスループットスクリーニング(HTS)セットアップで活性試験を使用するためには、共役酵素反応よりも反応生成物の直接読み出しが好ましい。この蛍光酵素アッセイでは、アルキントリアシル化ペプチド生成物はクリックケミストリー反応によって蛍光を発現し、マルチウェルプレートフォーマットで検出されます。この方法は、リン脂質やアシルCoAなどの脂肪酸含有基質を使用する他のアシルトランスフェラーゼにも適用できます。

概要

細菌リポタンパク質は、それらのアミノ末端において共有結合した脂肪酸によって特徴付けられ、それを通してそれらは膜に固定される1,2。タンパク質の成熟部分は構造および機能において非常に多様であり、それによって細菌細胞エンベロープにおける様々な生物学的過程におけるリポタンパク質の役割を説明する。

リポタンパク質は、細胞質膜への挿入後にリン脂質由来の脂肪酸によって修飾される。プロリポタンパク質は、アシル化される不変のシステイン残基および成熟タンパク質の最初のアミノ酸を含むシグネチャーモチーフであるリポボックスを含む。この経路の最初のステップは、ジアシルグリセリルとシステインの間のチオエーテル結合を介してホスファチジルグリセロールからプロリポタンパク質にジアシルグリセリル基を転移するプロリポタンパク質ホスファチジルグリセロール::d iacylグリセリルトランスフェラーゼ(Lgt)によって触媒されます。シグナルペプチダーゼII(Lsp)は、ジアシルグリセリルプロリポタンパク質からシグナルペプチドを切断し、ジアシルグリセリル部分を介して膜に固定されたアポリポタンパク質を生成します。最後の3番目のステップは、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ(Lnt)によって触媒され、リン脂質の sn-1位から脂肪酸をアポリポタンパク質に付加し、トリアシル化された成熟リポタンパク質を生成します(図1)3。Lnt反応は、安定なチオエステルアシル酵素中間体が形成される2段階のピンポン反応です。リゾリン脂質副産物は、反応の第2段階においてアポリポタンパク質基質のアシル化の前に放出される。

リン脂質基質特異性は、高パーセンテージのトリス-トリシン尿素SDS-PAGE4上のN-アシルジアシルグリセリルペプチドの移動度シフトに基づくLntアッセイで決定されます。小さな極性ヘッド基を有するリン脂質、飽和[sn-1]および非飽和[sn-2]は、基質4に好適であった。ゲルシフトアッセイは、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼの広範な速度論的研究や、HTSが阻害分子を同定するのには適していません。アルキン脂肪酸を用いたクリックケミストリーは、細菌5のリポタンパク質修飾および真核生物6の脂肪酸代謝の研究に成功しています。最近、Rasパルミトイル化のインビトロアッセイにより、阻害剤7を同定することが報告されました。

ここで説明する方法では、界面活性剤中の精製された活性Lntは、混合ミセル中の基質と共にインキュベートされてアルキントリアシル化ペプチドを形成し、続いて蛍光分析によって検出される。

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プロトコル

1.酵素および基質の調製

  1. 酵素の精製
    1. 前述のように洗剤可溶化膜からLnt酵素を生成および精製する4,8。簡単に説明すると、C末端連鎖球菌タグを持つLntをコードするlnt-strep遺伝子の発現を、無水テトラサイクリン(200 ng / mL)で37°Cで16時間、0.6のOD600で誘導します。
    2. 4,000 x g で10分間遠心分離して細胞を回収し、上清を廃棄します。
    3. 細胞ペレットをバッファーWA(20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA)に再懸濁し、1mLあたり100 OD600 単位にします。
    4. 10,000psiのフレンチ圧力セルプレスを2回通過してセルを分割します。
    5. 13,000 x g で20分間遠心分離することにより、壊れていない細胞や破片を取り除きます。上清を保管し、ペレットを廃棄します。
    6. 上清を120,000 x g で60分間遠心分離し、膜小胞(半透明の茶色のペレット)を回収します。上澄み液を捨てる。
    7. 膜ペレットからの内在性膜タンパク質を、バッファーWA中の1%(w/v)n-ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)で室温(RT)で30分間可溶化します。不溶化材料を120,000 x g で30分間遠心分離して除去します。精製には上清画分を使用してください。
    8. Nozeret et al.8に記載されているように、アフィニティークロマトグラフィーカラム(材料表を参照)およびS400ゲルろ過カラム(材料表を参照)でLnt-strepを精製します。
    9. 精製酵素を0.05%DDMと10%グリセロールを含むバッファーWAに-80°Cで保存します。
      注:この酵素は5年以上安定しています。
  2. アルキン-リン脂質およびビオチン化線維芽細胞刺激リガンド(FSL-1-ビオチン)基質の調製
    1. クロロホルムに可溶化したカスタム合成アルキン-POPE(1-ヘキサデカ-15-イノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、 材料の表を参照)100 μLを1.5 mLチューブに分注します。
    2. チューブをシリンジで突き刺し、クロロホルムをRTで2時間スピードバックで蒸発させます。乾燥リン脂質サンプルを-20°Cで保存します。
    3. 使用前にアルキンPOPEを0.1%トリトンX-100に500μMで溶解してください。必要に応じてアルキン-POPEを可溶化するためにRTの超音波浴で3分の超音波処理ステップを追加します。
    4. FSL-1-ビオチンを445 μMの水に再懸濁します。
      注意: どちらの溶液も、-20°Cで少なくとも2か月間保存できます。

2. チューブアッセイ

注:1日目に、1.5 mLチューブでLnt反応をセットアップし(ステップ2.1)、96ウェルプレートをストレプトアビジンでコーティングします(ステップ2.2)。

  1. 試薬混合物の調製と酵素反応
    1. 標準的なLntアッセイでは、アルキン-POPE(500 μMストックから最終50 μM)とFSL-1-ビオチン(445 μMストックから最終濃度50 μM)をLnt反応バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.2、150 mM NaCl、1%BSAを含む0.1%トリトンX-100)に1.5 mLチューブで最終容量18 μLで混合します。すべての条件を3連で実行します。
    2. 超音波水浴中で3分間基質混合物(ステップ2.1.1で調製)を超音波処理し、Lnt酵素を添加する前に37°Cで5分間インキュベートする(ステップ2.1.3)。
      注:チオール特異的試薬であるMTSES(ナトリウム(2-スルホナトエチル)メタンチオスルホネート)は、Lnt8を阻害します。陰性対照サンプルとして使用する10 mM MTSES(100%DMSO中の100 mMストック溶液)を反応チューブ(ステップ2.1.1)に追加します。Lnt反応バッファーの容量を調整して、総容量が18 μLになるようにします。
    3. 活性型(1 ng/μL、17.2 nMに相当)または不活性Lnt(C387S)(0.05% DDMを含むバッファーWA中の10 ng/μLストック2 μL)を加え、上下にピペッティングして基質と混合します(ステップ2.1.2)。
    4. 加熱蓋付きのサーモミキサーで37°Cで16時間反応をインキュベートします。
  2. 96ウェルプレートのストレプトアビジンコーティング
    1. ストレプトアビジンのストック溶液を2 mg/mLのH2O溶液で調製します。
      注意: この溶液は、-20°Cで最大6か月間保存できます。
    2. ストック溶液から、水中で10 μg/mLのストレプトアビジンを作業溶液として調製します。100 μLの溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。ストレプトアビジンをプレートに結合させ、蓋なしで37°Cで一晩インキュベートし、ウェルを風乾します。

注:2日目にクリックケミストリーを実行し(ステップ2.3)、Lnt反応混合物をストレプトアビジンコーティングプレートに結合させ(ステップ2.4)、蛍光を検出して結果を分析します(ステップ2.5)。

  1. クリック化学反応
    1. アジド-FAM(DMSO溶液5 mM)、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、50 mM水溶液、TBTA(トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン;tert-ブタノール:DMSO(4:1)溶液2 mM)、およびCuSO4∙5H2O(H2O中で新たに調製した50 mM)のストック溶液を調製します。
    2. ステップ2.1.4で調製したLnt反応混合物を含む1.5 mLチューブに、0.2 μLのストックAzido-FAM(最終濃度50 μM)、0.4 μLのストックTCEP(最終濃度1 mM)、0.2 μLのストックTBTA(最終濃度0.02 mM)の順に試薬を添加してクリックケミストリーを実行します。
    3. 溶液を5秒間ボルテックスします。次に、0.4 μLのストックCuSO4 (最終濃度1 mM)を加えます。再び5秒間渦を巻きます。サンプルを暗所でRTで1時間インキュベートします。
  2. Lnt反応混合物のストレプトアビジンコーティングプレートへの結合
    1. ステップ2.2.2から一晩インキュベーションした後、ストレプトアビジンコーティングプレートのウェルを200 μLのPBS-T1(0.05%Tween-20を含むPBS)で3回洗浄します。
      注:ストレプトアビジンプレートは、すぐに使用することも、4°Cで乾燥して保存することもできます。
    2. ステップ2.3.3のクリックケミストリー混合物から18 μLを96ウェルストレプトアビジンコーティングプレートのウェルに移し、100 μLのPBS-T1を加えてN-アシル-FSL-1-ビオチン-FAM生成物をストレプトアビジンプレートに結合させます。
    3. ビオチン-フルオレセイン(DMSOの3.1 mMストックから0.26 μM)をストレプトアビジン結合と蛍光読み出しのポジティブコントロールとして使用します。
    4. プレートをサーモミキサーで暗所で1時間RTでインキュベートし、300rpmで振とうします。
    5. マルチチャンネル電動ピペットで96ウェルプレートの手動洗浄ステップを実行します:200 μLのPBS-T2(1%Tween-20を含むPBS)による6回の洗浄、ピペットによる3回の洗浄、200 μLのPBSによる3回の洗浄、ピペットによる3回の洗浄。
  3. 蛍光の検出と分析
    1. 200 μLのPBSを加え、蛍光マイクロプレートリーダーで520 nmの蛍光を記録します。結果をスプレッドシートソフトウェアに保存します。
      注:ビオチン-フルオレセインは、ストレプトアビジン結合および520nmでの蛍光検出のポジティブコントロールとして使用されます。0.26 μMのビオチン-フルオレセインで30,000〜40,000 A.U.の再現性のある読み出しが期待されます。すべてのサンプルは、コントロールを含むトリプリケートで分析されます。
    2. 各反応の標準偏差を計算し、統計ソフトウェアを使用した対応のないt検定を使用して、陰性対照と陽性サンプルのP値を計算します。

3. マルチウェルプレートアッセイ

注:1日目に384ウェルプレートでLnt反応を設定し(ステップ3.1)、384ウェルプレートをストレプトアビジンでコーティングします(ステップ3.2)。

  1. 試薬混合物の調製と酵素反応
    注:試薬と酵素の量はチューブアッセイと比較して減少し、Lnt反応は384ウェルプレートで直接実行されます。これにより、より少ない材料の使用が可能になり、さらに自動化できるステップが削減されます。
    1. 基質を次のように混合します:アルキン-POPE(500 μMストックからの最終濃度50 μM)およびFSL-1-ビオチン(500 μMストックからの最終50 μM)をLnt反応バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.2、150 mM NaCl、1% BSAを含む0.1% Triton X-100)に、384ウェルプレートフォーマットで1ウェルあたり反応あたり13.5 μLの容量で混合します。すべての条件を3連で実行します。実行する反応数に必要な試薬の総量を計算します(つまり、1つの384ウェルプレートで5,184 μL)。
    2. 超音波水浴中で3分間基板混合物を超音波処理する。
    3. 1ウェルあたり13.5 μLの基質混合物を384ウェルプレートに分注します。
      注:ネガティブコントロールとして、ウェルごとに10 mMのMTSES(100%DMSO中の625 mMストック溶液)を追加できます。Lntバッファーの容量を調整し(ステップ3.1.1)、最終反応容量が13.5 μLになるようにします。
    4. Lnt酵素を添加する前に、37°Cで5分間インキュベートします(ステップ3.1.5)。
    5. ステップ3.1.3の反応混合物を含む各ウェルに、0.5 ng/μL(8.6 nMに相当)の活性Lnt酵素、または不活性変異体(C387S)(0.05% DDMを含むバッファーWA中の5 ng/μLストックから1.5 μL)を加えます。上下にピペッティングして試薬を混合します。反応容量は15μLです。
    6. マルチウェルプレート用のプラスチックホイルでプレートをシールします。
    7. 加熱蓋付きのサーモミキサーで37°Cで16時間インキュベートします。
  2. ストレプトアビジンコーティング384ウェルプレート
    1. ステップ2.2.2のストレプトアビジン75 μL(H2O溶液10 μg/mL)を使用して、384ウェルプレートのウェルをコーティングします。ストレプトアビジンをプレートに結合させ、蓋なしで37°Cで一晩インキュベートし、ウェルを風乾します。

注:2日目にクリックケミストリーを実行し(ステップ3.3)、Lnt反応混合物をストレプトアビジンコーティングプレートに結合させ(ステップ3.4)、蛍光を検出し、結果を分析します(ステップ3.5)。

  1. クリック化学反応
    1. アジド-FAM(DMSO溶液1.2 mM)、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、H2O中で調製した24 mM)、TBTA(トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン;tert-ブタノール:DMSO(4:1)溶液中で0.48 mM)およびCuSO4∙5H2O(H2O中で新たに調製した24 mM)のストック溶液を調製します。
    2. アジドFAM(最終濃度50 μM)、TCEP(最終濃度1 mM)、TBTA(最終濃度0.02 mM)の3つのクリックケミストリー試薬を、それぞれ0.75 μL、最終容量2.25 μL/ウェルで組み合わせます。384ウェルプレートあたりの必要容量を計算します(つまり、384ウェルプレートのすべてのウェルを使用する場合は864μLを使用します)。激しく混ぜます。
    3. ステップ3.1.7から384ウェルプレートで完了したLnt反応に、ウェルあたり2.25 μLの試薬溶液を直接加えます。
    4. マルチチャンネル電動ピペットで上下にピペッティングして混合します。
    5. CuSO4 (最終濃度1 mMで24 mMストックから0.75 μL)を加え、マルチチャンネル電動ピペットで上下にピペッティングして混合します。
    6. 暗所で1時間RTでインキュベートします。
  2. Lnt反応混合物のストレプトアビジンコーティング384ウェルプレートへの結合
    1. ステップ3.2.1から一晩インキュベートした後、ストレプトアビジンコーティングプレートのウェルを85 μL PBS-T1で1回洗浄します。
    2. ステップ3.3.6のインキュベーションプレートの各ウェルからステップ3.4.1のストレプトアビジンコーティングプレートに11 μLのクリックケミストリー反応を移し、N-アシル-FSL-1-ビオチン-FAM産物をストレプトアビジンプレートに結合させます。
    3. 64 μLのバッファーPBS-T1を追加します。
    4. ストレプトアビジンコーティングウェルへの結合のコントロールとして、ビオチン-フルオレセイン(DMSOの3.1 mMストックから0.19 μM)を含めます。
    5. 384ウェルプレートをRTでサーモミキサーの暗所で1時間インキュベートし、300rpmで振とうします。
    6. 以下のように自動プレートウォッシャーを使用してプレートを洗浄する:85μL PBS-T2で10回洗浄し、プレートを洗浄の間に振とうする。85 μL PBSで5回洗浄し、洗浄の合間にプレートを振盪する。
  3. 蛍光の検出と分析
    1. PBS(85 μL)を添加し、535 nmの蛍光マイクロプレートリーダーに蛍光を記録します。
    2. 説明に従ってデータを分析します (ステップ 2.5.2)。

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結果

Lnt反応では、リン脂質由来の sn-1脂肪酸がジアシルグリセリルペプチド上に転移し、成熟トリアシル化ペプチド8が得られる。ここで説明するin vitro Lntアッセイは、アルキン脂肪酸(アルキン-POPE)およびFSL-1-ビオチンを含むリン脂質を基質として使用するように設計されており、その結果、アルキン-FSL-1-ビオチンが形成されます。アジド-FAMとのクリックケミストリー反応により、この生成物は蛍光標識され、蛍光分光法で検出されます(図2)。

反応条件は、プレートリーダーで520 nmで最大の蛍光読み出しが得られるように最適化されました。1 ng/μL酵素では、FSL-1-ビオチンの完全な変換が観察されました8 (図3)。陰性対照には、酵素なし、酵素の不活性変異体(活性部位変異体C387S)、または低蛍光検出をもたらすチオール特異的阻害剤M...

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ディスカッション

ここで説明するLntアッセイのプロトコルは、トリアシル化生成物の蛍光検出に基づいて、高感度で再現性があります。ビオチンとストレプトアビジンの特異的かつ効率的な結合は、アッセイの重要な要素です。Lnt反応の完了後に残ったAlkyne-POPE基質もFAMで蛍光標識されますが、複数の洗浄ステップによってストレプトアビジンプレートに結合した後に効率的に除去されます。さらに、DMSOの添加はLnt活性に影響せず、アッセイに影響を与えません。基質と酵素はどちらも親油性が高く、混合ミセルでの反応条件が必要です。蛍光偏光を含む生成物検出を可溶性酵素および基質に依存する技術は適用できない8。アッセイの唯一の制限は、クリック化学反応がこの化学基に依存するため、酵素とアルキン基質との適合性です。

ゲルシフトアッセイは、Lnt活性を分析し、基質特異性を決定するために以前の研究で報告されています4。現在のプロトコルでは、蛍光分光法と並行して、ゲル内蛍光検出を使用してLnt活性...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

我々は、プロトコルに関する有益な提案をしてくれたパリパスツール研究所の技術資源研究センター(C2RT)のケモゲノミクスおよび生物学的スクリーニングプラットフォームのFabrice AgouとAlix Boucharlat、サポートと科学的議論のためのBGPBユニットのすべてのメンバー、および原稿の批判的な読書のためのSimon Legoodに感謝します。この研究は、カルノー感染症研究所およびカルノー微生物と健康研究所のグローバルケアイニシアチブ(15 CARN 0017-01および16 CARN 0023-01)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Äkta 清浄機 FPLC システムGE ヘルスケアNA純度: NA
Lnt 精製
アルキン-POPEAvanti Polar Lipids900414P純度: >99%
Lnt 基質
Azido-FAMLumiprobeA4130純度: 100% (純粋)
クリック試薬
BioPhotometer PlusEppendorfN/A純度: NA
OD 600 nm
BioTek ELX405 セレクト プレート ワッシャーBioTekN° serie 115800, n° materiel 405 セレクト 純度: NA
洗浄ステップ
ビオチン-フルオレセインSigma53608純度: ≥90%
蛍光制御
銅(II) 硫酸塩五水和物ΣC3036純度: ≥98%
クリック試薬
DDMAnatraceD310A純度: ≥ 99% β+α; < 15% α
Lnt精製用洗剤
ジメチルスルホキシド(DMSO)InvitrogenD12435純度:無水
溶解 クリック試薬
電子ピペット Voyager 8チャンネル 0.5-12.5 uLINTEGRA4721純度:NA
取り扱い試薬
フレンチプレッシャーセルN/AN/A純度:NA
細胞破壊
FSL-1-ビオチンEMCマイクロコレクションL7030純度:NA
Lnt基質
Greiner Bio-One 384ウェル標準 CELLSTARポリスチレンマイクロプレートGreiner781091純度:NA
ブラック、底面透明(上または下読み)
Greiner Bio-One 96ウェル滅菌ポリスチレンプレート、高結合Greiner655097純度:NA
ブラック、透明底面(上または下読み)
マイクロプレートリーダー Infinite M1000 proTecanN/A純度:NA
蛍光検出
MTSES (ナトリウム (2-スルホンナトエチル)メタネチオスルホン酸)AnatraceS110MT純度:~100%
チオール特異的阻害剤
光学的に透明な接着シールシートThermo ScientificAB-1170純度:NA
マルチウェルプレートをシールするホイル
Sephacryl S400 HR 16/60 gel濾過カラムGE HealthcareGE28-9356-04純度:NA
Lnt精製
ストレプタクチンセファロース 50 %IBA バイオテクノロジー2-1201-010純度:NA
Lnt精製
ストレプトアビジンSigmaS4762-1MG純度:≥13単位/ mgタンパク質
ビオチン結合
TBTA(トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミングマ678937純度:97%
クリック試薬
TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩シグマ75259:≥98%
クリック試薬
TECAN Infinite F500TecanN/A純度:NA
蛍光検出
TECAN Infinite M1000 proTecanN/A純度:NA
蛍光検出
サーモミキサー CEppendorf5382000015純度:NA
加熱蓋
Triton X-100Sigma93443純度:10% H2O
Lnt 反応バッファー
超遠心分離ベックマン LCN/A純度:NA
細胞分画
シ純度機

参考文献

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