方法論記事

フィロスフィアおよび植物発酵における微生物叢の組立を研究するためのグノトバイオティクスシステム

DOI：

10.3791/61149

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2020年6月3日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

この記事について

サマリー

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単一の微生物種または多種微生物群集がキャベツの葉表面でどのように相互作用するかを評価することを可能にする無菌ナパキャベツの栽培方法が開発されました。滅菌野菜抽出物も提示され、植物発酵中のコミュニティ組成の変化を測定するために使用できます。

要約

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フィロスフィアは、微生物によってコロニー形成され得る植物の地上部分であり、微生物群集のプロセスを同定するのに有用なモデルシステムである。このプロトコルは、ナパキャベツ植物のフィロスフィアにおける微生物群集ダイナミクスを研究するためのシステムを概説する。これは、焼成粘土と栄養ブロス基板を有する試験管で無菌植物を成長させる方法を説明しています。特定の微生物培養物を含む無菌植物の接種は、フィロスフィアにおける微生物の成長とコミュニティダイナミクスを測定する機会を提供する。発酵中に発生する微生物群集におけるキャベツのシフトから生成される無菌野菜抽出物の使用を通じても評価することができる。このシステムは、実験室で設定するには比較的簡単で安価であり、微生物群集の主要な生態学的な質問に対処するために使用することができます。また、フィロスフィアコミュニティの組成が植物発酵の微生物の多様性と品質にどのような影響を与えるかを理解する機会を提供します。グノトビオティックキャベツフィロスフィアコミュニティを開発するためのこのアプローチは、他の野生および農業植物種に適用することができます。

概要

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フィロスフィアの微生物多様性は植物の健康を維持する上で重要な役割を果たし、また、植物が環境ストレス11、2、3、4、52,3,4,5に耐える能力に影響を与える可能性があります。ひいては、作物の健康は食品の安全と品質に直接影響を与える6,,7 .植物は生態系機能の役割を果たし、関連するマイクロバイオームは、植物がこれらの活動を行う能力に影響を与えるだけでなく、環境自体に直接影響を与える8.科学者たちはフィロスフィアの機能と組成を解読し始めているが、フィロスフィア微生物群集に影響を与える生態学的プロセスは99,1010を完全には理解していない。フィロスフィアマイクロバイオームは、マイクロバイオーム11の生態を研究するための優れた実験システムである。これらのコミュニティは比較的単純で、コミュニティメンバーの多くは標準のラボ メディア10、12,、13で成長できます。

発酵野菜は、フィロスフィアのコミュニティ構造が重要な結果をもたらす1つのシステムです。ザワークラウトとキムチの両方において、植物の葉(ブラッシカ種のフィロスフィア)に自然に発生する微生物は、発酵14、15,15の接種として機能する。乳酸菌(LAB)は、植物性微生物叢のユビキタスメンバーと考えられているが、フィロスフィア16では豊富に存在し得る。発酵中の強力なアバイオティクス選択は、乳酸菌が豊富に増加することを可能にする微生物群集組成の変化を駆動します。LABが成長するにつれて、彼らは発酵野菜製品17の酸性環境を作り出す乳酸を生産する。フィロスフィアと発酵の間のリンクは、マイクロバイオームがどのように構造化されているかを理解するためのモデルとして野菜を使用する機会を提供します。

私たちは、無菌ナパキャベツを栽培し、スプレーボトルを使用して特定の微生物群集でそれらを接種する方法を開発しました。これは、個々の微生物または混合コミュニティのいずれかでキャベツを均等に接種する安価で信頼性の高い方法です。無菌野菜エキス(SVE)は、赤と緑のキャベツ(ブラッシカオレラセア)とナパキャベツ(B.ラパ)の3種類のキャベツタイプ/品種から開発されています。これらのSVEsに塩を添加すると、発酵環境が再現され、発酵マイクロバイオームアセンブリの小規模かつ比較的高スループットの実験研究が可能になります。これらの方法は、フィロスフィアにおける微生物群集と、フィロスフィアにおける微生物群集のダイナミクスを植物発酵の成功にどのように結び付けることができるかを研究するために使用することができる。

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プロトコル

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1. 無菌キャベツの栽培

  1. 無菌キャベツの栽培に備える装置
    1. 微細な粉塵を除去するために焼成粘土を洗浄
      1. 水道水で少なくとも3倍の焼成粘土(材料表)をすすい。水を排出します。
        注意:焼成粘土は非常に微細なほこりを生成し、洗浄時に保護マスク(材料表)を着用することをお勧めします。
      2. 焼成粘土を薄い層(〜4cm)としてオートクレーブトレイに広げ、ドライサイクル(121°C加熱20分、乾燥時間20分)でオートクレーブを使用して滅菌します。
      3. 焼成粘土を使用前に完全に乾燥させます。3日ごとに混ぜ合わせて焼成した粘土を完全に乾燥させ、均一な量の村重とスクーグ(MS)の栄養スープ(セクション1.2)を吸収します。
        注:乾燥はまた、それがチューブに計量されている場合でも、焼成粘土の量を維持するのに役立ちます。乾燥オーブンなどの他の手段による乾燥も適しているであろう。
    2. 無菌キャベツの栽培用ガラス製品のクリーニング
      1. 使用の間にガラス管(材料表)を十分に清浄し、殺菌してください。30%漂白剤溶液に30分間チューブを浸し、水道水でよく洗い流してから、細菌学の設定で酸洗浄で洗浄してください。酸洗浄双方向試験管キャップ(材料表)の使用間。
    3. 表面殺菌キャベツの種
      1. 1.5 mLマイクロ遠心チューブに最大100ナパキャベツ(B.ラパ・ヴァル・ペキネンシス)種子を入れます。
        注:1つのマイクロ遠心分離管に100以上の種子を追加したり、チューブのサイズを変更すると、種子コート除去の欠如のために種子の発芽率に影響を与える可能性があります。
      2. 種子に70%エタノール1mLを加え、5分間ボルテックスを加え、ピペットを使用してエタノールを捨てます。
      3. 50%の漂白剤と渦を1mL加えて5分間、ピペットを使用して漂白剤溶液を捨てます。
      4. 1 mLのオートクレーブ脱イオン水と渦を5分間加え、ピペットを使って脱イオン水を捨てます。
      5. ステップ 1.1.3.4 3x を繰り返して、すべての漂白剤をすすいでください。種子を柔らかくするために植える前に、2-8時間無菌脱イオン水に種子を浸します。
  2. 無菌キャベツの栽培
    注:ナパキャベツ(B.ラパ・ヴァル・ペキネンシス)は、村重・スクーグ(MS)栄養スープに浸した焼成粘土を含むガラス管(15cm x 2.5cm)で栽培されている(図1)。
    1. きれいなガラス管(15 cm x 2.5 cm)にきれいな焼成粘土の10gを量る。
    2. 1Lの脱イオン水に4.4gのMS培地を溶解してMS栄養スープを調製する。各ガラス管にMS栄養スープ(約9mL)を加え、ピペットを使用して焼成粘土を覆います。
      注:チューブ内の液体を立つことは、種子が発芽するのを防ぐので、いくつかのチューブに少し少ないMSスープを追加する必要があるかもしれません。
    3. 22 mmの双方向試験管キャップとオートクレーブ(121°C、60分間)を緩くキャップします。オートクレーブから取り外すときは、キャップをガラス管に押し付けて密封します。使用前に室温までチューブを冷却します。
    4. 滅菌、超長(25.4cm)鉗子を使用して、各チューブの中央に1つの無菌キャベツの種をそっと置きます。チューブを7ウェイトレイに入れ、24°Cで16時間の光サイクルでライトラック(フルスペクトルT5蛍光灯または植物の成長のための他の照明設定)の下に置きます。
      注:種子は一晩発芽し、5日後に最初の真の葉を開発します。真の葉は、コチルドンが形成された後の最初の血管葉である。それはよりしわのエッジを持っており、 ブラッシカラパ では毛状突起で覆われています。
  3. 無菌キャベツの無菌性試験
    注:キャベツが無菌であるかどうかをテストするには、各バッチからいくつかの(5-10)キャベツを選択し、遊蔵コロニーがあるかどうかを判断するためにプレートアウトします。
    1. 植物の基部を滅菌鉗子でつかみ、引き抜いて、ガラス管からキャベツをそっと取り出します。キャベツをチューブから完全に取り除く前に、滅菌解剖はさみを使用して根を慎重に切断してください。キャベツの葉を1.5mLマイクロ遠心分離チューブにコンパクトにします。
      注:キャベツを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れやすくするために、キャベツがまだチューブ内にある間、大きなキャベツの1つまたは2つを取り除く必要があります。これらの大きな葉は、キャベツ全体が必要な場合は、キャベツの残りの部分がチューブに入れられた後、1.5 mLチューブに追加することができます。
    2. 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブに400 μLのリン酸バッファー生理食塩水(PBS)を加えます。滅菌ミクロペススルを使用して、30倍の害虫でキャベツを均質化する。
    3. キャベツのプレート100μLは寒天プレート上にホモジュネイトし、サンプルに汚染物質が存在するかどうかを判断します。フィロスフィアに見られるほとんどの細菌は、トリプティック大豆(TS)寒天プレートで増殖します。キャベツホモジュネートが厚く、通常のピペットの先端を詰まらせることができるので、キャベツホモジュネートをメッキする際に広いオリフィスピペットチップを使用してください。

2. 微生物溶液を使用してフィロスフィアを接種する

  1. 接種株のグリセロールストックを作る
    注: 表 1 は、このステップで使用できる微生物分離株を示しています。他のフィロスフィア分離株もここで使用することができます。
    1. 新鮮なストリークから個々のコロニーを、同じメディアの2/3の新しいプレートに密にストリークアウトして、多くのコロニーを得る。
    2. ストリークを2〜5日間成長させ、すべてのプレートから15mLの15mLのグリセロールを含む円錐形チューブにコロニーを削り、渦を完全に混ぜます。
    3. 1 mLのグリセロールストックを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、使用するまで-80°Cでグリセロールストックを保管します。キャベツを接種する際に比較的大量の接種液が必要となるため、残りの14mLのグリセロールストックを-80°Cで保存してください。
    4. 使用の1週間前に、氷上にグリセロールストック1mL(ステップ2.1.3から)を含む1.5mLチューブを解凍し、希釈し、いくつかの異なる希釈物(例えば、10-4、10-5、および-510-6)でプレートを取り除き、14mLの濃度(コロニー形成単位[CFU]/μL)を決定する。
  2. 殺菌接種スプレーボトル
    1. アンバーラウンドボストンポンプボトル(59 mL)を分解し、すべてのコンポーネント(ポンプ、チューブ、キャップ、ボトル)を30%漂白剤溶液に30%浸し、蓋がしっかりとフィットする大きなプラスチック容器に入れます。
    2. 浸した後、容器の蓋の片隅を持ち上げて容器からすべての漂白剤を慎重に注ぎます。
    3. プラスチック容器にオートクレーブ脱イオン水(容器サイズに応じて1L)を充填してボトルをすすい、再び片隅に蓋を持ち上げて脱イオン水を慎重に注ぎます。
    4. 70%エタノール溶液を噴霧し、30分間UV光を点灯させることで、バイオセーフティキャビネットを殺菌します。
      注:バイオセーフティキャビネットでこの作業を続けて、ボトルが空気乾燥中に微生物汚染のリスクを持たないようにしてください。
    5. 大きなプラスチック容器からボトルを取り出し、ピペットを使用してオートクレーブ脱イオン水で各ボトルを充填します。ポンプを組み立て直し、各ボトルに1つずつ入れます。各ボトル(ボトルあたり10スプレー)を通して脱イオン水をポンプで送り、ボトルのポンプコンポーネントから漂白剤を取り除きます。
    6. ステップ 2.2.5 を繰り返して、すべての漂白剤がガラス瓶から取り除かれるようにします。
    7. ボトルが無菌であるかどうかをテストするには、ボトルごとに番号を付けて(完全に乾燥したときにラボテープをボトルの側面に貼り付けます)、ボトルのそれぞれに1x PBSの10 mLを追加し、TS寒天プレートに3スプレーをポンプします。スプレーした後、室温で1週間プレートをインキュベートします。任意のコロニーがプレート上に成長する場合、それはそれぞれのボトルが無菌ではないことを示し、実験に使用すべきではありません。
    8. 滅菌ボトルを保管する前に、残りのすべてのPBSを取り除き、ボトルをバイオセーフティキャビネットで十分に乾燥させます。滅菌ボトルは、使用されるまで滅菌プラスチック容器(通常はボトルの漂白に使用される容器)に保管してください。
  3. 微生物の接種を準備し、無菌キャベツを散布する
    注意:ラボベンチで行われた場合、作業面を汚染したり、健康上のリスクを引き起こす可能性のある微生物溶液を噴霧すると、すべてのステップはバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
    注意:キャベツは5日後に真の葉を形成するので、任意の微生物溶液を接種する前にキャベツを植えた後1週間待つことをお勧めします。チューブが密閉されるため、キャベツに水をやる必要はありません。小さなチューブがキャベツの成長を制限するので、実験は植え付けから1ヶ月以内に行われるのが最善です。
    1. グリセリンストックを氷上で解凍し、所望の接種濃度(ステップ2.1.4で1mLアリコートを解凍してメッキすることによって決定される濃度)に1xPBSで希釈した。
      注:さまざまな異なる接種レベルを使用することができますが、フィロスフィア分離株は10日間でキャベツスラリーの104 から108 CFUs / mLに成長することができます。
    2. 希釈グリセロールストック10 mLを無菌ポンプボトルに加え、ボトルポンプコンポーネントから残留PBSを除去するために、5スプレーを大きな廃棄物回収ビーカーに送り込みます。
    3. キャベツチューブから蓋を外し、キャベツをスプレーボトルに向かって傾け、接種液の3つのポンプで各キャベツをスプレーします。
    4. 接種後、キャベツのサブセットを収穫し、実際のインプット接種濃度を評価する。殺菌された鉗子が付いている管からのキャベツを取り除く。無菌解剖はさみで根を切り落とし、キャベツを前重い1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに慎重に入れます。計算にキャベツのCFUs/gが必要な場合は、将来の計算のためにキャベツの重量を記録します。
    5. キャベツを含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに400μLの1x PBSを加え、30倍粉砕してキャベツを1x PBSに均質化するために無菌マイクロペステスルを使用します。
    6. キャベツのホモジュネートを薄め(必要な場合)、ペスト状のキャベツ混合物をプレートアウトします。それは厚く、植物組織片でいっぱいになるので、キャベツスラリーをピペット化するための広いオリフィスのヒントを使用してください。

3. 無菌野菜エキスの準備

注:この方法は、キャベツ滅菌メディア生産18、19,19の修正版です。

  1. スーパーからキャベツを買います。ラボでは、キャベツの最も外側の葉を取り除き、捨てます。残りのキャベツをすべてブレンダーに収めるためにみじん切りにし、キャベツを細かいパルプに均質化し、キャベツはそれ以上のブレンドで細かくならない。
    注:滑らかな均質なパルプにキャベツを刻むことができる任意のブレンダーは、この方法に適している必要があります。
  2. ブレンドキャベツホモジュネートの重量を量り、キャベツ1グラムあたり2mLの蒸留水を加えます。2層のバスケットコーヒーフィルター(未漂白紙)を通して、ブレンドキャベツスラリーをフィルター処理します。
  3. キャベツスラリーを遠心分離管に分配します(サイズは遠心分離機に依存します)。濾過キャベツスラリーを20,000 x g で20分間遠心し、大きな粒子が溶液から落ち着くまで20分間。
    注:キャベツ粒子がフィルター滅菌装置を急速に詰まらせるので、キャベツスラリーを長時間遠心分離することが不可欠です。
  4. 血清ピペットを使用して、ペレットキャベツを乱さないよう、ペレットキャベツの破片から上清を取り除きます。標準的な塩濃度が使用されている発酵条件を再現することを目指す場合は、このステップで2%w/v NaClを加えます(すなわち、フィルター滅菌の前に)。
  5. 真空に取り付けられた0.2 μmフィルター(500mLまたは1 L)を使用して、植物抽出物を殺菌します。滅菌チューブ(50 mL遠心分離チューブまたは15 mL遠心分離チューブ)に塗布し、使用するまで-80°Cで凍結します。

4. 無菌野菜抽出物の接種

  1. SVEを解凍し、490 μLを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに分配します。各タイムポイント測定が破壊されるように、1回の時点で処理ごとに少なくとも5つの反復を有するのに十分なチューブを使用してください。
  2. 微生物のグリセロールストックを氷上で分離し、所望の濃度に1x PBSで希釈する。乳酸菌の濃度は、SVEのmLあたり5,000 CFUと低くすることができます。この濃度を達成するために、10 μLが500μLの総体積の接種に使用されるため、250 CFUs/μLに希釈した在庫を使用します。
  3. 10 μLの希釈された微生物分離液を使用してSVEを接種します。ピペットは数回上下して徹底的に混ぜます。所望の温度(キムチ製造温度の場合は14°C、最も暖かいザワークラウト発酵の場合は24°C)でインキュベートする。
  4. 1日目、2日目、4日目、7日目、14日目に複製管を収穫することにより、SVE中の微生物分離株の増殖率を測定する。
    注:発酵は最初に急速に進行し、時間の経過とともに遅くなります。したがって、初期のタイムポイントが多いほど、発酵がどのように進行するかをダイナミクスに対してより大きな解像度で示します。
  5. 各タイムポイントで、数回上下にピペットを入れ、接種されたSVEをよく混ぜます。接種したSVEを1x PBSで連続して希釈し、プレートを寒天プレートにプレートします。コロニーを数える前に4-7日間寒天プレートをインキュベートします。
    注:人間、ロゴサ、シャープ(MRS)寒天は、すべての乳酸菌を列挙するために使用されるべきであり、酵母ペプトンデキストロース(YPD)は酵母に使用し、他のほとんどの細菌は肺圏から分離するTS寒天を使用する必要があります。
  6. マイクロpHプローブを用いて、各時点でサンプルのpHを記録します。
    注:pHプローブはチューブ/処理の間で細胞を移動するので、このステップはめっき後に行う必要があります。

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結果

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ナパキャベツの成長率
種子滅菌法は、いくつかの異なるナパキャベツ(B.ラパ・ヴァル・ペキネーゼ)で試験した。 補足図 1)多くの異なるサプライヤーから、すべてが同様の成長率で一貫して成長しました。しかし、 ブラシカ の異なる種でメソッドをテストする(B. ラパ: カブパープルトップ; B. オレラセア: カイロハイブリッド, トロピックジャイアントハイブリッド; B. カンペストリス: パクチョイトイチョイハイブリッド; B. ジュンセア: マスタード レッド ジャイアント) は限られた成功を与えた (補足図 2).ガラス管に収まるコンパクトなきちんとしたロゼットを形成するナパキャベツとは異なり、これらの Brassica spp.は殺菌後の発芽率が低いか、茎が急速に伸びてスピン状の不健康な植物を作りました。さらに、古い種子(>1歳)を...

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ディスカッション

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無菌ナパキャベツ植物は、ナパキャベツフィロスフィア17における乳酸菌の分散制限を研究するために使用されてきた。無菌ナパキャベツは、フィロスフィアの個々または対方向の成長をテストするためにも使用できます(図1)。無菌野菜抽出物の製造方法は、3種類のキャベツ(赤、緑、ナパ)でテストされています。これらの各 SVI は、信頼性の高い成長メディアとして機能します。接種された微生物は、異なる媒体間で一貫して成長する。SVEの単一株の増殖速度(図2)は、LABが急速に成長し、発酵17で予想されるのと同じ方法でメディアを酸性化することを示しています。

無菌植物および無菌植物抽出物は、フィロスフィアや発酵中の優先効果や継承など、さまざまな生態学的な質問に対処するために組み合わせて使用することができます。微生物の合成界面は、均質化されたキャベツをめっきしてフィロソファー分離物を得たり、ま...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この作業は、USDA-NIFA助成金(2017-67013-26520)によって支えられていました。トレイシー・デベンポートとクレア・フォガンはテクニカルサポートを提供し、ルビー・イェとケイシー・コセッタはこの原稿の初期バージョンについて役立つコメントを提供しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL微量遠心チューブVWR20170-650
15 mLコニカルチューブファルコン352096
7ウェイトレイ シグマゼンタT8654
琥珀色の丸型ボストンガラス瓶GPS 712OZSPPK12BRAmazon.com でさまざまなサプライヤーから注文
バスケットコーヒーフィルター気になる場合(無漂白紙)ホールフーズ
漂白剤(水銀フリー)オースティンの50-010-45
ホウケイ酸ガラス管VWR47729-586
成粘土ターフェイスMVPAmazon.com に注文ルートナチュラル6クォートバッグから購入。粒径約3-5 mm
クイジナートブレンダークイジナートクイジナート ミニプレッププラス フードプロセッサー、3カップ
解剖はさみ7-389-Aアメリカの教育製品Amazon.com エ
タノールVWR89125-172
鉗子Aven18434Amazon.com
グリセロールフィッシャーで注文Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
大型プラスチック容器メイドAmazon.com
ライトラックGardner's Supply39-357フルスペクトル T5 蛍光灯
Magenta tm 2 ウェイキャップMillipore SigmaC1934
Man, Rogosa, and SharpeフィッシャーサイエンティフィックDF0881-17-5この培地はブロス用で、15 gの寒天を加えてプレートを作ります
マイクロpHプローブ サーモサイエンティフィック8220BNWP
マイクロペストル カロライナ215828ペレット乳棒
MS栄養ブロスミリポアシグマM5519ムラシゲとスクーグ 基礎ミディアム
NaClシグマ アルドリッチS9888
白菜の種ジョニーズセレクトシード2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
シャーレ 100 mm x 15 mmフィッシャーFB0875712寒天板の製造に使用
リン酸緩衝生理食塩水フィッシャーサイエンティフィック50-842-941テクノバ
植物組織培養ボックスシグママゼンタ GA-7
血清学ピペットVWR89130-900
滅菌ダボピューリタン10805-018滅菌するために使用する前にオートクレーブ
;m フィルターNalgene974103
トリプシン性大豆寒天フィッシャー・サイエンティフィックDF0370-17-3この培地はブロス用で、15 gの寒天をプレートにするために添加します
ワイドオリフィス・ピペットチップレイニン17007102
、ペプトン、デキストロースフィッシャー・サイエンティフィックDF0428-17-5この培地は適していますが、培地は酵母、ペプトン、デキストロースを使用して作成することもでき、プレートを作るときに15 gの寒天を加え
焼から ラバーで注文 滅菌0.2&マイクロを培地 酵母ます

参考文献

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