シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Summary

ここで、 piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を用いたヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集のための詳細な方法について述べる。ヒト胚性幹細胞(hESC)の肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座のエクソン8に2点変異を導入した。

Abstract

RNAガイド下クラスター化規則的間隔短回文反復(CRISPR)-Cas9などのカスタム設計のエンドヌクレアーゼは、哺乳類細胞での効率的なゲノム編集を可能にします。ここでは、ヒト多能性幹細胞における肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座を例としてシームレスにゲノム編集するための詳細な手順を記載する。 piggyBacベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニッカーゼ変異体を2段階の遺伝子選択で組み合わせることで、HNF4α遺伝子座の正確かつ効率的なターゲティングを実証します。

Introduction

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、研究または診療所のための体細胞の無制限の供給源を表しています¹。hPS細胞における遺伝子ターゲティングは、細胞仕様中の遺伝子機能を研究し、疾患のメカニズムを理解するための強力な方法を提供します。効率的なゲノム編集法は存在しますが、hPS細胞の遺伝子を改変することは技術的に困難なままです。hPSCにおける相同組換えによる標準的な遺伝子ターゲティングは、低頻度で起こるか、一部の遺伝子では検出できないことさえあり²、したがって、これらの細胞ではDNA二本鎖切断(DSB)刺激遺伝子ターゲティング(遺伝子編集と呼ばれる)が必要である^2,3。さらに、hPSCのトランスフェクションとそれに続くシングルセルクローニングは、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を使用することで単一細胞関連アポトーシスを低減できるにもかかわらず、あまり効率的ではありません⁴。最後に、目的の遺伝子における潜在的なオンターゲットおよびオフターゲット変異も問題となる可能性があります。したがって、hPSCに調整された遺伝的変化を行うには、信頼できるプロトコルが不可欠です。

RNAガイドCRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復)およびCRISPR関連タンパク質9(Cas9)テクノロジーは、現在、遺伝子編集において確立されたツールです。転写されたCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化RNA(tracrRNA)は、Cas9タンパク質と複合体を形成して遺伝子特異的切断を可能にするシングルガイドRNA(sgRNA)を形成します⁵。CRISPR/Cas9システムは、sgRNAの20 bpガイド配列を変更することでプログラム可能であり、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)要件を満たすほぼすべての遺伝子座を編集することができます。ただし、野生型Cas9は、そのガイド配列とDNAターゲットとの間のいくつかの不一致を許容することができ、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があります。その特異性を向上させるために、ニッカーゼ変異体(Cas9n)が開発されました。D10AまたはN863A変異を含むCas9nは、1つの機能的なヌクレアーゼドメインしか持たず、その結果、1本の鎖上のDNAしか切断できません。適切な間隔と配向のCas9nのペアは、DNA DSBを効果的に誘導することができ、オフターゲット効果は劇的に減少します⁶。効率的なCas9n修飾を確実にするために、2つのCas9n-sgRNAを理想的には-4〜20 bpのオフセットで配置し、常に5'オーバーハング⁶を作成する必要があることが示されています。

Cas9(n)-sgRNA誘導性DSBは、hPSCのゲノム編集に利用できます^7,8。非相同末端結合修復を介して遺伝子ノックアウトを作成したり、ドナーDNAテンプレートが存在する場合は相同性指向修復(HDR)を介して遺伝子改変を導入したりすることができます。ここで説明するプロトコルは、HDR用のpiggyBacトランスポゾンベースのドナープラスミド(またはターゲティングベクター)を使用し、薬剤耐性マーカーがトランスポゾン反転リピートによって隣接している。このアプローチの利点には、Yusaらによって最初に実証されたように、効率的なスクリーニングとシームレスな遺伝子編集が含まれます^9,10。薬物選択カセットは、統合されたベクターで細胞を濃縮することを可能にし、その後、ジャンクションPCRによってスクリーニングされ、HDRによって誘導されたものを同定する。さらに、薬物選択カセットは、Cas9(n)切断のターゲット配列を置き換えるように配置できるため、HDR後にそれ以上のDNA切断は発生せず、Cas9(n)再切断に起因する「オンターゲット」変異を排除します。さらに、piggyBacトランスポザーゼによって触媒される正確な切除を利用することにより、選択マーカーは瘢痕を残さずにゲノムから切除されます。piggyBac挿入のための元の内因性TTAA配列のみが、薬物選択^{マーカー9}の除去後に残る。置換を導入することによってTTAAサイトを作成する必要がある場合でも、規制要素を乱す可能性は他の方法と比較して減少します¹⁰。

ここでは、hPSCにおけるシームレスなゲノム編集を実装するための詳細な手順について説明します。 PiggyBacベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニッカーゼ変異体を2段階の遺伝子選択で組み合わせ、肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子¹¹に2つの所定の点変異を導入しました。このアプローチは信頼性が高く効率的であり、ヒト多能性幹細胞の内胚葉および肝細胞の仕様においてHNF4αが果たす重要な役割の詳細な分析を可能にしました¹¹。

Protocol

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA発現プラスミドの設計と構築

1. 改変部位付近の5'-NGGのすぐ上流にある20 bpのガイド配列を検索します。 化膿レンサ 球菌由来のCas9ニッカーゼ(Cas9n)を使用する場合は、一対のシングルガイドRNA(sgRNA)が必要です。sgRNAのペアは、-4〜20 bpのオフセット⁶でニッキング時に5'のオーバーハングを生成できなければなりません。
2. 必要なオリゴとpSpCas9n-2A-プロベクターを注文します。
3. sgRNAをpSpCas9nベクターにクローニングして、公開されたプロトコル¹²に従ってCas9nと共発現させる。

2. piggyBacベースのターゲティングベクターの設計と構築

1. 標的遺伝子配列をダウンロードし、改変部位付近のTTAA部位を検索する。
   注: TTAA サイトと変更予定サイトの間の距離は、できるだけ短くする必要があります。コード配列内で、100-bp以内にTTAA部位が存在しない場合は、同義ヌクレオチド置換を行って導入する必要がある。
2. ホモロジーアーム(HA)を設計し、HAに目的の点変異を組み込みます。HA の最適な長さは、約 500 〜 1200 bp である必要があります。
   注:Cas9nの再切断の可能性を回避するために、PAM配列を変異させるために同義のヌクレオチド置換を導入することをお勧めします。
3. 確立されたプロトコル¹⁰に従って最終的なターゲティングベクトルを構築する。
   注:ここで使用されるターゲティングベクターでは、PGKプロモーター駆動のpuro-deltaTK選択カセットがトランスポゾン反転リピートによって隣接されています。

3. ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集

1. ヒト多能性幹細胞(hPSC)を加湿インキュベーター内で37°C、組換えラミニン521コーティング表面(5 μg/mL)の5%_CO2 をmTeSR1培地¹³に維持します。細胞は、1:3の分割比の後、72時間後に70〜85%のコンフルエントに達するはずです。
   注:存在する場合は、毎日の培地交換の前に、自然に分化した細胞を穏やかに吸引して取り除きます。
2. トランスフェクション当日、24 ウェルプレートのウェルに 300 μL のラミニン 521 溶液 (5 μg/mL) を 37 °C で 2 時間以上コーティングします。
3. コーティング溶液を穏やかに除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した300 μLの新鮮なmTeSR1培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻して細胞を受け取ります。
   注意: ラミニンコーティング溶液を除去するときは、プレートを乾燥させないでください。
4. ストックhPSCをインキュベーターから移動し、使用済み培地を除去してから、1 mLの滅菌1x DPBSを使用して細胞を1回洗浄します。
5. 穏やかな細胞解離試薬1 mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cで6〜8分間インキュベートして細胞を解離させます。
   注意: プレートを軽くたたき、細胞が簡単に剥がれるかどうかを確認して、消化が十分に長いかどうかを判断します。
6. P1000チップを使用してゆっくりと上下にピペットで動かし、すべてのhPSCを持ち上げます。
7. 10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地を細胞懸濁液に加えて解離を終了します。
8. よく混合し、単一細胞懸濁液を50 mLチューブに移し、室温で200 x g で3分間遠心分離します。
9. 上清を除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地に細胞をよく再懸濁します。
10. 血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。トリパンブルーを使用して、死んだ細胞を染色して除外します。
11. 8 x 10 5から1 x 10⁶生細胞を各ヌクレオフェクション反応のために^1.5 mLチューブに移し、200 x gで3分間遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引します。
12. 3 μgのペアCas9n-sgRNA発現プラスミドと5 μgのターゲティングベクタープラスミドを、ヒト幹細胞核効果キットの100 μLの混合ヌクレオフェクション溶液/サプリメントに混合します。キットのGFPコントロールプラスミドを使用し、GFPコントロールプラスミドミックスも調製します。
    注:核代謝前のエンドトキシン汚染を減らすために、すべてのプラスミドのマキシプレップを行うことが重要です。プラスミドの濃度は約1 μg/μLである必要があります。
13. DNAミックス(容量~111 μL)を使用して、調製した細胞を再懸濁し、気泡を避けてエレクトロポレーションキュベット(ヌクレオフェクションキットに付属)に移します。
14. ヒト多能性幹細胞に最適化された条件を選択することにより、核オフフェクションデバイスを使用して細胞をエレクトロポレーションします。
    注:ヒト多能性幹細胞用の核効果キットを初めて使用する場合は、エレクトロポレーションプログラムをテストし、最も効率的なものを選択する必要があります。
15. 10 μM ROCK阻害剤を添加した37°CのmTeSR1培地に、新鮮で温かい500 μLをエレクトロポレーション細胞に直ちに加えます。ステップ3.2および3.3で調製した24ウェルプレートの2ウェルにミックスを移します。
16. プレートを37°C/5%_CO2 インキュベーターにすばやく戻し、細胞を回復させます。
17. 12〜16時間後、細胞維持培地を交換します。細胞が細胞間接触を確立した場合は、ROCK阻害剤を回収し、そうでない場合は、阻害剤を培地に補充し続ける。
18. 24〜48時間の間に、コントロール細胞におけるGFP発現を調べることにより、核オフ化効率を確認する。GFP陽性細胞は少なくとも30%でなければなりません。
19. ニュークレオフェクションの48時間後、mTeSR1培地に1 μg/mLのピューロマイシンを添加して細胞の選択を開始します。
20. ヌクレオフェクションの72時間後、mTeSR1培地に0.5 μg/mLのピューロマイシンを補充します。細胞コンフルエントが30%より低い場合は、10 μM ROCK阻害剤も培地に補給します。
21. ヌクレオフェクション後4〜6日で、ピューロマイシン耐性細胞を0.8細胞/ウェルの濃度で10〜15 x 96ウェルプレートに継代します。
    注:培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補給することが不可欠です。
22. これらの細胞を37°C/10%CO2で10〜₁₂ 日間維持して、単一細胞由来のコロニーを形成します。播種後7日で培地を補充する。
    注:_CO2 レベルの上昇は、私たちの経験から単一のhPSCがコロニーを形成するのに役立ちます。
23. 単一コロニーを含むウェルにマークを付け、培地を0.5 μg/mLのピューロマイシンを含むがROCK阻害剤を含まない新鮮なmTeSR1培地に置き換えます。
    注:この時点から、細胞は37°C / 5%_CO2の下で成長します。
24. 2日後、未分化コロニーを含むウェルの培地を交換した。培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補充します。
    注:一部のウェルでは、細胞が分化している可能性があり、廃棄する必要があります。
25. P2ピペットチップを使用して、コロニーをやさしくこすり落とします。1つのコロニーに由来する細胞懸濁液を別々の96ウェルプレート上の2つの新しいウェルに移し、1つはジェノタイピングに、もう1つは維持に使用します。
    注:コロニーを注意深く維持し、自然分化レベルを最小限に抑えることが重要です。
26. ほとんどのウェルのコンフルエントが50%以上に達したら、ジェノタイピング用の細胞を含むプレートを取り出します。使用済みの培地を捨ててから、DPBSで細胞を一度洗浄します。
27. Bradley溶解バッファーを使用してウェル内の細胞を溶解し、関連するプロトコルに従ってプレート内の各ウェルからゲノムDNAを分離します(https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate)。
28. 3プライマージャンクションPCR法を用いて、左右両方の相同性アームを独立して遺伝子型決定する¹⁰。
    注:PCR法を示すスキームを 図2に示します。
29. サンガーシーケンシングのために4〜5コロニーから両方の相同性アームのジャンクションPCR産物を送り、配列を取得します。
    注:2つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Aに示します。
30. 正しい遺伝子型のコロニーを保持し、残りを破棄します。
31. 連続的なピューロマイシン選択の下で正しいコロニーを拡大し、可能な限り早い継代でそれらを凍結する。

4. 標的ヒト多能性幹細胞からのトランスポゾン除去

1. 正しい遺伝子型のコロニーを 1 つ 0.5 μg/mL ピューロマイシン選択下に維持します。
2. 上記のように5μgの高活性トランスポザーゼ(pCMV-hyPBase)を有するNucleofect 8 x 10⁵ 〜1^{x 10 6} 細胞(セクション3、ステップ3.4〜3.18)。GFP制御の核反応を並行して行います。
   注:ピューロマイシンは、これらの細胞を核放出した直後にmTeSR1培地から除去する必要があります。
3. 公開された手順に従ってpuro-deltaTK選択カセットを取り外した細胞を増殖させ、スクリーニングします¹⁰.
   注意: 元の手順に注意深く従うことが重要です。FIAU、または1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードラシル)は、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSV-tk)ベースのネガティブセレクションのチミジン類似体として使用されました。
4. 修飾領域を配列決定し、トランスポゾンの除去を確認する。
   注:3つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Bに示します。
5. コロニーを正しい遺伝子型で保持し、さらなる使用のために拡張します。
6. 選択したコロニーの多能性マーカーの特性評価を実行してから、さらなる分析に使用します。
   注:2つの確立されたコロニーの特性評価を 図4に示します。

Results

ターゲティングベクトルベースのノックイン戦略
肝細胞核因子4アルファ(HNF4α)遺伝子は、エクソン8に2点変異を導入するための標的ゲノム編集のために選択されました。11 bpオフセットを有するCas9n-sgRNAのペアを、修飾する部位の近くに設計した。 piggyBacベースのターゲティングベクターは、所望の点突然変異を導入するための相同性指向修復テンプレートとして機能した。同義ヌクレオチド置換または所望の点変異を組み込んだ967 bp 5'-HAおよび1142 bp 3'-HAを増幅し、最終ターゲティングベクターにクローニングした。 piggyBac 挿入部位は、2つの所望の点突然変異から16bpおよび22bp離れていた。ピューロデルタTK選択カセットを含むコロニーを、第1ラウンドでピューロマイシンで選択した。2回目のトランスポザーゼ切除によって選択カセットが除去されると、標的部位は、遺伝子に組み込まれた所望の点突然変異のみでシームレスに改変されました(図1)。

ヒト多能性幹細胞における遺伝子編集
正しく標的とされた細胞をスクリーニングするために、ジェノタイピングに3つのプライマーベースのPCR法を使用しました(図2)。PCR結果を確認するためにサンガーシーケンシングを行った(図3A)。選択カセットの除去後、改変領域を再度配列決定し、所望の点突然変異の正しい導入を確認した(図3B)。

編集されたヒト多能性幹細胞のコロニー樹立と特性評価
正しい遺伝子型を有するコロニーを選択し、必要に応じて拡大した。確立されたコロニーは、さらなる分析に使用する前に特徴付ける必要があります。編集された細胞は、親細胞と同じ形態を有する(図4A)。それらはまた、転写因子NANOGおよびOCT4(図4 B)、ならびに細胞表面マーカーSSEA4およびTRA-1-60(図4C)を含む代表的なヒト多能性幹細胞マーカーを発現する。

図1:ターゲティングベクターベースのノックイン戦略¹¹. 一対のCas9n-sgRNA発現プラスミドを用いて、HNF4α遺伝子のエクソン8におけるDNA二本鎖切断を誘導した。選択カセットを有するターゲティングベクターを用いて、16bpおよび22bp離れた位置に位置する所定の点変異を導入した。この選択カセットは、構成的に活性なプロモーター(PGK)によって駆動されるポジティブ-ネガティブ選択マーカー(puro-deltaTK)からなる piggyBac トランスポゾン内に含まれていました。相同性指向修復経路を介して、標的細胞は選択カセットを組み込んだ。トランスポザーゼによって媒介されるトランスポゾン切除は、点突然変異のみが存在するシームレスな修飾をもたらす。赤十字は、目的の点突然変異の位置を示します。HA = 相同性アーム;PB = ピギーバック;PM =点突然変異。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:3つのプライマーベースのPCR法。 遺伝子標的細胞をスクリーニングするために、PCRベースのジェノタイピングが使用されました。3つのプライマー、LA-F1、-R1および-R2を用いて、左相同性アーム領域を増幅した。独立して、RA-F1、-F2および-R1を用いて、右相同性アーム領域を増幅した。ゲル電気泳動結果に基づいて、非標的細胞、ならびにヘテロ接合細胞およびホモ接合細胞を、互いに区別した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:遺伝子改変細胞の配列決定結果¹¹. 2つのクローンからのPCR産物を配列決定し、標的遺伝子座(A)における選択カセットの正しい挿入を確認した。5'および3' のpiggyBac 逆ターミナルリピート(ITR)は、TTAAダイレクトリピートに隣接していました。3つのクローンをトランスポゾン切除後に配列決定した(B)。11 bpオフセットを有するCas9n-sgRNAのペアを使用して、DNA二本鎖切断を導入しました。2つの所定の点突然変異(AからGおよびAからC)を遺伝子に導入した。1つの同義変異は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を変異させるために導入され、もう1つは piggyBac 切除に必要なTTAA部位を作成するために導入されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:編集されたヒト多能性幹細胞の特性評価。 2つの編集された細胞株と親細胞(A)の形態は、スケールバー=100μmである。多能性幹細胞マーカーNANOGおよびOCT4の発現を免疫染色により調べ(B、スケールバー=50μm)、フローサイトメトリーによるSSEA4およびTRA-1-60に加えて(C)2つの改変細胞株および親細胞とした。陰性対照としてIgGを用いた。DAPIは核を染色するために使用されました。百分率は、3つの独立した実験の平均として計算した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

本明細書に記載されるプロトコルは、hPSCの内因性遺伝子座に所定の点突然変異を導入するために使用することができる。 piggyBacベースのターゲティングベクターとペアのCRISPR/Cas9n発現プラスミドの組み合わせは、信頼性が高く効率的であることが証明されました¹¹。HNF4α遺伝子編集後、解析された43クローンのうち12クローンが、ジャンクションPCRスクリーニングによって決定されたとおりに正しく標的化されました。具体的には、バイアレルターゲティング効率は約21%(9/43)、モノアレルターゲティング効率は約7%(3/43)でした。

ターゲティング実験の後、スクリーニングの最初のラウンド中に標的遺伝子座を piggyBac トランスポザーゼにアクセスできるようにするために、ピューロマイシンの選択を維持することが重要です。これにより、PGKプロモーター駆動のピューロデルタTK選択カセットのサイレンシングが最小限に抑えられ、スクリーニング¹⁰の第2ラウンドのバックグラウンドが減少します。最近の報告では、hPSCにおいてCAGプロモーターがPGKプロモーターよりもサイレンシングに対して耐性が高いことが示されました¹⁴。したがって、選択カセットのプロモーターを変更することで、将来的にこのシステムが改善される可能性があります。また、hyPBaseトランスフェクト細胞とGFPトランスフェクト細胞からの耐性コロニーの数を比較することも重要です。トランスポゾンの除去に成功すると、GFPトランスフェクト細胞よりもhyPBaseからの生存コロニーが多くなるはずです。トランスポゾン切除のPCR分析に加えて、切除の忠実度を確認するために、修飾領域の直接シーケンシングが必要です。

YusaのpiggyBacトランスポゾンベースのターゲティングベクター戦略^9,10に基づいて、上記の手順は、hPSCの核代謝および単一細胞クローニング効率の改善に焦点を当てた。細胞播種密度は、不均一なコロニー形成の可能性を低減するように最適化されました。また、遺伝子型スクリーニングのためのコロニー産生を強化するために、10%CO2下で10〜₁₂日間の培養を採用しました。私たちの経験では、各96ウェルプレートから約20のコロニーを得ることができました。この手順は他の方法よりも時間がかかる場合がありますが、信頼性が高く、非常に効率的です。

必要に応じて、点突然変異の導入または修正、レポーター細胞株の作成、および遺伝子発現のノックアウトを行うターゲティングベクターを設計することができます。結論として、CRISPR/Cas9(n)システムとターゲティングベクターの組み合わせは、異なるタイプの遺伝子組み換えhPSCを送達するための効率的な方法です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗ヒト SSEA4 PE	eBioscience	12-8843-42
抗ヒト TRA-1-60 PE	eBioscience	11-0159-42
DPBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144
カルシウムとマグネシウムを含む DPBS	サーモフィッシャーサイエンティフィ	14040133
FIAU	モラベック	M251
ジェントルセル解離試薬	Stem Cell Technologies	07174
H9 ヒト胚性幹細胞	WiCell	WA09
ヒトNANOG抗体	R&Dシステム	AF1997
の人間のOCT4抗体	Abcam	AB19857
の人間の幹細胞Nucleofectorのキット1	ザ	VPH-5012
マウスIgG3アイソタイプ制御PE	のeBioscience	12-4742-41
mTeSR1媒体	の幹細胞技術	85850Nucleofector
2b装置	ロンザ	AAB-1001
pCMV-hyPBase	ウェルカムトラスト サンガー研究所	N/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK	ウェルカムトラスト サンガー研究所	N/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)	Addgene	PX462
ピュロマイシン二塩酸塩	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11138-03
QIAprep スピン maxiprep キット	Qiagen	12162
QIAprep スピン ミニプレップ キット	Qiagen	27106
組換えラミニン 521	BioLamina	LN521
トリパン ブルー溶液、0.4%	サーモフィッシャー サイエンティフィック	15250061
Y-27632(二塩酸塩)	ミリポア	SCM075