ここで提示される、音響セパレータを用いたCHO細胞培養の一次明確化のためのプロトコルである。このプロトコルは、シェイクフラスコ培養またはバイオリアクターの収穫の一次明確化に使用することができ、灌流バイオリアクター操作中の細胞ブリード材料の連続的な明確化のための潜在的な用途を有する。
この記事について
サマリー
要約
一次解明は、採取した細胞培養液内の治療製品から細胞を最初に除去するためのバイオ製造プロセスにおいて不可欠なステップである。遠心分離やろ過などの従来の方法は、細胞除去のために広く実装されていますが、これらのプロセスのための機器は、大きな足跡を持っており、操作は、汚染のリスクとフィルタの汚れを伴うことができます。さらに、従来の方法は、一次的な明確化のための連続的なバイオプロセシングスキームには理想的ではないかもしれません。このように、音響(音)波を用いた代替アプリケーションを、細胞培養液から細胞を連続的に分離することを検討した。本研究では、CHO細胞バイオリアクターの収穫からモノクローナルIgG1抗体を含む培養液を一次分離するためのベンチスケール音響波セパレータ(AWS)を用いた詳細なプロトコルです。代表的なデータは AWS から提示され、効果的な細胞の明確化と製品の回復を実現する方法を示します。最後に、継続的なバイオプロセシングにおける AWS の潜在的なアプリケーションについて説明します。全体として、この研究は、CHO細胞培養のための一次的な明確化におけるAWSの実装のための実用的かつ一般的なプロトコルを提供し、さらに連続バイオプロセシングにおけるその応用可能性について説明する。
概要
分泌された治療用タンパク質を含むバイオ製造プロセスにおける重要なステップは、採取した細胞培養液(HCCF)からのバイオマスの除去です。従来、バイオメーカーは、モノクローナル抗体1の産生における主要な明確化方法として遠心分離を採用し、その後深度ろ過を採用してきた。しかし、遠心分離は細胞に高い剪断応力をもたらし、HCCFにおける細胞の破片の増加をもたらす。これはろ過中にフィルターの汚れにつながる可能性があり、その後下流クロマトグラフィー効率1、2、3を減らすことができる余分な汚染物質ポストろ過をもたらす可能性があります。さらに、特定のプロセスの遠心分離機のカスタマイズはコストがかかり、クリーンインプレースシステムと滅菌インプレースシステムへの追加接続が必要になる可能性があり、スケーラビリティの制限要因にもなります。深度フィルタの使用は、遠心分離の限界を補償し、また、シングルユース技術4を利用することができます。しかし、深度フィルタは、高い細胞培養密度5に耐えられないため、主に二次的な明確化として使用される。あるいは、接線流ろ過(TFF)細胞保持装置は、せん断応力を軽減するために採用されているが、膜分極化や収穫量不良などの課題を経験する可能性がある6。遠心分離+深度ろ過またはTFFの使用に起因する上記の問題は、HCCFの一次明確化プロセスの改善の機会を作成します。
音響分離は、高品質のタンパク質産物7,8を用いて細胞培養物から分泌されたタンパク質を収穫する技術として導入された。音響分離は、浮遊流体および保持粒子9,10と相互作用する多次元定在波の伝播および反射を通じて達成される。これらの粒子は、流体のドラッグ、重力、音響放射の 3 つの力を経験します。各力が互いに対等になると、平衡に達し、粒子が吊り下げされ、超音波定波10内に閉じ込められる。細胞培養懸濁液において、細胞は立ち波のこの圧力ノード平面内に保持され、細胞が合体するにつれてノードが成長し、最終的には重力9から細胞ノードのこれらのクラスターが落ちる。これらの沈み込み細胞は、メディアから除去され、さらに下流処理のために浄化された培地を送り出すことができます。分離方法としての超音波の利用は、脂質粒子と赤血球11の分離から哺乳動物灌流細胞培養12に至るまでの生物学的用途に翻訳し始めている。遠心、深度ろ過、またはTFFを避けることによってコスト、労力、細胞ストレスを削減する相対的な能力を持つバイオメーカーは、音響分離を使用する潜在的な用途を模索しています。
この研究は、CHO細胞培養を明確化するためのベンチトップ音響波セパレータ(AWS)を操作するための一般的なプロトコルを提供し、代表的なデータを提示し、効果的な細胞解明と製品回収を達成する方法を実証する。
プロトコル
1. AWSの準備
注:このプロトコルは、1つのアクーストレティックチャンバーを使用して開発されました。しかし、ベンチスケールのAWSには、必要に応じて4つのアクロスフォレティックチャンバーを直列に動作させることができる5つの濁度プローブがあります。
- 濁度ケーブルをF、1、2、3、4(例えば、図1cの濁度プローブ1、図2aのポート1)に、チャンバーパワーBNCケーブルを1、2、3、4とラベル付けされたAWSシステムの背面に接続します(図2b)。
注:チャンバが流体で満たされている場合、ステップ2.6まで、チャンバ電源BNCケーブル(図3c)の他端を口和室の背面(図3d)に接続しないでください。チャンバーの電源がオンの場合、チャンバー内の流体がオンになっていると、チャンバー内のピエゾトランスデューサーが損傷し、機能しなくなります。 - 濁度プローブを濁度計と温度計ハウジングに挿入し、ネジを締めます(図1cおよび図3)。
- フィードポンプを介してフィード濁度ポート(図4a)の入力にフィードチューブを接続します(図1b~1c)。
- フィード濁度ポート(図4b)の出力からyチューブを、アクロスフォレティックチャンバーの入口ポートに接続します(図4c)。
- ステージ1チューブを、房状室の廃口(図4d)からstage1ポンプを介して細胞回収容器に接続する(図1dは1e~1f)。
- 房口室の透過ポート(図4e)からプローブ1濁度ポートの入力にチューブを接続する(図4f)。
- プローブ1濁度ポート(図4g)から収穫管を製品回収容器に接続します(図1c~1g)。
2. HCCF を使用してシステムをプライムする
注:このプロトコルは、化学定義培地(6 mM L-グルタミンを用いたActiCHO P)で培養されたCHO-K1細胞を用いて開発され、IgG1モノクローナル抗体VRC0113 を製造し、他の細胞株および製品に合わせて調整する必要がある。このプロトコルで使用されるHCCFは、揺れフラスコまたはバイオリアクタープロセスからCHO-K1培養の7〜8日間の終わりに得られました。
- AWS の背面と前面の電源スイッチをオンにして、AWS をオンにします。
- コンピュータの電源を入れ、関連するソフトウェアのデスク アイコンをダブルクリックします(「 資料一覧」を参照)。[読み取り値] パネルで [テストの開始] ボタンを押して、データの記録を開始します (図 5)。データの記録が開始されると、テストが停止されるまで、収集されたすべてのデータがエクスポート可能なスプレッドシートに記録されます。
- フィードチューブエンドを、撹拌されるHCCF容器に接続します。
- フィード ポンプのイメージ内の "コントロール" 画面にポンプ速度を入力し、キーボードのEnterキーを押して、フィード ポンプを起動します。「ポンプ方向矢印アイコン」(時計回りまたは反時計回り)が、送りポンプ画像の右側にある灰色のボックスで正しく選択され、HCCFが容器から房室にポンプで送り込まれるようにします。フィード ポンプ イメージの下にある灰色のボックスの横にある"三角形のアイコン" をクリックして、ポンプを開始します (図 6a)。
注:最大ポンプ速度は10 L /h(167 mL/min)ですが、このステップでは、公称流量60 mL/minを使用して、分離を開始する前にチャンバを過剰充填することなくチューブとチャンバーを素早く充填することをお勧めします。 - 「パーセント削減パネル」(図5c)を、アフューストレティックチャンバーの充填中に観察して、飼料濁度測定を監視します。HCCFがHCCF容器に十分に混合されている場合、濁度値はチャンバのローディング中に一貫したままになります。
- 液体がアソフォティックチャンバーの背面にあるピエゾトランスデューサーの上に入ったら、フィードポンプ画像の下の灰色のボックス内で「Off」を押してポンプを停止します。BNC電源ケーブル(図3c)をアガストレティックチャンバー(図3d)に接続します。
注:各アウストフォレティックチャンバーのホールドアップ量は約190 mLです。
3. AWSの運用
- アクトフォレティック室が充填され、BNC電源ケーブルがアクトフォティックチャンバの背面に接続されたら、フィードポンプの速度を所望の動作速度に変更します(図6a および 表1)。特定のプロセスに最適な動作パラメータを特定するために、いくつかのフィードポンプレートをテストする必要があります。
- 電源モジュールのバーを 10 W (図 6d)にスライドし、ステージ 1 ボックスの右側にある[ON をオンにする] アイコンを押して stage1 の圧電電源をオンにします (図6c)。メーカーが提案したように、CHOセルの推奨電力設定である10 Wを使用してください。これにより、動作に対して 2 MHz の固定周波数が生成されます。数秒後、細胞はアユーストレティックチャンバーの波のノードに目に見えて集まり始めます(図7a)。
- 細胞がアフェストレティック室の底に落ち着き始めたら(図7b)、細胞密度とフィードポンプ速度に基づいて適切な速度でstage1ポンプを開始する(図6b)。メーカーの最適化と定常動作スプレッドシートに基づいて、stage1ポンプ速度は、次の式を使用して、パックされたセル質量とフィード流量に基づいて計算することができます
- パックされた細胞質量を計算するには、空の15 mLチューブ(または遠心分離と互換性のある他のチューブ)でスケールを引き換えます。チューブにフィード材料を充填し、チューブの総重量をフィードで記録します。3,700 x gで 10 分間チューブを遠心分離します。上清を別の容器にデカントします。細胞ペレットでチューブの重量を測定します。充填された細胞質量の供給材料の割合=(デカンテッドチューブ重量/充填チューブ重量)x 100%。
- アフュートフォレティックチャンバーからのオーバーフローが濁度プローブ1に入り込むので、ステージ1の濁度プロファイルを監視する(図8)。
- 細胞分離が進むにつれて、細胞除去効率
が高まる。 - また、細胞分離が続くにつれて、フィードとステージ1の温度差が大きくなるのを監視します(図9)。高いセル密度フィードを使用すると温度が上昇する可能性がありますが、一般的にはフィードの流量を変更することで低減できます。
注:複数のアクトフォティックチャンバーを使用する場合、濁度プローブを介して以前のアクトフォティックチャンバーから現在のアクトフォレティックチャンバーの入力にチューブを順次接続できます。さらに、1つは、細胞収集容器にステージポンプを介して、アユーストフォティックチャンバーの底部からステージチューブを接続することができます。4つのアクトフォレティックチャンバーを直列に接続して、必要に応じて最適な細胞除去効率を実現します。
4. AWS の終了
- 実行が終わったら、フィードポンプとstage1ポンプ画像の下のグレーボックス内でそれぞれ [Off] を押して、フィードとstage1ポンプを停止し、ポンプを停止します。
- ステージ 1 ボックスの右側にある [Off] を押して、チャンバーの電源を切り、BNC 電源ケーブルを外します。
- 深度ろ過法やクロマトグラフィー法など、さらに明確化および精製手順のために収集された製品収穫材料を取ります。細胞の収穫材料を捨てます。
- 廃棄物チューブを空の容器に入れ、口当たりの多いチャンバーの入口からチューブを切り離し、ポートに浸透させ、ポンプヘッドから廃棄物チューブを放出して、アカウストレティックチャンバー内の残りの流体を排出します。
- チューブを再接続し、廃チューブをポンプヘッドに戻し、フィードポンプレート60 mL/minとstage1ポンプレート60 mL/minを使用して、フィードチューブの端からDI水を流します。15~20分続けます。フローを破棄します。
- 70%のイソプロピルアルコール(IPA)をチューブとチャンバーに送り込み、15〜20分間のフィードポンプを使用します。フローを破棄します。
- 15~20分間のフィードポンプを使用して、DI水で洗浄手順を繰り返し、チューブとチャンバーをクリアします。フローを破棄します。
- 濁度プローブとアガストフォレティックチャンバーからチューブを分解し、70%のIPAでエリアをきれいにします。
- 濁度プローブを分解し、70%のIPAで濁度プローブの内部をきれいにします。すべての部品を乾燥させてから、次の使用のために再組み立てしてください。
注意:アフューストフォレティックチャンバーは、単一の使用のために製造されていますが、このプロトコルで説明されているように適切に処理および洗浄すれば再利用することができます。
結果
プロトコルで説明されているように、AWS は、図1 に示すように、12.4 x 106セル/mL の密度で HCCF を明確にするために使用されました。フィードポンプは3.5mL/min(5L/日)に設定され、10~20 L培養に適した推定範囲内の細胞のブリード率を表します。HCCFがAWSチャンバーに入ると、フィード濁度プローブからの濁度測定は約1,000〜1,100 NTUと一貫しており、probe1濁度プローブからの測定値は40〜50 NTU前後にとどまりました(図8)。2つの測定を使用して、細胞の除去の効率
計算され、平均95%であった。40~50 NTUの濁度測定は最小濁度レベルであり、シリーズの追加のAWSチャンバーからのさらなる分離は実現不可能であることがわかりました。
AWSは低い流量で高効率で分離することができますが、HCCFをチャンバー内に長く保つことは温度上昇を引き起こし、より低い流量を選択する際に考慮する必要があります。 図9 は、アホストレティック室に入る前と、供給流量3.5mL/minでの音響分離後のHCCFの温度差の一例であり、音響室内で長時間の時間による温度の>6°Cの上昇を示した。
高い細胞密度収穫を実行する場合のもう一つの重要な考慮事項(すなわち、>20 x 106 細胞/mL)は、濁度プローブの飽和です。フィード濁度プローブの濁度測定は4,400 NTU(図10)を超えて飽和状態になり、細胞除去効率の計算において過小評価が生じる可能性があります。
細胞の明確化に対する異なる供給速度の効果を試験するために、細胞除去効率を異なる供給率で測定した。 図11に示すように、送出ポンプ速度が上昇するにつれて、細胞除去効率は~100%から57%に大幅に低下した。一般に、フィードポンプ速度が遅いほど、細胞の明確化が良くなります。ただし、各アプリケーションに対してフィードレートの最適化をお勧めします。
図 1: AWS のセットアップソフトウェア (a) でポンプをオンにすると、HCCF はフィードポンプ (b) を介してフィード濁度プローブ (c) を介して AWS チャンバー (d) に送り込まれました。室内では、音響力が波のノードの流れから細胞を閉じ込め、束を引き起こしました。浮力の低下により細胞は重力を通して細胞が落ち込み、細胞はステージ1ポンプ(e)を介して細胞収穫ボトル(f)に細胞収穫瓶を介して口内室の廃棄物港から取り除かれ、明確化された材料は、チャンバーの透過ポート(c)から製品収穫ボトル(g)にプローブ1濁度プローブ(c)に出て行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: AWS システムの背面濁度プローブとチャンバーは、濁度プローブイーサネット(a)とチャンバーパワーBNC(b)ケーブルを介して、AWSシステムの背面にあるそれぞれのポートに接続されています。また、コンピュータはPCイーサネットケーブル(c)を介して接続されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:濁度プローブとハウジング。各濁度プローブ(a)は、それぞれの濁度計と温度計ハウジング(b)に適切に挿入し、ネジで締める必要があります。チャンバー電源BNCケーブル(c)は、チャンバー内のピエゾトランスデューサが流体で満たされた後にのみ、アクトフォレティックチャンバー(d)の背面に接続する必要があります。プローブは、F = フィード濁度、1 = probe1濁度、および 2、3、および 4 は未使用のプローブ (または手順をシリアル化するために使用できます) として示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:濁りハウジングとアフューストフォレティックチャンバーとの接続。フィードチューブは、フィードポンプを介してフィード濁度ポート(a)の入力に接続されます。フィード濁度ポート(b)の出力は、yチューブを介してアクロスフォレティックチャンバ(c)の入口ポートに接続されています。stage1チューブは、房球性室の廃港(d)からstage1ポンプを介して細胞回収容器に接続される。アフューストレティック室の透過ポート(e)は、プローブ1濁度ポート(f)の入力に接続されている。収穫管は、プローブ1濁度ポート(g)から製品回収容器に接続されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 音響セパレータソフトウェアの読み取りパネルプログラムには、"読み取り" と "コントロール" の 2 つのパネルがあります。「読み取り」パネル内では、濁度(a)、温度(b)、およびパーセント低減率(c)が監視されます。データの記録を開始するには、[テストの開始] ボタン (d) をクリックする必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: プログラムのコントロール パネル[コントロール] パネルでは、ポンプのオンとオフを切り替えることができ、送り込み (a) などのステージ (b) に対してポンプの速度を変更できます。また、ピエゾトランスデューサのチャンバー電源をオンまたはオフ(c)にして、スライドバー(d)で変更することができます。実験は、メーカーが推奨するCHOセルの推奨電力設定であるため、10 Wを使用しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: AWS チャンバー細胞がチャンバーの中に入ると、音響力が波のノードに細胞を閉じ込め、細胞がクラスター化する(a)。これらの細胞クラスターは、浮力を失い、最終的に重力(b)によって落ち着くまでサイズが大きくなった。次に、細胞収穫ボトル(c)にstage1ポンプを介して、アユーストレティックチャンバの廃港から落ち着いた細胞を除去した。製品は透過ポート(d)を介してチャンバーを出て、HCCFは継続的に入口ポート(e)を介してチャンバーを充填した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:フィードポンプ速度3.5mL/minの12 x 106 細胞/mL CHO細胞培養の濁度測定。飼料濁度(青)は約1,000NTUで、ステージ1濁度計(オレンジ)を出る透過物は40~60NTUであった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:フィードポンプ速度3.5mL/分の12 x 106 セル/mL CHO細胞培養の温度測定。供給温度(青)は約21°Cで、ステージ1濁度計(オレンジ)を出る透過物は約27°C であった。
図10:高い細胞密度サンプルの濁度測定例。細胞密度が>20 x 106 細胞/mLであった場合、供給濁度測定は4,400 NTUの最大値で飽和し、細胞除去効率の過小評価をもたらした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:細胞除去効率比較。供給速度が増加するにつれて、細胞分離が減少した。したがって、供給速度が増加するにつれて、細胞の明確化効率が低下した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 仕様 |
| 流量 | 0 – 10 L/h |
| 圧力範囲 | 0 – 2バー (0 – 30 psi) |
| 供給液温度 | 0 – 40 °C (32 – 104 °F) |
| 動作温度 | 0 – 40 °C (32 – 104 °F) |
表1:動作条件 流量、圧力範囲、供給液、および動作温度に関する AWS メーカーの推奨動作条件。
ディスカッション
記述は、CHO細胞株のHCCFからのモデルモノクローナル抗体の一次解明におけるベンチスケールAWSの実装のためのステップバイステップのプロトコルである。代表的な結果に示すように、AWSを一次の明確化に使用すると、効果的な細胞の明確化と製品の回復が得られました。さらに、低レベルのメンテナンスと運用要件とスケールアップ機能により、一次的な明確化において、より広範なアプリケーションの可能性を実現できます。
重要なことに、代表的な結果は、フィードポンプ速度が細胞の分離にとって重要であることを示唆している。また、濁度測定で高い細胞密度を検出する際の制限により、AWS システムを使用する場合に考慮すべきもう 1 つの要因として、動作するセル密度が考慮されます。高い細胞密度供給材料を走る場合には濁度プローブが飽和してしまうため、原料の細胞密度をオフラインで測定し、細胞培養液を明確にすることで細胞分離効率を計算するのが最適な場合があります。明確化の正確なオフライン測定では、これらの問題を解決する上で考慮することができる1つのプロセス戦略は、シリーズで複数のチャンバーを使用することです。このプロトコルは主に単一のチャンバを使用することに焦点を当てていますが、このシステムは細胞の状態に最小限の影響を与え、高い製品回収をもたらす細胞の逐次的な明確化のための3つの追加のチャンバーを操作することができます。さらに、AWS の電力やセルの削除フローレートなどの他のパラメータは、特定のセルタイプや動作モードに合わせてさらに最適化できます。全体として、AWS の実装前に、これらの考慮事項を使用したオペレーションパラメータと戦略の最適化をお勧めします。
多くのアプリケーションの可能性の中で、継続的なバイオプロセシングにおけるAWSの使用は有望です。AWS は遠心分離を置き換え、フィルター表面積14を大幅に削減できるため、AWS を使用すると、連続的なバイオマニュファクチャリングと互換性のある後続のろ過およびクロマトグラフィープロセスに対して、無細胞材料の一定のフローが可能になります。この互換性と高い細胞密度(例えば、>50 x 106 細胞/mL)および培養期間の長さ(例えば、>14日)のための灌流技術の利用可能性により、AWSは一次明確化に加えて、新しい連続細胞出血戦略を開発する可能性を秘めています。
いくつかの場合において、産生されるタンパク質治療の最大30%が細胞出血物質15,16における定常操作中に除去される。さらに、除去されたモノクローナル抗体を標準の収穫材料と共にプールするためには、一定の品質属性が満たされなければならない。これらの仕様が満たされない場合、結果は製品の歩留まりに影響を与える可能性のある材料の拒否である可能性があります。このような製品損失を補うために、長期灌流プロセス17の間に、AWSを使用した細胞ブリード材料の継続的な明確化を定常状態で実装することができます。この戦略は、ブリード材料の製品損失を低減し、生産されるタンパク質の多くを利用することができます.さらに、AWS を使用した連続的な明確化後の細胞は、より高い細胞密度と生産性のために必要に応じてバイオリアクターに戻される可能性があります。したがって、AWS でセルブリード材料を連続的に明確化すると、所定のプロセスで歩留まりを増やしたり、二次フィルタの表面領域を減少させたりする機会が得られる可能性があります。
要約すると、AWS のユーティリティは、単純な一次的な明確化に限定されるものではなく、製造速度と運用の柔軟性を向上させる可能性のある連続的なバイオプロセシングのアプリケーションに対するユーティリティを備える場合があります。
開示事項
著者らは、この原稿に記載されている製品に金銭的な利益を持っていないし、開示する他に何もありません.
謝辞
著者らは、この原稿の建設的なレビューのためにニロウ・サラ・アーデンと中趙を認めたいと思います。著者はまた、このプロジェクト中に不可欠なインプットのためにリンジー・ブラウンに感謝したいと思います。この作業に対する部分的な内部資金と支援は、CDERクリティカルパスプログラム(CA #1-13)とCDER製造科学イノベーションセンター・オブ・エクセレンス・プログラム(Berilla-CoE-19-49)によって提供されました。このプロジェクトは、米国エネルギー省とFDAの間の機関間協定を通じてオークリッジ科学教育研究所が運営する米国食品医薬品局バイオテクノロジー製品局のインターンシップ/研究参加プログラムによって部分的に支援されました。
この出版物は著者の見解を反映しており、FDAの見解や政策を表すものと解釈されるべきではない。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Acoustophorectic | chamber Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
| CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
| コンピュータ | Dell | Latitude 3470 | Windows 7、64ビットOS |
| イソプロパノール(70%) | LabChem | LC157605 | 20L準備70%IPA |
| L-グルタミン | コーニング | 25-005-CV | 200 mMストックソリューション |
| Masterflex L / S 14チューブ | コールパー | マー96400-14 | 過酸化物硬化シリコーンチューブ、25フィート |
| マスターフレックスL / S 16チューブコール | パーマー | 96400-16 | 過酸化物硬化シリコーンチューブ、25フィート |
| チューブセット | ポール | CAS-FP-K1チューブセット | |
| 濁度プローブ | ポール | CAS-TS-S1(60500106) |
参考文献
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