磁気温熱療法とポト温熱併用がん治療のための磁気、音響、光三重応答性マイクロバブル

サマリー

ここでは、自己集合体を介した酸化鉄ナノ粒子殻状マイクロバブル(NSM)の製造プロトコルであり、磁気高熱および光熱併用がん治療のための1つのナノ治療プラットフォームにおける磁気、音響、および光応答性を相乗化する。

要約

標的と深く浸透した送達を目指す抗がん剤の精密送達と、腫瘍部位での制御放出が課題となっている。ここでは、自己集合、磁気、音響、光学応答性を1つのナノ治療プラットフォームで相乗化することにより、酸化鉄ナノ粒子殻付きマイクロバブル(NSM)を製造します。酸化鉄ナノ粒子は、磁気と光熱の両方の薬剤として機能します。静脈内注射後、NSMは、腫瘍部位に磁気的に誘導することができる。超音波は酸化鉄ナノ粒子の放出を引き起こし、マイクロバブルのキャビテーション効果のためにナノ粒子の深部腫瘍への浸透を促進する。その後、結合癌治療のために腫瘍に対して磁気温熱療法および光熱療法を行うことができるが、腫瘍不均一性による癌耐性の解決策である。このプロトコルでは、構造、化学的、磁気および音響特性を含むNSMの合成および特性評価が行われた。また、熱療法による抗癌効果について、インビトロ細胞培養を用いて検討した。提案された送達戦略と併用療法は、出産と抗癌の両方の有効性を改善するために癌治療において大きな約束を保持する。

概要

がんは最も致命的な病気の1つであり、世界中で毎年何百万人もの死者を出し、経済的損失が大きい¹.診療所では、外科的切除、放射線療法、および化学療法などの従来の抗癌療法は、依然として満足のいく治療効果²を提供できない。これらの療法の制限は、高毒性の副作用、高い再発率および高転移率³である。例えば、化学療法は、腫瘍部位⁴に正確に化学療法の低い送達効率に苦しんでいる。細胞外マトリックスや高腫瘍間質液圧を含む生物学的障壁を越えて腫瘍組織に深く浸透する薬物の不全は、治療効果の低さ⁵にも関与する。また、腫瘍抵抗は通常、単一の化学療法⁶によって治療を受けた患者で起こる。そこで、光熱療法(PTT)や磁気高熱療法(MHT)などの腫瘍の熱アブレーションが起こる技術は、腫瘍抵抗性を低減する有望な結果を示しており^{、臨床試験7、8、9}で出現している。

PTTは、レーザーエネルギーの照射下での光熱変換剤の作用により、癌細胞の熱アブレーションを引き起こす。生成された高温(50°C以上)は、完全な細胞壊死を誘発する^10。ごく最近、鉄酸化物ナノ粒子(IONP)は、近赤外(NIR)光¹¹によって活性化することができる光熱変換剤であることが実証された。 近赤外域におけるモル吸収係数が低いにもかかわらず、IONPは低温(43°C)光熱療法の候補であり、正常組織への熱暴露による損傷を軽減し、腫瘍転移¹²に対する抗腫瘍免疫を開始する修飾療法である。PTT の制限の 1 つは、レーザーの低い貫通深さです。深い座った腫瘍については、酸化鉄ナノ粒子の交流磁場(AFM)誘導加熱(磁気高熱と呼ばれる)は、PTT^13,14の代替療法である。MHTの主な利点は、磁場¹⁵の高い浸透です。しかし、IONPの比較的高濃度が必要なのは、その臨床応用にとって大きな欠点である。動物における固形腫瘍へのナノメディシン(またはナノ粒子)の送達効率は、循環、蓄積、および浸透^16、17を含む一連の障害のために^1〜10%であった。したがって、高い組織浸透を達成する能力を持つ制御され、標的を絞ったIONPsデリバリー戦略は、がん治療に大きな関心を持っています。

超音波媒介ナノ粒子送達は、マイクロバブルキャビテーション^18、19と呼ばれる現象のために、腫瘍組織に深部にナノ粒子の浸透を促進する能力^を示している。本研究では、自己集合、磁気、音響、光学応答性を1つのナノ治療プラットフォームで相乗的に行い、IONPsシェルマイクロバブル(NSM)を製造する。NSMには、空気コアと酸化鉄ナノ粒子のシェルが含まれ、直径は約5.4μmです。NSMは、腫瘍部位に磁気的に誘導することができる。その後、IONPの放出は、マイクロバブルキャビテーションとマイクロストリーミングを伴う超音波によって引き起こされます。マイクロストリーミングから受けた運動量は、腫瘍組織へのIONPの浸透を促進する。PTTおよびMHTはNIRレーザー照射かAFMの適用によって、または両方の組合せによって達成することができる。

プロトコル

すべての動物実験は、動物のケアと実験動物の使用のためのOG製薬ガイドラインによって承認されたプロトコルに従って行われました。プロトコルは、OG製薬の実験動物のための倫理委員会のガイドラインに従いました。

ナノ粒子シェルドマイクロバブル(NSM)合成

1. 脱イオン水に磁性ナノ粒子(Fe3O4、酸化鉄)を分散し、10mg/mLストック溶液を形成する。
2. IONPs溶液を含むチューブを超音波洗浄機に20分間置きます。使用前に均一に分散したIONPsソリューションを入手してください。
3. 150 μLの脱イオン水、10 mMのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)150 μL、ステップ1.1からイオンプスのストック溶液400 μLを加えます。1.5 mL遠心分離管で。
4. ホモジナイザーを氷浴で足場で固定します。
5. 混合物のチューブを氷浴に入れ、ホモジナイザープローブを正確に配置して混合物溶液に浸す。
6. ホモジナイザーの速度を20,000 rpmに調整し、ホモジナイザーを3分間オンにします。
7. ホモジナイザーをオフにし、氷浴からチューブを取り外します。
8. チューブをチューブラックに置き、室温で12時間安定させます。
9. 結果のNSMを磁石でチューブ壁に吸着し、上清を取り除きます。その後、1mLの新鮮な脱イオン水を補給します。
10. 洗浄プロセスを3回繰り返し、1mLの新鮮な蒸留水でNSMを再中断します。
11. わずかに揺れた後、10 μLのNSMサスペンションをクリーンガラススライドに移します。
12. 20倍の倍率で蛍光顕微鏡を使用して、NSMの形態を可視化します。ランダムな領域で写真を撮ることを確認します。
13. オープンアクセスナノ測定器1.2ソフトウェアを使用して、写真からNSMの直径を測定します。少なくとも200個のマイクロバブルを数えます。
    1. [ファイル] と [開く] をクリックして、処理するイメージ ファイルを選択します。イメージがインポートされたら、"定規" を押します。定規と同じ長さの赤い線を描きます。
    2. 次に"設定"を押|「ルーラー」をクリックし、ルーラーの長さを入力します。イメージ内の個々のマイクロバブルの直径と同じ長さの線を描きます。すべての測定を完了し、「レポート」をクリックして| レポートを表示".

2. NSMの音響応答

1. 800 μL脱イオン水で200 μLのNSMを希釈し、1.5 mL遠心管に移してストック液を形成します。
2. ファンクションジェネレータ、アンプ、インピーダンスマッチング、自家製のフォーカス変換器を接続します。トランスデューサを人工立方体シンクの底部の中央に置き、ハイドロフォンをオシロスコープに接続して出力超音波強度を監視します(図1)。脱イオン水をシンクに加え、トランスデューサを浸します。
3. 関数発生器をスイープモードに調整し、周波数範囲を10 kHzから900 kHzに調整し、振幅を20 Vpp(電圧ピークピーク)に設定します。アンプで0.1%に超音波のパワーを調整します。各サイクルの期間は 4 秒で、時間間隔は 1 秒です。
4. チューブに1 mL NSMストック溶液サンプルを準備し、自家製の焦点を合わせたトランスデューサーの上に足場でチューブを固定します。マグネットをチューブの底に取り付け、NSMを引き付けます。
5. ファンクション・ジェネレータとアンプの電源を入れます。超音波の5サイクル(25 s)の適用後に機能発生器をオフにします。磁石を取り外し、リリースされたIONPsを含む溶液の1mLを回収します。遠心管に1mLの脱イオン水を加えます。
6. ステップ 2.5 を繰り返します。チューブ内のNSMが完全に崩壊するまで。
7. 前述の¹³のように、誘導結合プラズマ光発光分析(ICP-OES)によって放出されたすべてのIONPを定量化する。

3. NSMの光応答

注:本研究では、808nmレーザーパワーと、Xuらによって以前に説明された赤外線熱画像カメラを含むレーザーシステムが²⁰を利用される。

1. レーザーシステムの準備
   1. レーザーの電源をオンにし、数分間温めます。レトルトスタンドにファイバ結合808 nmレーザーダイオードを固定します。
   2. レーザー光を光ファイバーを通してサンプルステージに向け、サンプルステージに焦点を当て、凸レンズで6mmの光スポット(直径)を達成します。
   3. レーザーパワーメーターで出力出力を測定し、1 W/cm²に電力を調整します。
   4. 三脚の赤外線熱画像カメラを固定します。カメラの電源を入れ、動作しているかどうかを確認します(例えば、関心のある領域(ROI)温度を監視します)。電源と赤外線熱画像カメラをオフにします。
2. 水溶液中の光熱測定
   1. 1 mL サンプルを IONPs 濃度(1.05 mg/mL、1.35 mg/mL、3.65 mg/mL、5 mg/mL)で1.5 mL遠心分離チューブに調製します。
   2. 目的のチューブをレーザー光の焦点領域に配置し、サンプルのベースライン温度を記録します。
   3. レーザーパワーと赤外線熱画像カメラをオンにし、サンプルを10分間連続して照射します。同時に、リアルタイムで温度を記録します。
   4. 照射の10分後にレーザー電源と赤外線熱画像カメラをオフにします。リージョンの温度がベースラインに戻るのを待ちます。
   5. 他のサンプルの測定のために 3.2.2 から 3.2.4 を繰り返します。
      メモ:光熱測定の制御として、20°Cの脱イオン水を使用してください。
3. 培養細胞における光熱測定
   注:マウス乳癌細胞(4T1)を光熱処理による阻害効果を調査するモデルとして選択した。
   1. ロズウェルパークメモリアルインスティテュート-1640(RPMI-1640)培地で細胞を供給し、10%胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリンを添加します。培養環境を37°C、5%CO2に設定します。
   2. 培養4T1細胞はT25フラスコで、90%合流に達すると細胞を1:2の割合で通過させる。
      注: サブカルチャー比は、異なるラボの特定の細胞条件に応じて調整できます。
   3. 培養液を取り出し、廃棄します。細胞層を1xPBS溶液でリンスし、トリプシン阻害剤を含む残存血清を除去する。
   4. 剥離のためにフラスコにトリプシン-EDTA溶液(0.25%)の2 mLを加えます。その後、1640培地の3mLを加え、穏やかにピペットで細胞を吸引します。
   5. 5mLの細胞懸濁液と遠心分離機を 500xg で3分間回収します。
   6. 上清を取り除き、1mLの新鮮な1640培地を加え、細胞懸濁液を形成する。
   7. 1mLの培養培地を含む共焦点皿に細胞懸濁液100μLを加える。細胞懸濁液の濃度が9 x 10⁵/mLであり、細胞培養コンフォーカルディッシュの最終的な細胞濃度が8.1 x 10⁴/mLであることを確認してください。
   8. 接種細胞培養コンフォーカル皿をインキュベーターに24時間置きます。
   9. IONPsサンプルの異なる濃度(1.05mg/mL、1.35 mg/mL、3.65 mg/mL、5 mg/mL)を希釈し、1 mL溶液を無血清1640培地で作ります。
   10. コンフォーカル皿から培養液を吸引し、調製したサンプル溶液を添加する。
   11. レーザー電源をオンにします。皿の中央にレーザー光を集中させ、出力電力を1 W/cm²に調整します。赤外線熱画像カメラをオンにし、コンフォーカルディッシュ内の細胞を連続して10分間照射します。焦点を合わせる領域の温度をリアルタイムで記録します。
   12. レーザーカメラと赤外線熱画像カメラをオフにします。照射した皿をインキュベーターにさらに24時間移します。
   13. 培養液を取り出して捨て、共焦点皿に1mLの新鮮な培養培地を加える。カルセイン-AM溶液(1 mg/mL)を5μL加えます。
   14. 共焦点皿を37°C、5%CO2で15分間インキュベートします。細胞層を1倍のPBS溶液で2回リンスする。
   15. 励起波長488nm、発光波長500~540nmの共焦点蛍光顕微鏡で細胞を観察・画像化します。
   16. 共焦点画像の5つの領域をランダムに選択し、各領域の4T1細胞の数を手動でカウントします。すべての実験群の生細胞数を対照群と比較することにより、4T1細胞の生存率を定量化する。
       注:20 °Cの無血清1640培地を光熱測定の制御として使用してください。細胞生存率制御群としてレーザー照射を行わずに試料を使用する。
4. 生体内での光熱測定
   1. 平均体重25±2gの8週齢のICR雄マウスの3匹を準備する。
   2. 20mLの脱イオン水にゼラチン粉末2gを加えます。溶液を40~50°Cに加熱し、ゼラチンゲルを完全に溶解し、透明で透明な溶液を形成する。
   3. 3.4.2から溶液に100mgのIONPを追加します。
   4. ゲルを40~50°Cに加熱し、すぐに500μLのゼラチン溶液をマウスの右乳房パッドに注入します。
   5. レーザーパワーをオンにし、対象領域(マウスの右胸パッド)にレーザー光線を集中させる。出力電力を1 W/cm^{2に調整します。} 赤外線熱画像カメラをオンにし、10分間連続して関心領域を照射します。関心領域の温度をリアルタイムで記録します。
   6. レーザーカメラと赤外線熱画像カメラをオフにします。
   7. CO2窒息および頸椎脱臼または研究所の動物研究委員会によって承認された任意の方法によってマウスを安楽死させる。

4. 磁気温熱測定

注:ここでは、Wuらによって以前に記述された磁気温熱システムが利用されている^{(21) .}

1. 磁気高熱システムの準備には、交流磁場(AFM)発電機と赤外線熱画像カメラが含まれます。
   1. 10分間チラーをオンにし、適度な無線周波数加熱機(AFM発電機)の電源を入れます。
   2. 周波数(f)=415 kHz、磁場強度=1.8kA/mのパラメータを設定します。
2. 水溶液中の磁気高熱測定
   1. 1.5 mL遠心分離管に異なるIONP濃度(1.05mg/mL、1.35 mg/mL、3.65 mg/mL、5 mg/mL)でサンプル1 mLを調製します。
   2. チューブを水冷磁気誘導銅コイルの中央に配置します。
   3. 交流磁場(AFM)と赤外線熱画像カメラをオンにします。サンプルを連続して10分間誘導し、リアルタイムで温度を記録します。
      注: カメラはサンプルの上部にあり、サンプルの断面図を提供します。
   4. AFM と赤外線熱画像カメラをオフにします。銅コイルの温度がベースラインに戻ってくるのを10分間待ちます。
      注:高温に注意し、手との直接接触を避け、サンプルを取り外す前に冷却を待ちます。
   5. 他のサンプルの測定のために 4.2.2 から 4.2.4 を繰り返します。
   6. 適度な無線周波数加熱機(AFM)と冷却機の電源を切ります。
      注:磁気温熱測定の制御として、20°Cの脱イオン水を使用してください。
3. 生体内での磁気温熱測定
   1. 平均体重25±2gの8週齢のICR雄マウスの3匹を準備する。
   2. 5 mg/mL IONPs溶液を含む10%ゼラチンゲル20 mLを調製します。
   3. ゼラチンゲルを40~50°Cに加熱し、すぐに500μLのゼラチン溶液を動物の右乳房パッドに注入します。
      注:磁気誘発過熱実験は、インビトロ試験と同じパラメータを使用して加熱機で行われました。
   4. 交流磁場(AFM)と赤外線熱画像カメラをオンにします。マウスの右胸パッドを水冷磁気誘導銅コイルの中央に置きます。
   5. 赤外線熱画像カメラをオンにし、目的領域(マウスの右胸パッド)を10分間連続的に画像化し、対象領域の温度をリアルタイムで記録する。
   6. 誘導の10分後に、マシンと赤外線熱画像カメラの電源スイッチをオフにします。銅コイルの温度がベースラインに10分間戻るのを待ちます。
   7. 他のサンプルの測定のために 4.3.4 から 4.3.6 まで繰り返します。
   8. 適度な無線周波数加熱機(AFM)と冷却機の電源を切ります。
      注:高温に注意し、手との直接接触を避け、サンプルを取り外す前に冷却を待ちます。
   9. CO2窒息および頸椎脱臼または研究所の動物研究委員会によって承認された任意の方法によってマウスを安楽死させる。

結果

本研究で用いた三重応答性ナノ粒子殻状マイクロバブル(NSM)は、界面活性剤とIONPの混合物を攪拌することによって調製された。IONPs(50 nm)は液体および気体の中心のインターフェイスで自己組み立てられ、密に詰まった磁気シェルを形成する。NSMの形態を 図1Aに示します。結果として得られたNSMは球形を示し、平均直径は5.41±1.78 μm(図1B)を示した。結果は、NSMが正常に準備されたことを示しました。水中に貯蔵した場合、マイクロバブルは1年以上もそのまま残り、緩衝液および細胞培養培地において少なくとも10日間¹⁹日安定であった。 図1Dに示すように、Feの段階的な放出は、適用された超音波のサイクル数を増加させることで達成された。10サイクル後、Feの約20%が放出された。50回の超音波サイクルまで、放出されたFeの量は約80%に高原に達した。これらの結果は、外部超音波トリガーによるIONPのオンデマンドリリースを示唆した。

ディスカッション

ここでは、自己集合による酸化鉄ナノ粒子殻付きマイクロバブル(NSM)を、1つのナノ治療プラットフォームで相乗的な磁気、音響、および光学応答性を持つプロトコルを発表した。IONPは空気コアの周りに密に詰め込んで磁気シェルを形成し、ターゲティングのための外部磁場によって制御することができます。一度配信されると、IONPのリリースは、超音波トリガーによって達成することができます。リリースされた IONP は、PTT および MHT の NIR ライトと AFM の両方、またはその両方の組み合わせによってアクティブ化できます。

プロトコル全体の間で、NSM の合成ステップはプロトコル全体の基礎となる重要な役割を果たします。同時に、インビトロでのIONPの制御リリースは、NSMの音響応答を検証しました。水溶液中の光熱測定と水溶液中の磁気温熱測定のプロトコルは、NSMの磁気応答と光学応答もそれぞれ検証しました。

NSMを正常に準備するためには、IONPの溶液は、水中のIONPの均一な分散を確実にするために使用する前に20分間超音波処理する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
808 nm レーザー出力	長春新産業 オプトエレクトロニクス技術	MDL-F-808-5W-18017023
カルセイン-AM	サーモフィッシャー 科学	C3099
ウシ胎児血清	Invitrogen	16000-044
蛍光顕微鏡	オリンパス	IX71
関数発生器	キーサイト	33500B シリーズ	20 MHz、任意波形生成機能付き2チャンネル
ゼラチンゲル	Sigma	9000-70-8
加熱機	Shuangping	SPG-06- II
自家製集束トランスデューサ			周波数=855、R-X=36.2W+5.8W、|Z|-θ=37W+8°
ホモジナイザー	SCILOGEX	D-160	8000-30000 rpm
ハイドロフォン	T&C	NH1000
ICR 雄マウス	OG Pharmaceutical. Co. Ltd		8 週齢
誘導結合プラズマ発光分析	PerkinElmer
赤外線熱画像カメラ.	FLIR	E50
酸化鉄(II,III)	Alfa Aesar	1317-61-9	50-100nm APS 粉末
レーザーパワーメーター	長春新産業 オプトエレクトロニクス技術
オシロスコープ	Keysight	DSOX3054T	帯域幅 500 MHz、サンプリングレート 5 GS/S、4 チャンネル
RF パワーアンプ	T&C	AG1020	信号源は、外部信号源に接続することもできます。ゲインは0〜100%の範囲で調整できます。周波数スイープ、パルス、トライアングルなどの複数の機能があります。
ロズウェルパーク記念研究所-1640	KeyGEN BioTECH	KGM31800
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma	151-21-3