ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

サマリー

LEDで垂直に照射されたセットアップを用いて、難しい物質(着色物質やナノ材料など)に対する藻類毒性試験を実証しています。

要約

エコ毒性データは、欧州および国際規制(REACHなど)による化学物質の市場前および市場後の登録の要件です。藻類毒性試験は、化学物質の規制リスク評価に頻繁に使用されます。高い信頼性と再現性を実現するためには、標準化されたガイドラインの開発が不可欠です。藻類毒性試験では、ガイドラインには、pH、温度、二酸化炭素レベル、光強度などのパラメータの安定した均一な条件が必要です。ナノ材料やその他のいわゆる難しい物質は、光を妨げ、その規制の受け入れを妨げる結果の大きな変動を引き起こす可能性があります。これらの課題に対処するために、我々は、LEVITATT(藻類毒性試験用LED垂直照明テーブル)を開発しました。このセットアップでは、下からのLED照明を利用して、均質な光の分布と温度制御を可能にする一方で、サンプル内シェーディングを最小限に抑えます。このセットアップは、バイオマス定量のためにサンプル量を最適化し、同時に藻類の指数成長をサポートするために十分な_CO2流入を保証します。さらに、テスト容器の材料は吸着および揮発を最小にするように合わせることができる。着色物質や粒子懸濁液をテストする場合、LEDライトの使用はまた、追加の発熱なしに光強度を増加させることができます。コンパクトデザインと最小限の設備要件により、幅広い研究所でのLEVITATTの実装の可能性が高まります。また、藻類毒性試験の標準化されたISOおよびOECDガイドラインに準拠する一方で、LEVITATTは、エルレンマイヤーフラスコおよびマイクロタイタープレートと比較して、2つの基準物質(3,5-ジホロロフェノールおよび_{K2 Cr2O7)}および3ナノ材料(ZnO、CeO_2、およびBaSO₄₎に対して、より低いサンプル間変動性を示した。₂

概要

藻類毒性試験は、欧州および国際的な規制(REACH¹およびTSCA(米国)による化学物質の市場前および後の登録に必要な生態毒性データを生成するために使用される3つの必須試験のうちの1つです。このため、標準化された藻類試験ガイドラインは、国際機関(ISOおよびOECDなど)によって開発されています。これらの試験基準とガイドラインは、pH、温度、二酸化炭素レベルおよび光強度の点で理想的な試験条件を規定する。しかし、藻類試験中の安定した試験条件の維持は、実際には困難であり、その結果、化学物質やナノ材料(しばしば「難しい物質^」と呼ばれる)の範囲に対する再現性と信頼性に関する問題に苦しむ2。既存の藻類毒性試験の設定のほとんどは、インキュベーター内の軌道シェーカー上に位置する比較的大量(100〜250 mL)で動作します。このようなセットアップは、テスト濃度の数を制限し、達成可能な、藻類培養物および試験材料の大量を複製します。さらに、これらの設定は、均一な光場を持つことはほとんどなく、信頼性の高い照明条件は、光強度が指数関数的に減少し、一部は、フラスコの形状に起因する一部として、大きなフラスコで得ることはさらに困難です。代替設定は、pH、追加のバイオマス測定、顔料抽出または破壊的なサンプリングを必要とする他の分析を測定するのに十分なサンプリング量を許容しない小さなサンプル量を含むプラスチックマイクロチター³プレートを含む。着色懸濁液を形成するナノ材料および物質の藻類毒性試験のための既存の設定を用いた特定の課題の1つは、藻類細胞に利用可能な光の干渉または遮断であり、しばしば「シェーディング^」4,5,5と呼ばれる。シェーディングは、試験材料および/または試験材料と藻体細胞との間の相互作用によってバイアル内で発生する可能性があり、または互いに対する位置と光源のためにバイアル間でシェーディングが発生する可能性があります。

この方法は、OECD 201^7、およびISO^{8692 8}などの規格に準拠した試験を可能にする、アレンスバーグら6によって導入された小規模藻類毒性試験セットアップに基づいている。この方法は、上記の制限に対処するためにさらに最適化されています: 1)LED光技術を利用して最小限の発熱で均一な光条件を確保し、2)一定のpH、CO2レベル、および3)揮発性₂物質の試験や高い被光電位を有する汎用性の高い試験容器材料の使用を可能にしながら、化学的/生物学的分析のための十分なサンプル量を提供する。

プロトコル

1. LEVITATT 設定の説明

1. 20 mLシンチレーションガラスバイアル(図1、挿入1)を使用して光の浸透を可能にします。あるいは、光貫通性プラスチックバイアルを使用することができます。光量計を使用して光強度を定量化します。
2. 試験の開始時に少なくとも4 mLの試験懸濁液を使用して、バイオマスの定量化とインキュベーション中およびインキュベーション後のナノ材料の特性評価/定量化を可能にします(図1、挿入2)。
3. 20 mLのシンチレーションバイアルにキャップ(図1、インサート3)を合わせ、小さな穴を開けて(直径約1mm)、大気との_CO2 交換を可能にします。この交換は、テスト中に安定したpHと_CO2 レベルを確保するために重要です。
4. 揮発性物質の場合、気密性テフロンコートキャップを使用して、濃縮重炭酸ナトリウム(NaHCO3)緩衝システム¹⁰によって_CO2が溶液中に維持される気相を有さないシリンジ₃⁹または完全閉フラスコを使用してヘッドスペースの_CO2濃縮を可能にする。
5. 外装に取り付けられたクランプでバイアルを固定します(図1、挿入4)。
6. テストバイアルの下にあるLED光源(図1、挿入5)は、「クールホワイト」または「昼光」タイプの均一な蛍光照明と光強度を400nm〜700 nmの光合成有効波長範囲で測定した60〜120 μE∙m-2∙s-1の範囲で提供します。^-2-1このセットアップでは、光源に光調光器を取り付^け、5~160 μE∙m^-2の範囲で調整可能な光強度を採用します。これにより、高い光強度と低い光強度でのテストが可能になります。
7. 試験の間、サンプルを攪拌するために軌道シェーカーにセットアップを取り付けます。これにより、細胞を自由な懸濁液に保ち、空気から水への_CO2 物質移動を容易にします(図1、6を挿入)。
8. 温度制御された部屋またはサーモスタットキャビネットにセットアップを置き、テストを通して安定した温度を維持します(図1、挿入7)。

図1:藻類毒性試験用LED垂直照明表(LEVITATT)の画像1)インキュベーション用20 mLガラスシンチレーションバイアル、2)4 mLサンプルを分析し、3)CO2交換用の₂穴を開けた蓋、4)規定された光条件のケース、5)ケーシングの中央に位置するLED光源、6)実験中の攪拌のための軌道シェーカー、および7)サーモスタットキャビネット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 藻類増殖培地の調製

1. ISO 8692藻類の成長媒体は4つの異なったストックの解決で成っている。 表1に従って、塩の適切な量を計量し、超純水で希釈する。

ストックソリューション	栄養	ストック溶液中の濃度	試験溶液中の濃度
1:マクロ栄養素	NH4Cl	1.5 g/L	15 mg/L (N: 3.9 mg/L)
	MgCl2∙6H2O	1.2 g/L	12 mg/L (Mg: 2.9 mg/L)
	CaCl2∙2H2O	1.8 g/L	18 mg/L (Ca: 4.9 mg/L)
	MgSO4∙7H2O	1.5 g/L	15 mg/L (S: 1.95 mg/L)
	KH2PO4	0.16 g/L	1.6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: フェ・エドタ	3∙6H2O3	64 mg/L	64 μg/L (Fe: 13 μg/L)
	ナ2EDTA∙2H2O	100 mg/L	100 μg/L
3: 要素をトレースする	H3BO3a	185 mg/L	185 μg/L (B: 32 μg/L)
	MnCl2∙4H2O	415 mg/L	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ZnCl2	3 mg/L	3 μg/L(Zn:1.4 μg/L)
	コクル2∙6H2O	1.5 mg/L	1.5 μg/L(Co:0.37 μg/L)
	CuCl2∙2H2O	0.01 mg/L	0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L)
	Na2MoO4∙2H2O	7 mg/L	7 μg/L(Mo:2.8 μg/L)
4: ナフコ3	ナフコ3	50 g/L	50 mg/L (C: 7.14 mg/L)

表1:藻類増殖培地用ストック液中の栄養素濃度

注:H₃BO₃ は0.1 M NaOHを加えることによって溶解することができる。金属イオンによる複雑化を避けるために、金属を試験する際にはEDTAを取り除く必要があります。膜濾過(平均細孔径0.2μm)またはオートクレーブ(120°C、15分)によってストック液を滅菌します。オートクレーブストック溶液2と4は使用しないでくださいが、膜ろ過によって滅菌してください。4°Cで暗闇の中でソリューションを保存します。

2. 藻類成長培地の1 Lを製造するには、500 mL滅菌化された超純水を1 L滅菌された体積フラスコに移し、10 mLのストック溶液1を加える:マクロ栄養素、1 mLのストック溶液2:Fe-EDTA、1 mLのストック溶液3:微量元素、および1 mLのストック溶液4:NaHCO_3.
3. 滅菌された超純水で1 Lまで満たし、フラスコをストッパーし、十分に振って藻類の成長培地を均質化します。
4. 空気と接触して一晩放置するか、滅菌、ろ過空気を30分間泡立て、使用前に溶液を平衡化します。平衡後、pHを必要に応じてpHを0.2±、1 M HClまたは1 M NaOHで調整します。

3. 藻類試験の設定

注: 藻類試験手順のフロー図を 図 2に示します。

図2:藻類試験の設定の流れ図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. ステップ2に従って調製した藻類増殖培地において所望の最高試験濃度で試験化合物のストック溶液を調製する。ストックソリューション/サスペンションの調製については、OECD 201(可溶性化合物の場合)またはOECD 318(ナノ材料用)に従ってください。
2. ストック溶液中のpHを測定します。藻類増殖培地から複数の単位がずれる場合は、pHを1 M HClまたは1 M NaOHのいずれかで8に調整します。
3. 25 mL試験溶液で1 x 10⁴ 細胞/mLの最終的な細胞濃度に到達するために必要な接種量を計算します。
   注:接種は、LEVITATTセットアップを使用して成長した汚染されていない指数関数的に成長している ラフィドセリスの潜在性 から来る必要があります。
4. 各25 mL体積フラスコに添加するストック溶液の量を計算し、所望の試験濃度を求める。各濃度間の係数は3.2を超えてはなりません。
5. 選択した濃度ごとに1つの25 mL体積フラスコと、さらに25 mLの体積フラスコをマークコントロールします。
6. 25 mL体積フラスコに所望の濃度に達するために必要な試験化合物のストック溶液の量を加える。コントロールにストック ソリューションを追加 しないでください 。
7. 各25 mL容積フラスコに培地を加えると、約20mLの体積に達します。
8. ステップ3.3で計算した接種量を各25mL体積フラスコに加えます。各25 mL容積フラスコに培地を加える 25 mL の最終総容積に.
9. フラスコをストッパーし、フラスコを2回垂直に回して十分に混ぜます。
10. 各フラスコから0.4mLを個々のスクリューキャップバイアルに移し、1.6mLのアセトン(MgCO₃で飽和)を加える): 試験濃度と制御ごとに1サンプル。蓋をしっかりと閉じ、蛍光測定(セクション4)まで室温で暗闇の中に保管します。
11. 各試験溶液のピペット4 mLを20 mLシンチレーションバイアル(濃度あたり3回の反復、対照用に5回の反復)。シンチレーションバイアルのネジ蓋。Remember _CO2交換を可能にするために、蓋には穴(直径約1mm)が必要です。
12. 24時間、48時間、72時間後、各バイアルからスクリューキャップバイアルに0.4mLをピペットし、1.6mLのアセトン(MgCO₃で飽和)を加える。蓋をしっかりと閉じ、蛍光測定(セクション4)まで室温で暗闇の中に保管します。
13. 最後のサンプルが72時間で採取された後、1つのバイアルに与えられた濃度のために3つの複製物を静かにプールし、pHを測定する。すべての濃度とコントロールに対して繰り返します。pHは、測定されたサンプルの初期pHから1.5単位以上逸脱してはならない。
14. 残りの液体を、お客様の制度上の規則および規制に従って、廃液容器に排出します。

4. 藻類試験サンプルの分析

1. 蛍光分光光度計を使用して、藻類バイオマスを測定する(ここではクロロフィルAとして表す)。クロロフィルAのピーク発光は励起波長で420nm、発光波長で671nmです。
2. 個々のサンプルの蛍光を3回測定し、各サンプルの平均値を計算します。
3. 成長速度を計算するには、式 1 を使用します。測定された蛍光(相対単位)を、式1のバイオマスパラメータとして直接使用することができる。
   式 1: μ = (ln N_t – ln N₀₎/ t
   ここでμは成長率(d^-1)、N0は初期バイオマス、Ntは_t時間t、tは試験期間(d)の長さである。₀なお、N₀と_Ntは同じ単位で表現する必要があります。
4. 非線形回帰曲線(例えば、対数ロジスティックまたはワイブル関数)を増殖率データに適合させる統計ソフトウェアを使用して、10%、20%、および50%阻害で有効濃度値を得る。補足情報では、DRCパッケージ¹¹ を用いた統計ソフトウェアRに適合するためのコードの例が与えられている。

結果

基準物質を用いた初期試験を行い、藻類株の感度を判定する。R.サブペタに定期的に使用される基準物質は、ジクロメートカリウムおよび3,5-ジクロルフェノール^77,88である。図3および表2は、R中のDRCパッケージが成長率に適用された場合の曲線適合および統計出力を含む藻類試験の代表的な結果を示す。

図3:藻類への化学化合物の72時間曝露に対する代表的な濃度応答曲線(R.首下子)。実線は対数ロジスティック適合を表し、シェーディング領域は適合度の 95% 信頼区間です。開いた円は、...

ディスカッション

植物プランクトンは太陽エネルギーと二酸化炭素を有機物に変換し、水生生態系において極めて重要な役割を果たしています。このため、藻類増殖率阻害試験は、化学物質の規制リスク評価に必要な3つの必須の水生毒性試験の1つとして含まれています。信頼性が高く再現可能な藻類毒性試験を行う能力は、この点において重要です。アーレンマイヤーフラスコを使用したテスト設定では、導入に記載されているように、さまざまな変動性と不便性が導入されています。この問題を回避するために、マイクロティタープレートは³を提案されている。マイクロタイタープレートは、テストに必要な体積とスペースを最小限に抑える一方で、試験ガイドライン⁶の試験有効性基準を用いたそのようなセットアップの遵守に関して文献で懸念が提起されている。例えば、細胞成長培地における37°Cのマイクロタイタープレートにおける半揮発性化学物質の有意な損失および他のウェルへのクロスオーバー(DMEMグルテマックス、オプティ-MEM、およびハムF12グルタマックス)は、最近、バーチららによって実証

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトン	Sigma-Aldrich	V179124
塩化アンモニウム	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap ボトル (1L)	Buch &ホルムA/S
ホウ酸	Sigma-Aldrich	B0394
カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	208290
透明アクリルシート(40x40 cm)
塩化コバルト(II)六水和物	Sigma-Aldrich	255599
(II)塩化物二水和物	Sigma-Aldrich	307483
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物	Sigma-Aldrich	E5134
蛍光分光光度計 F-7000	日立
塩酸	Sigma-Aldrich	258148
塩化鉄(III) 六水和物	Sigma-Aldrich	236489
LED 光源	Helmholt Elektronik A/S	H35161	ニュートラルホワイト、6500K
塩化マグネシウム六水和物	Sigma-Aldrich	M9272
硫酸マグネシウム七水和物	Sigma-Aldrich	230391
塩化マンガン(II) 四水和物	Sigma-Aldrich	221279
オービタルシェーカー	IKA	2980200
リン酸カリウム一塩基性	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1菌株
シンチレーションバイアル(20 mL)	Fisherscientific	11526325
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S6014
水酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich	415413
モリブデン酸ナトリウム二水和物	Sigma-Aldrich	331058
スプリングクランプ	フレデリクセンサイエンティフィック A/S	472002
サーモスタットキャビネット	VWR	WTWA208450	代替:温度制御された部屋
換気パイプ (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
メスフラスコ (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
塩化亜鉛	Sigma-Aldrich	208086