方法論記事

Aspergillus oryzaeの補助栄養変異体を用いた異種タンパク質の産生評価のための直接液体培養スクリーニング

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DOI：

10.3791/61219

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2020年5月12日

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

この記事について

サマリー

異種タンパク質の分泌産生の評価に用いる場合、糸状真菌 Aspergillus oryzaeのポリエチレングリコール(PEG)媒介プロトプラスト形質転換に必要な時間を大幅に短縮する直接液体培養(DLC)スクリーニング法が開発されました。この方法により、評価プロトコルのスループットが劇的に向上します。

要約

糸状菌であるAspergillus oryzaeは、タンパク質の大規模生産を含む産業用途に最も広く使用されている宿主の1つです。ポリエチレングリコール(PEG)を介したプロトプラスト形質転換法は、一般に、A. oryzaeへの異種遺伝子の導入に使用されます。従来の方法では、通常、好ましい形質転換体のスクリーニングに3週間を要します。ここでは、新しい技術である直接液体培養(DLC)スクリーニング法が導入され、スクリーニング時間を200 mLフラスコ形式で6日間、24ウェルマイクロプレート形式で10日間に短縮します。DLCスクリーニング法は、従来のスクリーニング法とは異なり、ポジティブな形質転換体の獲得と異種タンパク質の分泌産生の評価を1つのステップで行うことができます。PEGを介した麹菌のプロトプラスト形質転換のプロトコールが説明されており、新鮮胞子懸濁液の調製、前培養、プロトプラストの調製、DNAの導入、およびDLCスクリーニングの5つのステップで構成されています。DLCスクリーニングで良好な結果を得るには、浸透圧が最適化された栄養豊富な培地を使用することが重要です。このプロトコルは、タンパク質の工業生産における宿主としてA. oryzaeの使用をさらに普及させるはずです。

概要

麹菌(Aspergillus oryzae)は、1000年以上にわたって日本酒(米酒)、醤油(醤油)、味噌(味噌)などの発酵食品の製造に使用されてきた日本の食品業界における重要な微生物です1,2。プロテアーゼやアミラーゼなどのタンパク質を大量に分泌する能力があります3。A. oryzaeのゲノム配列情報も入手可能です4。さらに、この真菌5,6,7,8,9,10に対して、強力で実用的に有用な遺伝子工学技術が確立されています。好ましい形質転換体は、異種タンパク質11,12,13,14の分泌産生の宿主として使用されてきた。

エレクトロポレーション、アグロバクテリウム媒介形質転換、およびポリエチレングリコール(PEG)媒介プロトプラスト形質転換は、A. oryzae 15,16,17に異種遺伝子を導入するために使用される技術です。PEG媒介プロトプラスト形質転換法は、1979年にNeurospora crassaで初めて報告されて以来、広く使用されてきた18。この方法では、プロトプラストを調製し、PEGおよび細胞に導入される異種遺伝子と混合します。プロトプラストの壁は酵素的に損なわれているため、細胞は物理的ストレスや浸透圧の変化に対して脆弱になります19,20。異種タンパク質の分泌産生に採用されている従来のスクリーニング法には、3つのステップが含まれます:正の形質転換体の取得(軟寒天プレート上)、真および偽の形質転換体の選択(寒天プレート上)、および異種タンパク質の分泌産生の評価(液体培養中)。これらの各ステップには 7 日間かかります(図 1)。したがって、従来の方法では通常約3週間かかります。

形質転換 麹菌 のスクリーニングに必要な時間は、バイオテクノロジー研究で一般的に使用される他の微生物のスクリーニングよりもはるかに長く、このプロセスをより煩雑なものにしています。例えば、 大腸菌 を宿主として用いる場合、DNAの導入からその効果の確認まで約2日かかる21。

上述した 麹菌 の使用に伴う制限を回避するために、本明細書では、新しい直接液体培養(DLC)スクリーニング法が導入され、これにより、異種タンパク質の分泌産生の評価のためのより迅速で簡便なスクリーニングが可能になる(図1)。DLC法では、ウリジン補助栄養変異体と栄養豊富な液体培地が使用されます。この方法を使用すると、200 mLフラスコ形式でDNAをプロトプラストに導入してから6日以内に、または24ウェルマイクロプレート形式で10日以内にスクリーニングステップを完了することができます。さらに、この方法では、時間と手間のかかる寒天プレート培地の調製は必要ありません。特に、従来の方法では、慎重な取り扱いと温度制御が必要なポジティブトランスフォーメントの取得のための軟寒天プレートと、真のトランスフォーマントの選択のための固体寒天プレートの2つの異なる媒体が必要であるという事実を考慮すると、新たに記載された方法を使用することには大きな利点があります。

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図1:糸状菌 Aspergillus oryzaeのポリエチレングリコール(PEG)を介したプロトプラスト形質転換の概略図。
(トップパネル)従来のスクリーニング方法。(底面パネル)直接液体培養(DLC)スクリーニング法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

1.新鮮な胞子懸濁液の調製

  1. Czapek-Dox(CD)培地を含む培養プレートの中央に、20 μLのストック胞子懸濁液(1 x 107 胞子/mL)に20 mMウリジンを接種します(121°Cで20分間オートクレーブ滅菌、 表1)。
  2. 30°Cで7日間インキュベートし、胞子の形成を促進します。
  3. 胞子を含む培養プレートに0.01% Tween 20溶液(121°Cで20分間オートクレーブ保存)1.5 mLを加え、セルスプレッダーで胞子を掻き取って胞子を懸濁します。
  4. ピペットを使用して、胞子懸濁液を滅菌済みの1.5mLマイクロ遠心チューブに回収します。
  5. 懸濁液は使用するまで4°Cで保管してください。
    注:2週間以内に次の手順で胞子懸濁液を使用してください。長期保存用のストックを作るには、グリセロールを胞子懸濁液に添加して最終濃度を15%にし、-80°Cで保存します。

2.プレカルチャー

  1. 500 mLの三角フラスコに100 mLのポリペプトン-デキストリン(PD)培地(表2)を加え、121°Cで20分間オートクレーブします。
  2. 培地の温度が下がったことを確認した後、孔径0.22μmのフィルターを通過して滅菌したウリジン溶液を最終濃度20mMまで加えます。
  3. ステップ1.4で調製した胞子懸濁液(1 x 107 胞子/mL)200 μLを加え、120 rpmで36時間振とうしながら30°Cでインキュベートします。

3. プロトプラストの調製

  1. ステップ 2.3 で調製した真菌バイオマスを、細孔径 30 μm のガラスフィルター (121 °C で 20 分間オートクレーブ保存) で回収します。
  2. ガラスフィルターに100 mLの蒸留水(DW)(121°Cで20分間オートクレーブ保存)を注ぎ、スパチュラ(121°Cで20分間オートクレーブ保存)で数回撹拌します。
  3. DWで洗浄後、ガラスフィルターに塩化ナトリウム(NaCl)緩衝液100mL(121°Cで20分間オートクレーブ保存、 表3)を注ぎ、スパチュラで数回撹拌します。
  4. スパチュラを使用して、約1-2 mL(湿潤量)の細胞を50 mLのコニカルチューブに移します(121°Cで20分間オートクレーブ処理)。
  5. 15 mLの酵素溶液(0.22 μmの孔径フィルター、 表4を通過させて滅菌)を50 mLのコニカルチューブに加えた後、総容量が30 mLに達するまでNaClバッファーを加えます。
  6. フタを閉め、パラフィンフィルムで密封します。30°Cでインキュベートし、60rpmで2時間振とうします。
  7. 得られた溶液を50mLのコニカルチューブに取り付けられた70μmのセルストレーナーに流し、未反応の菌糸体を除去します。
  8. プロトプラスト溶液を50 mLコニカルチューブに入れ、2,150 x g 、4°Cで20分間遠心分離します。
  9. ペレットが外れないように、上澄みをそっと捨ててください。氷冷滅菌溶液B(121°Cで20分間オートクレーブ保存、 表5)1 mLを加え、沈殿したプロトプラストをピペッティングで穏やかに懸濁します。
  10. 懸濁したプロトプラストを滅菌済みの1.5mLチューブに移します。
  11. 2,220 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。その後、氷冷溶液B1 mLを加え、ピペッティングでペレットを穏やかに懸濁します。
  12. 手順3.9を繰り返します。
  13. 血球計算盤を使用して、顕微鏡下でプロトプラストの数を測定します。
  14. 溶液Bにプロトプラスト懸濁液(1−3 x 107 protoplasts/mL)を調製し、使用するまで氷上に保存します。
    注意: 次の手順ですぐにプロトプラスト懸濁液を使用してください。

4. タンパク質の分泌生産のためのDNAの導入

  1. タンパク質の分泌生産に必要なDNAカセットを含むプラスミドを鋳型として、PCRによる分泌生産に必要なDNA断片を増幅します。
  2. 形質転換に使用するDNAサンプルを調製するには、PCR精製キットを使用してPCR産物をプロセシングします。
  3. プロトプラスト溶液1 mL、溶液C200 μL(121°Cで20分間オートクレーブ保存、 表6)、DNAサンプル50 μL(0.5-1 μg/μL)を滅菌済みの予冷済み15 mLコニカルチューブに加え、ピペッティングで溶液を穏やかに混合します。
    注:ソリューションCは粘性が高く、取り扱いが難しい場合があります。ピペッティングによる完全な混合を確保します。
  4. チューブを氷上で30分間インキュベートします。
  5. 溶液Cを1.5mL加え、ピペッティングで穏やかに混合した後、溶液を室温で20〜30分間放置します。

5. 直接液体培養スクリーニング

注:三角フラスコ(セクション5.1)またはマイクロプレート(セクション5.2)を使用して培養システムを選択します。

  1. 200 mL 三角フラスコを使用した培養システム
    1. 0.8 Mソルビトールを含むPD培地50 mLを200 mLの三角フラスコに加え、121°Cで20分間オートクレーブ滅菌します。
    2. 培地の温度が下がったことを確認した後、ステップ4.5で調製したプロトプラスト懸濁液を最終濃度1 x 105 プロトプラスト/mLまで添加します。
    3. 120rpmで振とうしながら、30°Cで6日間培養物をインキュベートします。
    4. 培地1 mLを回収し、1.5 mLチューブに4°Cで保存します。 培養サンプルは、すぐに分析しない場合は-20°Cで保存してください。
    5. 1.5 mLチューブに、培養サンプル20 μLとドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプルバッファー20 μL(表7)を混合し、95°Cで5分間煮沸します。
    6. 氷上で冷却した後、煮沸したサンプル20 μLと染色済みタンパク質標準液5 μLをプレキャストゲルにロードし、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)10により、標的異種タンパク質の分泌産生を分析します。
  2. 24ウェルマイクロプレートを使用した培養システム
    1. ステップ 4.5 で調製したプロトプラスト懸濁液を滅菌した 0.8 M ソルビトール含有 PD 培地に添加し、最終濃度 1 x 105 プロトプラスト/mL まで加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
    2. ステップ 5.2.1 で調製した溶液 1 mL を 24 ウェルマイクロプレートの 3 つのウェルに加えます。
    3. 蓋を固定し、30°Cで175rpmで振とうしながら10日間インキュベートします。
    4. 1mLの培地を収集し、1.5mLのチューブに4°Cで保存し、すぐに分析しない場合は、培養サンプルを-20°Cで保存する。
    5. 培養サンプル20μLとSDSサンプルバッファー20μLを1.5mLチューブに混合し、95°Cで5分間煮沸します。
    6. 氷上で冷却した後、煮沸したサンプル20 μLと染色済みタンパク質標準品5 μLをプレキャストゲルにロードし、SDS-PAGE10により標的異種タンパク質の分泌産生を解析します。

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結果

Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase(CBH:GenBank Accession Number E39854)のDNA発現カセットをA. oryzae HO422株のウリジン補助栄養生物に導入し、異種タンパク質の分泌産生をスクリーニングした結果を以下に述べる。

新鮮な胞子懸濁液の調製

1つの寒天プレートからの胞子懸濁液の最終収量は1 mL(1 x 107 胞子/ mL)でした。

プレカルチャー

36時間インキュベートした後、ステップ3.1で回収した1つのフラスコから~5 mL(湿潤量)の真菌バイオマスが得られました。歩留まりは、ステップ3.2の少なくとも2回の試行に十分でした。

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ディスカッション

私たちは、プロトプラストの液体培養を行うことにより、従来の方法よりも迅速に A. oryzae 形質転換体のスクリーニングを可能にするシステムを開発しました。この方法の最も重要な側面は、液体媒体の浸透圧です。液体培養に適した浸透圧は、ソルビトールを使用して最適化しました。 麹菌 HO4株の増殖は、0.8Mソルビトールの存在下で最も活発であった(図3A)。軟質寒天培地を用いた従来の方法では、0.5−1.2 Mの浸透圧が N. crassa、 Aspergillus sp.、 Trichoderma sp.に適していることが報告された21。浸透圧調整剤には、ソルビトール、NaCl、塩化カリウム(KCl)、および硫酸マグネシウム(MgSO4)21が含まれる。使用するひずみの種類によっては、浸透圧レギュレーターと目...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、実験に協力してくれた岡野凛慶に感謝します。筆者よりは、貴重な議論をいただいた東北大学の五味克也教授と金沢工業大学の町田雅之教授に感謝いたします。本研究は、株式会社ホンダ・リサーチ・インスティテュート・ジャパンの助成を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC. (ナオ ナカライ テスク37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)富士フイルム和光純薬318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)富士フイルム和光純薬2106-100
1.5 mL 微量遠心チューブAS ONECorporation 1-1600-03
15 mL コニカル遠心チューブBecton, Dickinson and Company352196
2-メルカプトエタノールバイオ・ラッド・ラボラトリーズ
24ウェルマイクロプレートAGCテクノグラス(株)3820-024
50 mL 円錐形遠心分離管Becton, Dickinson and Company352070
70-µm セルストレーナーベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー352350
寒天富士フイルム和光純薬010-15815
オートクレーブカラトミー精工(株)LSX-700
ブロモフェノールブルー富士フイルム和光純薬工業021-02911
CaCl2富士フイルム和光純薬工業038-24985
カサミノ酸富士フイルム和光純薬工業393-02145
セルラーゼR-10コスモバイオ(株)16419
デキストリン水和物富士フイルム和光純薬工業044-00585
D-ソルビトール富士フイルム和光純薬工業191-14735
e-PAGELアトー株式会社E-T/R1020LSDS-PAGE
電気泳動装置トー株式会社WSE-1150SDS-PAGE
に使用FeSO4·7H2O富士フイルム和光純薬098-01085
ガラスフィルター 17G3東京ガラス製品(株)
グリセロール富士フイルム和光純薬株式会社070-04941
血球計算盤舟越株式会社521-10
高速冷蔵遠心分離機久保田工業778050mL円錐形遠心チューブ内のサンプルの遠心分離に使用
インキュベータタイテック株式会社。G&ミッドドット;BR-200フラスコ液の培養やプロトプラストの調製に使用
キュベータTAITEC CORPORATION.BR-43FLマイクロプレート液培養・プレート培養に使用
KCl富士フイルム和光純薬工業163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
溶解酵素Sigma-AldrichL1412-10G
MgSO4·7H2O富士フイルム和光純薬株式会社131-00405
マイクロ冷凍遠心分離機久保田株式会社37401.5mL微量遠心チューブ内のサンプルの遠心分離に使用
顕微鏡ライカマイクロシステムズDMI6000 B
NaCl富士フイルム和光純薬株式会社190-13921
NaH2PO4·2H2oナカライ・テスク31718-15
NaNO3富士フイルム和光純薬工業株式会社195-02545
パラフィルム・エム・ビーミス・カンパニー・インクPM-996
PCR精製キットキアゲン株式会社28104
シャーレ住友ベークライト株式会社MS-11900培養プレートとして使用
ポリエチレングリコールSigma-AldrichP3640-500G
ポリペプトン ペプトンベクトン、ディッキンソン・アンド・カンパニー211910
タンパク質ラダーバイオ・ラッド・ラボラトリーズ161-0377SDS-PAGE
ドデシル硫酸ナトリウムBio-Rad Laboratories, Inc.
滅菌フィルターメルク KGaASLGP033RB
ショ糖NACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20東京化学工業株式会社T0543
ウリジンSigma-AldrichU3750-25G
タタラセタカラバイオT017
1610710 タア0000094147ー インー の分子量マーカーとして使用 1610301

参考文献

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