細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

Summary

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。

Abstract

細胞内酸化/還元バランスを測定すると、生物の生理学的および/または病的な生理学的なレドックスの状態の概要を提供します。チオールは、ジチオールと酸化ジスルフィド比を使用して細胞の酸化還元状態を照らすのに特に重要です。設計されたシステイン含有蛍光タンパク質は、レドックス感受性バイオセンサーの新しい時代を開きます。そのうちの一つは、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質(roGFP)を、アデノウイルス伝達を伴う細胞に容易に導入することができ、細胞内のレドックス状態を細胞内プロセスを中断させることなく評価することができる。roGFPの減少したシステインおよび酸化シスチンは、それぞれ488nmおよび405nmで励起最大量を有し、525nmで発光する。これらの還元および酸化形態の比率を評価することで、細胞内の酸化還元バランスの計算が便利になります。この方法記事では、ヒト三重陰性乳癌細胞(MDA-MB-231)を使用して、生細胞内の酸化還元状態を評価した。プロトコルステップには、細胞細胞群roGFPを発現させるアデノウイルスによるMDA-MB-231細胞株の伝達_、H2O2による治療、₂およびフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の両方を用いたシステインおよびシスチン比の評価が含まれる。

Introduction

酸化ストレスは、1985年にヘルムート・シーズによって「前者に有利なプロキシダント抗酸化バランスの乱れ^」として定義され、多くの研究が行われ、生物^1、2、32,の疾患、栄養、および老化特異的な酸化還元状態を得¹るために多くの研究が行われている。³それ以来、酸化ストレスの理解はより広がっています。病気や老化に対して抗酸化物質を使用する仮説をテストすると、酸化ストレスが害を引き起こすだけでなく、細胞内の他の役割も持っていることを示しています。さらに、科学者たちは、フリーラジカルがシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを示^{している。}これらの研究のすべては、高分子の還元酸化(酸化還元)比の変化を決定することの重要性を強化します。酵素活性、酸化防止剤、酸化産物、酸化生成物は、様々な方法で評価することができます。これらの中で、チオール酸化を決定する方法は、細胞内の抗酸化物質とプロオキシド物質のバランス、ならびに生物⁴とのバランスについて報告するので、間違いなく最も使用されている。具体的には、グルタチオン(GSH)/グルタチオンジスルフィド(GSSG)および/またはシステイン(CyS)/シスチン(CySS)との比率が....

Protocol

注: このプロトコルは、70%~80% コンフルエント MDA-MB-231 セルに最適化されました。他の細胞株の場合、細胞数と感染の多重度(MOI)を再最適化する必要があります。

1. 細胞の調製(1日目)

1. MDA-MB-231細胞株を、5%CO2加湿雰囲気で37°Cで10%の胎児ウシ血清(FBS)を添加したダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)10 mLの75 cm₂フラスコで維持します。²
   
2. 2. 
      
   4. 
      

1. 
   
   
4. 
   
5. 
   
6. 
   

Results

CyS/CySSのレドックス状態は、トランスデューセロフェスで簡単にアッセイされます。蛍光プローブは、還元型と酸化形態(励起波長488nmおよび405nm)の比率を定量化します。蛍光データは、フローサイトメトリーと顕微鏡の両方で得ることができます。

多数の細胞がフローサイトメトリーを用いて一貫してかつ便利に獲得できる。分析は3つの主要なステップで構成されています:1)FSCエリアフィルタ(図1A)で対象のセル集団を選択します。2) roGFP発現細胞に対して、488/emを付けてゲートします。選択バンドパスフィルターを備えた 525 nm (図 1B);そして3)酸化されたroGFP含有細胞をroGFP発現細胞から、例えば405 nm/emでゲートする。525 nmのバンドパスフィルタ(図1C)。

新しい各細胞株は、roGPSの最適なアデノウイルス伝.......

Discussion

生物におけるチオール/ジスルフィドバランスは、細胞の酸化還元状態を反映する。生物はグルタチオン、システイン、プロテインチオール、低分子チオールを有し、そのすべてが細胞⁴の酸化レベルに影響され、酸化状態をエコーする。工学的roGFPはCyS残基⁷を介してチオール/ジスルフィドバランスの無停止定量化を可能にする。roGFPのレシオメトリック特性は、哺乳動物細胞に信頼性の高いレドックス測定を提供します。roGFPはトランスフェクション法やトランスダクションベクターを用いて細胞に容易に導入できますが、アデノウイルスの導入は効率が高くなります。

細胞の酸化還元状態は、細胞環境(例えば、細胞の合流性および培地の体積)によって容易に影響を受ける。このプロトコルでは、最適化された細胞播種合流は60%~70%と判断され、cmあたり15,000細胞^/cm2;分析の日に、細胞は70%〜80%コンフルエントであった。しかし、細胞の形態と倍の時間は細胞株によって異なります。このため、研究者が.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	細胞培養
4ウェルチャンバースライド	Thermo Scientific	154526	蛍光イメージング用細胞播種材料
細胞ストレーナーキャップ付き 5 ml チューブ	Falcon	352235	フローサイトメトリー分析用シングルセル懸濁液チューブ
6 ウェルプレート	Corning	353046	フローサイトメトリー分析用細胞播種材料
15 ml コニカルチューブ	MidSci	C15B	細胞培養
75 cm2 ベンチレーテッドキャップ 組織培養フラスコ	コーニング	4306414	細胞培養
アデノウイルス サイトゾル特異的 roGFP	ViraQuest	VQAd	roGFP roGFP コンストラクト Dr. Schumaker
提供 クラス II、タイプ A2 安全フードキャビネット	Thermo Scientific	1300 Series A2	細胞培養
Countess 自動セルカウンター	Invitrogen	C10227	細胞計数
Countess セルカウンターチャンバースライド	Invitrogen	C10283	細胞計数
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	細胞培養
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	細胞培養
フィルター付きピペットチップ、滅菌済み、20 & マイクロ;l	フィッシャーブランド	02-717-161	細胞培養
フィルター付きピペットチップ、滅菌済み、1000 & マイクロ;l	フィッシャーブランド	02-717-166	細胞培養
フローサイトメーター	BD バイオサイエンス	LSRFortessa	フローサイトメトリー分析用FITCおよびBV510バンドパスフィルターを装備した機器
蛍光顕微鏡	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	蛍光イメージング
過酸化水素 30%	フィッシャーサイエンティフィック	H325-100	ポジティブコントロール
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	細胞培養
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	細胞培養
ピペットコントローラー	Drummond	Hood Mate Model 360	細胞培養
血清学ピペット、1 ml	フィッシャーブランド	13-678-11B	細胞培養
血清学ピペット、5 ml	フィッシャーブランド	13-678-11D	細胞培養
血清学ピペット、10 ml	フィッシャーブランド	13-678-11E	細胞培養
組織培養インキュベーター	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2細胞培養用インキュベーター
トリパンブルーステイン 0.4%	Invitrogen	T10282	細胞計数