部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

サマリー

単一分子レベルでのDNAの部位特異的切断を測定するための高度に平行な方法が記載されている。このプロトコルは、制限エンドヌクレアーゼNdeIを用いた手法を示す。この方法は、部位特異的なDNA切断をもたらす任意のプロセスを研究するために容易に改変することができる。

要約

部位特異的DNA切断(SSDC)は、多くの細胞プロセスにおける重要なステップであり、遺伝子編集にとって極めて重要です。本研究は、多くの単DNA分子で同時にSSDCを測定することができる運動アッセイを記述する。ビーズ・テザード基板DNAは、それぞれ標的配列の単一コピーを含み、マイクロ流体流路に調製される。外部磁石は、常磁性ビーズに弱い力を与えます。広視野、低倍率の目的を使用して暗視野イメージング下のマイクロビーズを視覚化することによって、最大1,000個の個々のDNAの完全性を監視することができます。制限エンドヌクレアーゼの注入は、NdeI、切断反応を開始する。ビデオ顕微鏡は、関連するビーズが目的の焦点面を上下に移動するフレームを観察することによって、各DNA切断の正確な瞬間を記録するために使用される。フレームごとのビーズカウントは反応を定量化し、指数適合によって反応速度が決定されます。この方法は単一の実験で単一分子SSDC反応に関する定量的および統計的に有意なデータの収集を可能にする。

概要

部位特異的DNA切断(SSDC)は、多くのゲノム取引における重要なステップである。例えば、細菌制限修飾(RM)1¹およびCRISPR²システムは、特定の配列で外来DNAを認識および切断することによって、ファージおよびプラスミドによる攻撃から細胞を保護する。II型RMでは、制限エンドヌクレアーゼ(R)は、タンパク質-核酸相互作用を介して短い4–8塩基対(bp)配列を認識する^。CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、Cas9などの、エンドヌクレア^ーゼ4に結合したcrRNAを有する標的部位のハイブリダイゼーションを介して部位に結合する。部位特異的二本鎖破断(DSB)の作成も、多くのDNA組換えイベント⁵の第一歩である。例えば、V(D)J組換えによって作成された抗原結合領域の多様性は、特異的標的部位⁶の認識および切断を必要とする。いくつかのトランスポソンは、特定のDNA配列を標的とすることが知られている、⁷.当然のことながら、Cas9のようなこれらのプロセスに関与する多くの部位特異的ヌクレアーゼは、遺伝子編集技術⁸の重要な構成要素である。また、新規部位特異的エンドヌクレアーゼ(すなわち、ジンクフィンガーヌクレア^ーゼ9およびTALENS¹⁰⁾もゲノムを編集するように設計されている。

核酸の部位特異的切断の運動を測定するために多くの方法が採用されている。これらには、ゲル分析、蛍光^{11、12、,12}およびシーケンシングベースの方法¹³が含まれる。DNAの単一分子のDSBが鎖分離後のビーズの動きによって検出されることを可能にするマイクロビーズのテザリングで大きな進歩が達成されました。これらの方法では、異なるタイプの力が、ビード後切断のストランド分離および運動を確実にするために使用される。あるケースでは、光トラップがEcoRV¹⁴によるDNAの切断を測定するために使用されてきた。これらの実験では、ターゲット検索は調査の目的であり、サイト固有の結合がレート制限ステップになるように条件が最適化されています。光トラップの欠点の1つは、一度に1つのDNAしか観察できないということです。さらに、ストランド分離のテストには、周期的に大きな引き上げ力を適用する必要があります。

別の技術は、連続的な方法でビードを引っ張るために流れと弱い磁力の組み合わせを使用します¹⁵.このようにして、NdeIによる拡散制限された切断が測定される。この方法を用いると、同時に数百個のDNAを同時に測定することができ、1回の実験で統計的有意性を得ることができます。磁気ピンセットを用いた実験も行われている。そのような研究の1つにおいて、挿入オリゴヌクレオチド¹⁶にDSBを含めることによってレトロウイルスインテグラーゼを研究した。統合に成功すると、結合されたDNAにDSBが組み込まれ、付着したビーズが失われた。ATP依存性III型制限エンドヌクレアーゼEcoPIの同様の研究では、1回の実験¹⁷で数十のDNAが観察された。磁気ピンセットは、反応中に緊張を制御し、監視することができるという利点を有する。

ここでは、DAの大規模テザリングの最近の改善を利用したSSDCキネティクスを測定するための非常に平行な単一分子法を紹介します。この方法は、DNA複製^18、DNA19の輪郭長、および、R15による切断を測定するために用いられる以前¹⁵の方法の改良および延長である。¹⁹この技術では、認識配列の単一のコピーを含む線状DNAは、一方の端にビオチン、他方でジゴキシゲニンで調製される。ビオチンは、常磁性マイクロビーズに共有結合するストレプトアビジンに結合する。DNAビーズ複合体は、抗ジゴキシゲニンFAB断片で機能化されたマイクロ流体チャネルに注入される。次いでDNAは、二ゴキシゲニンを吸着したFAB断片に結合して表面付着点にテザーを付ける。永久磁石で弱い磁力を加えた場合、ビードが表面に非特異的に貼り付けられるのを防ぎます。サンプルは、流路に迅速に注入することができる(<30 s)切断反応を活性化する。データ収集中にフローがオフになります。各DNAが切断されると、ビーズが目的の焦点計画を上下に移動するフレームを記録することによって切断の正確な時間を決定することができ、したがってビデオレコードから消える。残りのビーズのフレームごとのカウントは、反応の進行状況を定量化するために使用することができます。

以下に示す完全なプロトコルと、NdeIを使用して収集されたデータの例を示します。この手法を適用する方法の一例として、タンパク質濃度の範囲に対する切断速度は、必須の金属補因子であるマグネシウムの2つの異なる濃度で測定される。このプロトコルの適用はNdeIを使用するが、この方法はDNA基質設計を変えることによって任意の部位特異的ヌクレアーゼとの使用のために適合させることができる。

プロトコル

1. フローセルの作成

1. カバーリップを洗う
   1. エタノール(EtOH)で瓶と超音波処理にカバースリップを置き、1 M KOH(それぞれ30分間)を使用します。EtOHのKOH沈殿を避けるために、洗浄の間にddH₂Oで十分に洗いす。
   2. EtOH と KOH 洗浄ステップ 1x の両方を、合計 4 回の洗浄回数 (2 回の EtOH と 2 つの KOH) に対して繰り返します。汚れた瓶の中にddH₂Oでクリーニングされたカバーリップを保管してください。
2. クリーンなカミソリを使用してローディングと出口チューブ(長さ8cm)をカットし、きれいなガラススライドの穴に挿入します。入口にはPE-20、出口にはPE-60を使用してください。エポキシは、チューブを確保し、余分なチューブをトリミングするために5分間。
   注:ガラススライドは2'x 3'x 1 mmを測定します。穴は15のmmの間隔でペアで開く。各ペアは、1 つのチャネルの両端を形成します。小さい ID のチューブは、上流のデッド ボリュームを減らし、必要な混合時間を減らすため、入口に使用されます (図 1)。
3. スライドの穴にチャンネルパターンを切り取ったプレカット両面テープを並べて適用します。プラスチック製の鉗子で滑らかにして、良好なシールを実現します。
   メモ:この実験で使用した両面テープの厚さは120μmで、チャンネル幅は2mm、長さは15mmです。チャンネルはナイフプリンタ(材料表)を使用して切断されます。1つのカバースリップに4つのチャネルまで合わせることは可能である。フローセルの画像については、 図1 を参照してください。
4. 裏地を剥がした後、テープの上にきれいなカバースリップ(圧縮空気で乾燥)を適用し、良好なシールのためのプラスチック製の鉗子で再び滑らかにします。
5. フローセルを密封し、それを治すためにカバースリップからエッジをエポキシ。

テザリング用標識DNAの調製

1. PCRチューブでは、0.02 U/μLの高忠実度DNAポリメラーゼ、200μM dNTP、0.5 μMフォワードプライマー、0.5 μMリバースプライマー、および250 ngのM13mp18ベクターDNAを含むPCR反応ミックスを50 μL調製します。
   注:フォワードプライマー(ビオチン-CCAACTTAATCGCcTTGC)およびリバースプライマー(ジゴキシゲニン-TGACCATTAGATACATTCGC)は、M1338から107までの位置に及ぶ長さ約1,000 bpの領域を増幅するために選択されました。増幅領域の中央に単一のNdeIサイトがあります。フォワードプライマーは、5ʹ、カバースリップ上の抗ジゴキシゲニンを結合するジゴキシゲニンで標識される。逆プライマーは、ストレプトアビジンコーティングビーズを結合するビオチンで標識5ʹ。
2. PCR チューブをサーモサイクラーに挿入し、 表 1に示すようにサイクルに従います。
3. メーカーのプロトコルに従って PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 製品を精製します。
   注: 材料表に指定されたキットを使用して、典型的なDNA収量は〜2μgです。

3. DNAとビーズのテザリング

1. バッファーA(1 Mトリス-HCl[pH = 7.5]、50 mM NaCl、2 mM MgCl_2、1mg/mL βカゼイン、1 mg/mLプルロニックF-127)の10 mLを調製します。少なくとも1時間真空デシケーター中のドガ。
2. フローセルを機能化するには、25 μL の抗ジゴキシゲニン FAB フラグメント(20 μg/mL)をPBSに流路に注入します。PE-60チューブに収まるようにゲルローディングチップを使用してください。室温(RT)で30分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、0.5 mLのバッファAをスポイトを使用してチャネルを通して流路をフラッシュする。チャネルに空気を導入しないように注意してください。
4. 機能化後、逆顕微鏡にフローセルを取り付けます。出口管をシリンジポンプに引き上げ、注入口チューブをバッファーAを含むマイクロ遠心分離管に入れます。
5. 手動でシステムをフラッシュし、ポンプをプライミングするために、バッファーAの少なくとも0.5 mLを引っ張ります。ポンプを10 μL/minで少なくとも5分間稼働させ、システムを平衡化します。
6. ビーズ(材料表)を調製するために、10 mg/mLストックビーズの1.6μLのビーズとピペットのストックボトルを50 μLのバッファーAに、次に渦を作ります。
7. 磁気セパレータを使用して、バッファーをピペットアウトし、バッファーAの50 μLで再中断し、次に渦を再中断します。
8. 3回の打ち上がりに対して、ステップ3.7 2xを繰り返します。最後の洗浄では、バッファAと渦の100 μLで再中断して、160 μg/mLの最終濃度を達成します。
9. DNAとビーズを複雑化させるために、まず、0.5 pM標識DNA基質の480μLをバッファーAに調製する。次に、160 μg/mLビーズ懸濁液の20 μLのピペットを、ピペット処理の前に必ずビーズをボルテックスします。3分間、回転器の上に置きます。
10. 3分後、15分間の流速10μL/minで、または十分なビーズテザリングが観察されるまで、すぐにチャネルにロードします。
    注: ビーズは、サーフェス上で相互に相互作用するほど密集してはなりません (説明のセクションを参照してください)。
11. すべてのフリービーズのチャネルを洗浄するには、インレットチューブをバッファーAの新鮮なチューブに切り替え、50 μL/minで少なくとも10分間、または緩いビーズが観察されないまで流れ込みます。

4. データ収集と分析

1. データ収集の準備をするには、インレットチューブを、バッファAのNdeI(0.25~4.00 U/mL)の少なくとも100 μLを含むマイクロ遠心管に入管を入れ、永久磁石を流路の上に下げ、暗視野イメージング用の軸外に光源を配置します。
   注:2つの環状希土類磁石は、一緒にエポキシスされ、データ収集中に片持ち光学ポストを使用して流路のアクティブ面の上に8mm保持されます。オフ軸ライトコースにはガチョウネックランプが使用されています。
2. 市販の顕微鏡、ビデオカメラ、データ収集ソフトウェア(資料表)を使用します。 ソフトウェアで [露出] タブをクリックし、[露出時間] を 10 ミリ秒に設定します。[Timelapse]タブをクリックし、[イメージの数] を 600 に設定し、[期間] を 20 分に設定し、[間隔] を 2 秒に設定します。[実行] をクリックしてデータ収集を開始します。
3. シリンジポンプで流量を150 μL/minに、注入量を80 μLに設定します。Run注入後、ポンプの電源を切り、データ収集中の流れを防ぐためにバルブを閉じます。
4. データが収集されたら、画像解析ソフトウェア(表)を開きます。[ファイル] タブで、[インポート] をクリックします。 "画像シーケンス"ポップアップメニューで画像ファイルを見つけ、「開く」をクリックします。
5. しきい値を設定するには、[イメージ] プルダウン メニューの [Thesholdを調整する] をクリックします。スライダ バーを使用して、イメージ内のビーズに対応する明るいスポットを識別するしきい値を設定します。
6. [分析] プルダウン メニューの [パーティクルの分析] をクリックして、各フレームの明るいスポットをカウントします。[OK] をクリックし、すべてのイメージを処理するには [はい] をクリックします。結果ファイルを保存します。
   注: これは、各録画ビデオ フレーム内のビーズの数を含むデータ ファイルを保存します。
7. データ分析ソフトウェア (表) を開き、結果ファイルをインポートするには、[ファイル] プルダウン メニューの [テキスト ファイルからインポート] をクリックします。ビード数データと時間をプロットします。
8. [分析] プルダウン メニューの[カーブ フィット] をクリックして、ビードの数と時間を合わせます。"自然指数" 方程式を選択し、[適合]をクリックします。 |"OK".
   注: サンプルの注入後に記録されたデータのみを継ぎ手領域に含める必要があります。フィッティング関数の指数の適合パラメータは、切断率になります。

結果

この技術を用いて、2つの異なる濃度のマグネシウム(2 mMおよび4 mM)で、さまざまなタンパク質濃度(0.25~4.00 U/mL)について、NdeIのSSDC速度を測定した。これらの条件のそれぞれは、実験ごとに数百から1,000のテザリングされたDNAで、少なくとも2回複製された。 図2 は実験計画を説明する。 図 3 は、データ収集と分析の詳細の例を示しています。 図4 は、マグネシウムの2つの濃度におけるタンパク質濃度にいかに依存するかを示す。十分に低いタンパク質濃度では、その速度は、タンパク質に比例し、マグネシウムから独立であることが観察することができる。十分に高いタンパク質濃度の場合、速度はマグネシウムに依存しますが、タンパク質濃度に依存しません。

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ディスカッション

このプロトコルは、実験中にストランド分離が観察される限り、任意のSSDCシステムの運動を測定するために使用することができる。切断の検出は、につながれたビーズの剥離を観察することによって影響を受け、したがって、ストランド分離の瞬間をマークします。すべての前のステップは、切断の検出前に発生します。したがって、合計通過時間のみが記録されます。

フローセルカバースリップは、クリーンガラスへの抗体タンパク質の非特異的吸着を介して機能化されます。十分に洗浄されたガラスは、抗体の結合に影響を与える可能性があります。テザリングでは、ビーズ密度が十分に低く、ビーズが相互作用しないようにする必要があります。取り付けポイントの表面密度は、官能化中の抗体の濃度によって制御することができる。ビーズの合計数は、視野のサイズによって異なります。この場合、数百から1,000個のつながれたビーズは良い統計のために十分であり、ビーズとビーズの相互作用を避けた。ビーズ注入中、表面テザリングはライブビデオを介して監視された。ビーズの推定数が500〜1,000ビーズの間であったときにビーズ注射を停止した。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5分間	エポキシ Devcon	14250
抗ジゴキシゲニン FAB フラグメント	ロシュ 診断	11214667001
カメラとソフトウェア	イエナオプティック	グリファックス SUBRA
データ分析ソフトウェア	バーニア株式会社		LP
両面テープ	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
フォワードプライマー:ジゴキシゲニン-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
画像解析ソフトウェア	国立衛生研究所	ImageJ
倒立顕微鏡	ニコン	TE2000
ナイフプリンター	シルエット
M13mp18 DNA	ニューイングランドバイオラボ	N4040S
MyOne ストレプトアビジンビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	65601
NdeI 酵素	ニューイングランドバイオラボ	R0111S
PCR クリーンアップキット	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
ポリエチレン チューブ PE-20	BD Intramedic	427406
ポリエチレン チューブ PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
希土類磁石 0.5" OD 0.25" ID	国内輸入	NSN0814
希土類磁石0.75 "OD 0.5 "ID	国民輸入NSN0615
逆プライマー:ビオチン-TGACCATTAGATACATTTCGC	統合DNA技術	n /シ
リンジポンプ	ケントサイエンティフィック	ジーニープラス
β-ウシミルク	シグマ-アルドリッチ	C6905