方法論記事

動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅

DOI：

10.3791/61239

⸱

2020年5月20日

 ,  ,  , 
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、多数の細菌、真菌、寄生、およびウイルス剤を迅速に検出するための強力な核酸増幅試験として登場しました。 サルモネラ菌 は、動物のための食品を含む世界的な食品安全上の懸念の細菌病原体です。ここに提示される多実験室で検証された サルモネラ ランププロトコルは 、サルモネラ 汚染の存在のために動物の食品を迅速にスクリーニングするために使用することができ、また、すべての食品カテゴリーから回収された推定 サルモネラ 分離株を確認するために使用することができる。LAMPアッセイは 、サルモネラ 属の浸潤遺伝子(invA)を特異的に標的とし、迅速、感受性、および非常に特異的である。テンプレートDNAは、動物性食品の濃縮スープまたは推定 サルモネラ 分離物の純粋な培養物から調製される。LAMP試薬混合物は等温マスターミックス、プライマー、DNAテンプレートおよび水を組み合わせることによって製造される。LAMPアッセイは、一定温度の65°Cで30分間実行されます。陽性の結果はリアルタイム蛍光によって監視され、早ければ5分で検出することができる。LAMPアッセイは、動物性食品または培養培地中の阻害剤に対して高い耐性を示し、 サルモネラ菌をスクリーニングおよび確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢で、費用対効果の高い、ユーザーフレンドリーな方法として機能する。LAMP法は、米国食品医薬品局の 細菌学分析マニュアル (BAM)第5章に最近組み込まれています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、日本の科学者グループによって2000年に発明された新しい等温核酸増幅試験(iNAAT)1である。初期段階で標的特異的なステムループDNA構造の形成を通じて、LAMPは、この出発物質を指数関数的に効率的に増幅するために、ストランド変位DNAポリメラーゼを使用し、1h1未満で109コピーの標的を生じる。広く使用されているNAATであるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と比較して、LAMPはいくつかの利点を有する。まず、LAMP反応は等温条件下で行われる。これは洗練された熱サイクリング器械のための必要性を取り消す。第二に、LAMPは、臨床および食品用途3、4の両方に対して実証された堅牢性を有する培養培地および生物学的物質2に対して非常に耐性である。これにより、サンプルの準備が簡素化され、偽陰性の結果が最小限に抑えられます 5。第3に、LAMPは、濁度、着色度、生物発光、蛍光、マイクロ流体など、複数の検出プラットフォームに適しています6。第4に、LAMPは、特別に設計されたプライマーを4~6個使用して、6~8個の特定の領域1、7をターゲットにするため、非常に具体的です。第5に、LAMPは超高感度であり、多くの研究はPCRまたはリアルタイムPCR8に対する優れた感度を報告している。最後に、LAMPは、現在、PCRタイプのアッセイは通常1-2時間8を取るが、現在30分の標準実行時間を採用している多くのアッセイで高速です。

これらの魅力的な特徴は、 体外 診断9、動物病診断10、食品および環境試験11を含む広い病原体検出領域におけるLAMPの適用を促進した。特に、結核ランプ(結核 菌用LAMP)は、末梢設定12における肺結核診断のための痰・スミア顕微鏡の有効な代替試験としてWHOによって推奨されている。LAMPアプリケーションはまた、アレルゲン、動物種、薬剤耐性、遺伝子組換え生物、および農薬13の検出を含むように微生物同定を超えて拡大する。

ノンチホイドサルモネラは、世界中の実質的な食品安全と公衆衛生上の懸念の人獣共通病原体である14.また、動物(すなわち、動物性食品)15,16の食品における重要な微生物ハザードとして同定されている。汚染されたヒト食品や動物性食品によるサルモネラの病気/発生を防ぐためには、サルモネラ菌を様々なマトリックスで検査するための迅速で信頼性の高い堅牢な方法が不可欠です。過去10年間で、最近の広範なレビュー8に要約されるように、幅広い種類の食品マトリックスにおけるサルモネラLAMPアッセイの開発と適用に関して、国際的にかなりの努力がなされている。ここに示されたものを含むいくつかのサルモネラLAMPアッセイは、確立された国際ガイドライン17、18、19、20に従って、マルチラボ検証を正常に完了しました。

当社のサルモネラランプアッセイは、具体的にはサルモネラ侵入遺伝子invA(GenBank加盟番号M90846)21を標的とし、複数の食品マトリックス4、22、23、24、25、26で迅速、信頼性、堅牢性を備えています。この方法は、事前共同研究26および多実験室共同研究19のドライドッグフードにおいて6つの動物食品マトリックスで検証されている。その結果、ここで提示されたサルモネラランプ法は、最近、米国食品医薬品局(FDA)の細菌学的分析マニュアル(BAM)第5章サルモネラ27に組み込まれ、動物性食品中のサルモネラ菌の存在を迅速にスクリーニングする方法として、そして2つは、すべての食品から単離された推定サルモネラ菌の信頼できる確認方法として組み込まれました。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:LAMP反応ミックスには、DNAポリメラーゼ、バッファー、MgSO4、dNTP、プライマー、DNAテンプレート、および水が含まれています。最初の4つの試薬は等温マスターミックス(材料表)に含まれています。プライマーは、プライマーミックス(10倍)になるために社内でプレミックスされています。DNAテンプレートは、スクリーニング目的のために動物性食品サンプルの濃縮スープから、または確認目的のために推定サルモネラ分離物の培養物から調製することができる。さらに、陽性対照(サルモネラ菌の参照株から抽出されたDNA、例えば、サルモネラ腸内野セロバーティフィムリウムATCC 19585[LT2])およびノーテンプレートコントロール(NTC;無菌分子グレード水)は、すべてのLAMPランに含まれています。

1. DNAテンプレートの作成

  1. 動物性食品の濃縮からDNAテンプレートを作成するには、次の手順に従います。
    1. 無菌の25gの動物食品サンプル(例えば、乾燥キャットフード、ドライドッグフード、牛飼料、馬飼料、家禽飼料、豚飼料)を無菌フィルターバッグ(材料表)、または同等の量を測定する。袋を大きな容器またはラックに入れ、インキュベーション時にサポートします。
    2. 滅菌緩衝ペプトン水(BPW)の225 mLを加える。渦巻きと短い手マッサージでよく混ぜます。室温で60分±5分間放置します。
    3. 旋回によってよく混ぜ、テストペーパーでpHを決定します。pHを、必要に応じて、滅菌1 N NaOHまたは1 N HClで6.8±0.2に調整し、35±2°Cで24±2時間インキュベートします。
    4. 動物性食品濃縮スープを入れた袋を渦巻いてよく混ぜます。袋のフィルターされた側面からマイクロ遠心チューブに1 mLを移す。渦は簡単に。
    5. サンプル調製試薬(材料表)を用いてDNAを次のように抽出する。
      1. 900 x g で 1 分間遠心分離機を大きな粒子を除去し、新しいマイクロ遠心分離管に上清を移します。
      2. 2分間16,000xgで遠心分離機を使用し、上清を捨てます。
      3. ペレットをサンプル調製試薬の100 μLにサスペンドし、100 ±°cで100°Cで100分間、乾いたヒートブロックで10分間加熱します。
      4. 室温まで冷却し、サンプルDNA抽出物を-20°Cで保存します。
  2. 推定 サルモネラ 培養からDNAテンプレートを調製するには、次の手順に従います。
    1. FDAのBAM第5章サルモネラセクションD:サルモネラ菌27の分離に続くすべての食品の培養分離から推定サルモネラ分離を取得します。
    2. 非選択的寒天プレート(例えば、血液寒天、栄養寒天、トリプティケース大豆寒天)上でインキュレートした推定 サルモネラ 分離物を、35±2°Cで24±2時間培養する。
    3. トリプチケース大豆ブロス(TSB)または脳心注入(BHI)ブロスの5mLにいくつかの単一コロニーを移し、35±2°Cで16±2時間インキュベートする。
      注: 推定 サルモネラ 培養が純粋である場合、このステップはオプションです。その場合、DNAテンプレートは、TSBの5mLに複数の単一コロニーを懸濁し、100±1°Cで500μLを乾燥熱ブロックで10分間加熱することによって調製することができます。次の手順 5 に進みます。
    4. 一晩培養した500μLをマイクロ遠心チューブに移し、100±1°Cで乾燥したヒートブロックで10分間加熱します。
    5. 室温まで冷却し、-20°Cで分離したDNA抽出物を保存します。
  3. 陽性対照DNAを調製するには、上記と同様の手順に従って、1つの余分な希釈ステップで推定 サルモネラ 培養からDNAテンプレートを調製します。
    1. 非 選択的寒 天板(例えば、血液寒天、栄養寒天、トリプティケース大豆寒天など)上のS.チフィムリウムATCC(LT2)または サルモネラ 参照株を接種し、35±2°Cで24±2時間培養する。
    2. TSBまたはBHIブロスの5 mLに複数の単一コロニーを移し、35±2°Cで16±2時間インキュベートして、約109 CFU/mLに達する。
    3. 一晩培養したペプトン水を0.1%で連続希釈し、〜107 CFU/mLを得る。
    4. この希釈液500μLをマイクロ遠心チューブに移し、100±1°Cで乾いたヒートブロックで10分間加熱します。
    5. 室温まで冷却し、陽性対照DNAを-20°Cに保存します。

2. プライマーミックスの調製(10倍)

  1. 市販の脱塩精製で市販のLAMPプライマー(Sal4-F3、Sal4-B3、Sal4-FIP、Sal4-BIP、Sal4-LF、およびSal4-LB)を得る(表1)。
プライマー名説明シーケンス (5'-3')長さ (bp)
サル4-F3前方外プライマーガーックググCGCGガーグクト18
サル4-B3後方外プライマーコグチャタグクト18
サル4-FIP前方内側プライマーGCGCGGGGCCGCATCAATA-TCTGGATATGCCCGG38
サル4-BIP後方内側プライマーGCGAACGGCGAGCGTクトグ-TCGCACCGTCAAAGGAC38
サル4-LFループフォワードプライマーTCAAATCGGカカアクトカ-TCTG25
サル4-LBループ後方プライマーアアググガーアGCGCTTTACG21

表1:動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニング し、 培養分離から サルモネラ菌 を確認するための LAMPプライマー。プライマーは 、サルモネラインVA シーケンス(GenBank加盟番号M90846)に基づいて設計されています。

  1. 適切な量の無菌分子グレード水でプライマーを水分補給することにより、各プライマー(100 μM)のストック溶液を調製します。10 sのボルテックスでよく混ぜ、-20°C(長期保存用-80°C)で保存してください。
  2. ワークシートに従ってプライマーミックス(10倍)を準備します(表2)。マイクロ遠心チューブにプライマーストック溶液と無菌分子グレードの水の適切な量を追加します。10sの渦によってすべての試薬をよく混ぜます。
コンポーネントストックコンク(μM)プライマーミックスコンク(μM)ボリューム(μL)
サル4-F3プライマー100110
サル4-B3プライマー100110
サル4-FIPプライマー10018180
サル4-BIPプライマー10018180
サル4-LFプライマー10010100
サル4-LBプライマー10010100
分子グレードの水N/aN/a420
合計N/aN/a1000

表2:LAMPプライマーミックス(10x)を準備するためのワークシート。 プライマーは 表 1にリストされています。

  1. アリコート10xプライマーはマイクロ遠心チューブあたり500 μLに混合し、-20°Cで保存します。

3. LAMP反応の組み立て

注: 相互汚染を防ぐために、LAMP マスターミックスの準備とDNAテンプレートの追加に使用する領域を物理的に分離することを強くお勧めします。図1はLAMP図である。

figure-protocol-1
図 1:サルモネラランプワークフローの概略図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. セットアップの準備と実行
    1. イソプロパノールとDNA分解溶液(材料表)を備えたクリーンベンチ。DNAおよびDNase分解溶液で、ピペットとチューブストリップホルダ(材料表)を洗浄します。
    2. 等温マスターミックス、プライマーミックス(10x)、分子グレード水、ポジティブコントロールDNA、DNAテンプレートを室温で解凍します。
    3. LAMPインストゥルメント(材料表)をオンにし、開画面をタップしてホーム画面にアクセスします。実行を作成するには、次の手順に従います。
      注:LAMP機器の1つのモデルは、各ブロックに8サンプルを持つ2つのブロック(AとB)を有し、別のモデルには8つのサンプル(材料表)を収容する単一のブロックを有する。
      1. LAMP +アニールをタップし、編集を選択してサンプル情報を入力します。
        注: デフォルトの LAMP 実行プロファイルは、65 °C で 30 分間の増幅と、98 °C から 80 °C までのアニールフェーズ (1 秒あたり 0.05 °C 減分) で構成されています。
      2. 各サンプル行をタップしてカーソルをアクティブにし、 関連 するサンプル情報を入力します。
      3. すべてのサンプル情報が入力されたら 、[チェック] アイコンをタップします。
        注: 必要に応じて、実行設定 (サンプル情報と既定の LAMP 実行プロファイルを含む "プロファイル" と呼ばれます) を保存して、後で使用することもできます。 [保存 ] アイコンをタップし、プロファイルに一意の名前を付けます。次回この同じサンプルセットをテストする場合、保存されたプロファイルを使用して新しい実行を開始できます。ホーム画面の左下にある フォルダ アイコンをタップし、[ プロファイル ]を選択して、保存したプロファイルをロードします。
  2. ランプ反応アセンブリ
    注:両方のLAMPインストルメントブロック(AとB、合計16サンプル)を使用する場合は、18サンプルのLAMPマスターミックスを準備してください。LAMPインストゥルメントブロックを1つだけ使用する場合(合計8サンプル)、10サンプルのLAMPマスターミックスを準備します。他のサンプル数については、ピペットロスに対応するように音量を調整します。すべてのLAMP実行に常に正のコントロールとNTCを含めます。独立したLAMP実行での各サンプルの重複したテストをお勧めします。
    1. ワークシートに従って LAMP マスター ミックスを準備します (表 3)。適切な量の等温マスターミックス、プライマーミックス、分子グレードの水をマイクロ遠心チューブに加え、渦は3s遠心分離機を軽く取り入れます。
    2. ストリップホルダーにチューブストリップを置き、ランプマスターミックスの23 μLを各ウェルに分配します。
    3. すべてのDNAテンプレートと遠心分離機を簡単にボルテックスします。適切なウェルに2μLのDNAテンプレートを追加し、しっかりとキャップします。
    4. ホルダーからチューブストリップを取り外し、手首をフリックして、すべての試薬がチューブの底に溜まったことを確認します。
    5. 管ストリップをLAMPインストルメントブロックに取り付け、蓋を閉める前にキャップが固定されていることを確認します。
コンポーネント作業conc.最終反応 conc.サンプルあたりの体積(μL)18サンプル(μL)の体積10サンプル(μL)の体積
ISO-001等温マスターミックス1.67x1x15270150
プライマーミックス10倍1x2.54525
分子グレードの水N/aN/a5.59955
マスター ミックスの小計N/aN/a23414230
DNAテンプレートN/aN/a2N/aN/a

表3:LAMP反応ミックスを準備するためのワークシート。 プライマーミックス(10x)は、 表1 に記載されているプライマーのストック溶液を用いて 表2に従って調製される。

4. ランプラン

注:LAMPの実行中、蛍光測定値はFAMチャンネルを使用して取得されます。ピークまでの時間値(Tmax;min)は、蛍光比が増幅速度曲線の最大値に達した時点の計測器によって自動的に決定されます。Tm (°C) は、最終的な増幅された製品の溶融/アニーリング温度です。

  1. 画面 右上の実行 アイコンをクリックし、チューブストリップを含むブロックを選択してLAMPの実行を開始します。
  2. 必要に応じて、反応が進行中に、[ 温度]、[ 増幅]、[ アニール ]の各タブをタップして、LAMP の実行中にさまざまなパラメータの動的な変化を確認します。
  3. 実行が完了したら、[ 増幅 ]タブと [アニール ]タブをタップして完全な増幅およびアニール曲線を表示し、[ 結果 ]タブをタップして結果を表示します。
  4. 必要に応じて、記録保持のために、「計測器シリアルnumber_run番号」の形式を使用して、画面の左上にある実行番号を記録します。

5. LAMP結果の解釈

注:LAMPの結果は、LAMPインストルメントパネルで直接表示したり、LAMPソフトウェア(材料表)を使用して表示することができます。

  1. インストルメントパネルでLAMPの結果を解釈するには、次の手順に従います。
    1. ホーム画面の左下にある フォルダ アイコンをタップし、[ ログ ]を選択して、目的のLAMPランをロードするファイルの場所に移動します。
      注: LAMP の実行は、年から始まる日付で整理されています。
    2. 各実行に関連する 5 つのタブを観察します: プロファイル、 温度、 増幅、 アニール、および 結果。
      注: プロファイル タブと 温度 タブは、LAMP の反応が進行するにつれて、サンプルウェル内でそれぞれプログラムされた温度と実際の温度を示します。 増幅 および アニール タブは、それぞれ、増幅およびアニール相の間に蛍光測定値と蛍光変化を示す。 結果 タブには、LAMP 結果の表形式ビューが表示されます。
    3. [結果]タブをタップして、各ウェルのLAMP結果を確認します。
      注:3つの列があります(まあ、増幅、およびアニール)。「増幅」列は、各サンプルのピークまでの時間値(T max;min:sec)を示し、「アニール」列は、そのウェル内の増幅された製品の融解/アニール温度(T m;°C)を示しています。
    4. LAMP の結果を解釈し、最終的な LAMP 結果を次のように報告します。
      1. 最初にコントロールウェルを調べます。NTCウェルはブランクのTmaxを持つ必要があり、Tmはブランク(両方のLAMP計測器モデル)または<83°C(2つのブロックを持つLAMPインストルメントモデルの場合のみ)のいずれかです。正のコントロールは、T maxが 5 ~ 10 分、Tmが 90 °C 前後である必要があります。
      2. サンプルウェルを調べます。正しい T m (約 90 °C) とTmax (5 ~30 min) を持つサンプルはすべて、サルモネラ菌の陽性と見なされます。
      3. 重複実行の結果に基づいて、最終的な LAMP 結果をレポートします。重複実行の結果が一貫している場合は、最終的な LAMP 結果を報告できます。重複する実行に矛盾がある場合は、両方の実行を個別に繰り返します。結果がまだ矛盾している場合、サンプルは サルモネラ菌 の推定陽性とみなされるべきであり、培養確認を行う必要があります。
  2. ソフトウェアを使用して LAMP の結果を解釈するには、次の手順を実行します。
    1. 左側のパネルの [コンピュータ] アイコンをクリックし、目的のLAMPランをロードするファイルの場所に移動します。
      メモ:ソフトウェアがインストールされているコンピュータは、LAMPの結果を分析するためにLAMP機器に接続する必要はありません、すなわち、リモートアクセスが利用可能です。LAMP の実行は日付別に編成されています。
    2. 各実行に関連する 7 つのタブを観察します: プロファイル、 温度、 増幅、 増幅速度、 アニール、 アニール誘導体、および 結果。
      注: 計器パネルビューと同様に、 プロファイル タブと 温度 タブは、LAMP の反応が進行するにつれて、サンプルウェル内でそれぞれプログラムされた温度と実際の温度を示します。 増幅/増幅率 および アニール/アニール誘導性 タブは、それぞれ、増幅およびアニール相の間に蛍光測定値または蛍光変化を示す。[ 結果] タブには、LAMP の結果が表示され、計器パネルビューとは若干異なります。
    3. [ 増幅率 ] タブをタップすると、時間ごとの蛍光比のグラフィック表示が表示されます。画面右上の 設定 アイコンをクリックし、「ピーク検出のしきい値比」を0.020から0.010に調整します。
      注: すべての有効なピークが識別され、ソフトウェアを使用して得られた結果が計器パネルに表示されるものと一致するように調整する必要があります。
    4. 結果タブをタップして、各ウェルのLAMP結果を確認します。
      注:4つの列(グラフ名、ウェル番号、ウェル名、ピーク値)があります。「ピーク値」列の上部には、各サンプル(「ウェルネーム」)の「AmpTime」(T max;min:sec)が表示され、下部には、その増幅された製品の「アニール微分」(T m;°C)が表示されます。
    5. LAMP ソフトウェアの設定により T M < 83 °C の結果が排除されるので、インストルメントパネルを使用する場合と同様の手順に従ってLAMP結果を解釈し、最終 LAMP 結果を報告します。同様に、正しいTm (約 90 °C) とTmax (5 ~30 min) を持つサンプルはすべて、サルモネラ菌では正と見なされます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図 2と図 3は、両方のプラットフォームに表示される代表的な LAMP グラフ/テーブルを示しています。このLAMPランでは、サンプルS1〜S6は、1.1 x 106 CFUから11 CFUまでのS.エンテラビカ・インファンティスATCC 51741の10倍の連続希釈液である。陽性対照は、1回の反応で1.7 x 104 CFUでS.エンテロケロバーティフィムリウムATCC 19585(LT2)であり、NTCは分子グレードの水である。

図 2Eおよび図 3Gに示すように、NTC と PC の両方のウェルが有効なコントロールです。NTCウェルはブランクT最大、Tmはランプ計器パネルの<83°C、LAMPソフトウェアではブランクであり、否定的な結果を示唆している。PCウェルは、両方のプラットフォームで7分45秒のTマックスとTmの~90°Cを有し、肯定的な結果を示唆している。サンプルS1〜S6は、TMaxを6分30秒~15秒の間で有し、すべてサルモネラ陽性である。

同じサンプルセットの重複実行の後、これらのサンプルに対して最終的なLAMP結果が報告されます。この代表的なLAMPの実行は、LAMPがサンプル中の濃度の広い範囲で サルモネラ菌 を正常に検出することを示しています。

figure-results-1
図2:LAMPインストルメントパネルに表示されるLAMPの代表的な結果(A)プロファイルタブには、プログラムされた温度プロファイルが表示されます。(B)温度タブは、LAMP 反応が進行するにつれてサンプルウェル内の実際の温度を示します。(C) [増幅]タブは、LAMP増幅中の蛍光測定値を示します。(D)アニールタブは、アニール期の蛍光(誘導体)の変化を示す。(E)結果タブには、LAMP 結果の表形式ビューが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図3:LAMPソフトウェアで見たLAMPの代表的な結果(A)プロファイルタブには、プログラムされた温度プロファイルが表示されます。(B)温度タブは、LAMP 反応が進行するにつれてサンプルウェル内の実際の温度を示します。(C) [増幅]タブは、LAMP増幅中の蛍光測定値を示します。(D) [増幅率]タブには、LAMP増幅中の蛍光(蛍光比)の変化が表示されます。(E)アニールタブは、アニール期の蛍光測定値を示す。(F)アニール誘導体タブは、アニール期における蛍光(誘導体)の変化を示す。(G)結果タブには、LAMP 結果の表形式ビューが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、動物性食品および純粋な培養物におけるサルモネラ菌のスクリーニングと確認のための、シンプルで迅速かつ特異的で敏感なLAMP法を紹介しました。4つの主要試薬を含む等温マスターミックスの利便性と、すぐに使用できる社内で準備されたプライマーミックスにより、LAMP反応を組み立てるには、わずかなピペット化ステップしか必要としません(図1)。増幅およびアニール相を含む合計実行時間は38分未満である(図2A、Bおよび図3A,B)。陽性の結果はリアルタイム蛍光(図2Cおよび図3C,D)を介して監視され、早ければ5分26分に検出することができる。正しいTm(約90°C)のサンプルのみが陽性として報告されるため、アニール相はLAMP特異性の追加確認として機能します(図2D、E、図3E-G)。純粋な培養における1サルモネラ細胞の感受性および<動物性食品中の1 CFU/25 gは、以前26個報告されている。

LAMPは非常に効果的で大量のDNA1を生成するため、LAMPマスターミックスの準備とDNAテンプレートの追加、エアロゾルの発生の回避、フィルターピペットチップの使用、手袋の交換、増幅後のLAMP反応チューブの開封を控えるなど、クロスコンタミネーションを防ぐために最善の実験室慣行が使用されることが重要です。

このサルモネラランプ法の特異性は、以前に300種の細菌株(247サルモネラ菌185種のサルモネラ菌および53非サルモネラ菌)を用いて試験し、100%特異的な26であることが実証された。特に、Tmaxの有意差は、2つのサルモネラ種、S.エンテラとサルモネラボンゴリ、およびS.腸内亜種の間、特にアリゾナ(IIIa)26の間で有意な差が認められた。それにもかかわらず、これらはLAMPの結果を解釈するための規則に従って有効な肯定的な結果であった。14人のアナリスト19人が関与したドライドッグフードの多実験室共同研究では、LAMPランが重複して一貫性のない結果を有するサンプルが時折観察された。これらは通常、遅延陽性結果を有するサンプルを含む(T最大>15分)。両方の実行を個別に繰り返す場合は、通常、問題を解決しました。よりまれに、我々は正しいTmを有するが、または不規則なT最大値(<5分)を有するサンプルを観察した。これは通常、反応管内の気泡によって引き起こされた。

LAMP法の開発、評価、事前共同研究、および多実験室検証のライフサイクルを通じて、我々は、様々な動物性食品または食品マトリックスおよび培養メディア4、19、22、23、24における阻害剤に対するLAMPの高い耐性を観察し、この方法の堅牢性を強調し、世界規模での他の多くの研究を共同研究した。これはPCRまたはリアルタイムPCRに比べて優れていますが、通常、負の結果がマトリックス阻害によるものではないことを保証するために内部増幅制御が必要です。さらに、LAMPは、研究の大半でPCRまたはリアルタイムPCRと比較して同様の(または優れた)特異性と感度を実証しました 8.LAMP試薬のコストは、反応ごとに約$ 1です。このプロトコルで使用されるLAMPの器械は小さく、低い維持および携帯用である。それらは蛍光測定によってターゲット検出を採用するあらゆる等温増幅方法を扱うことができる、LAMP含まれている。LAMPソフトウェアを使用すると、包括的なレポートを複数の形式(pdf、テキスト、画像)で生成できます。

メソッドの検証は、ルーチンで使用するために新しいメソッドを採用する前に重要なステップです。ここで報告されたLAMPプロトコルが、マルチラボ検証19を正常に完了したことは注目に値します。このLAMPプロトコルが米国FDAのBAM第5章サルモネラ27に最近組み込まれているので、動物性食品の迅速なスクリーニング方法として、そしてすべての食品カテゴリーからの推定サルモネラ分離物の信頼できる確認方法として、この方法ははるかに広い使用を得ることが期待される。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。この原稿に記載されている見解は著者のものであり、必ずしも保健福祉省、米国食品医薬品局、または米国政府の公式政策を反映しているわけではありません。商業用資材、設備、またはプロセスへの言及は、食品医薬品局による承認、承認、または勧告を構成するものではありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、FDAの微生物学的方法検証小委員会(MMVS)および細菌学的分析マニュアル(BAM)評議会のメンバーに、 サルモネラ LAMP法検証研究を批判的に見直してくれたことに感謝する。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
脳心点滴(BHI)ブロスBD診断システム、スパークス、MD299070サルモネラ菌の培養に使用される液体成長培地。
緩衝ペプトン水(BPW)BD診断システム、スパークス、MD218105動物性食品サンプルからサルモネラ菌を回収するためのプリエンリッチメント培地。
DNA AWAYThermo Fisher Scientific, Waltham, MA7010実験台、ガラス器具、プラスチック器具から不要なDNAとDNaseを除去します。
Genie ExplorerソフトウェアOptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdomバージョン 2.0.6.3LAMPランやデータ分析を含むGenie機器の遠隔操作をサポートします。
Genie IIまたはGenie III(LAMP機器)OptiGene Ltd.、ウェストサセックス、イギリスGEN2-02またはGEN3-02最大100°Cの温度制御が可能な小型機器。C と ±0.1 °;C精度とFAMチャンネルによる同時蛍光検出。Genie IIには2つのブロック(AとB)があり、各ブロックに8つのサンプルがあります。Genie IIIには、8つのサンプルを収容する単一のブロックがあります。
ジーニーストリップOptiGene Ltd.、ウェストサセックス、イギリスOP-0008型ロックキャップと10〜150μlの作業容積を備えた8ウェルマイクロチューブストリップ。
GenieストリップホルダーOptiGene Ltd.、ウェストサセックス、イギリスGBLOCKLAMP反応を設定するときにGenieストリップを保持するために使用されるアルミニウムホルダーは、クールブロックとしても使用できます。
塩酸(HCl)溶液、1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASA48-500BPWを添加した後、一晩濃縮する前に動物性食品サンプルのpHを調整します。
ヒートブロックThermo Fisher Scientific, Waltham, MA88-860-022DNA抽出のためにサンプルを100 ± 1°Cで加熱します。
インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ3960スタンダードラボ用インキュベーター。
ISO-001 等温マスターミックスOptiGene Ltd., West Sussex, United KingdomISO-001Geobacillus spp.由来の鎖置換GspSSD DNAポリメラーゼ大断片、耐熱性無機ピロホスファターゼ、反応バッファー、MgSO4、dNTPs、および二本鎖DNA結合色素(FAM検出チャネル)を含む、LAMP反応の組み立てを簡素化するために最適化されたマスターミックスです。
イソプロパノールサーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州A416作業面を消毒します。
LAMPプライマーIntegrated DNA Technologies Inc.、アイオワ州コーラルビル表1に詳細な情報を含むカスタムLAMPプライマー。
微量遠心機Eppendorf North America, Hauppauge, NY22620207MiniSpin plus personal microcentrifuge.
マイクロ遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ05-408-129標準的なマイクロ遠心チューブ。
分子グレードの水サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツAM9938プライマーストック、プライマーミックス、LAMP反応ミックスの製造に使用されます。
水酸化ナトリウム(NaOH)溶液、1 NThermo Fisher Scientific、Waltham、MASS266-1BPWを添加した後、一晩濃縮する前に動物性食品サンプルのpHを調整します。
非選択的寒天培地(血液寒天培地、栄養寒天培地、トリプチカーゼ大豆寒天など)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAR01202サルモネラ菌の培養に使用される固形増殖培地。
ペプトン水BD診断システム、スパークス、MD218071一晩でサルモネラ菌培養物を希釈して、ポジティブコントロールDNAを作ります。
ピペットとチップメトラー・トレド・レイニンLLC、オークランドCAピペットライトLTSシリーズ標準的なラボ用ピペットとチップ。
PrepMan Ultraサンプル調製試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ4318930LAMP反応で使用するDNAテンプレートの迅速な調製に使用されるシンプルなキットです。
サルモネラ菌参照株LT2ATCC、マナッサス、VA700720サルモネラ菌参照株は、ポジティブコントロールとして使用されます。
トリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)BD診断システム、スパークス、MD211768サルモネラ菌の栽培に使用される液体成長培地。
ボルテックスミキサーScientific Industries, Inc., Bohemia, NYSI-0236標準的な実験室用ボルテックスミキサー。
Whirl-pakフィルターバッグNascoサンプリングブランド、フォートアトキンソン、ウィスコンシンB01318preenrichmentのための動物性食品サンプルを保持するためのフィルターバッグ。
一体州 州 州 州

参考文献

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