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方法論記事

トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方

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DOI:

10.3791/61259

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2020年8月1日

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

この記事について

サマリー

読み出しとしてCa2+の標高に基づく前方遺伝的スクリーンは、植物のカルシウム依存性シグナル伝達経路に関与する遺伝的成分の同定につながる。

要約

前方の遺伝的スクリーンは、いくつかの生物学的経路に関与する遺伝的構成要素の公平な同定において重要なツールであった。画面の基礎は、目的の表現型でスクリーニングすることができる変異体集団を生成することです。EMS(エチルメタンスルホン酸)は、古典的な前方遺伝子スクリーンでランダムな突然変異を誘導し、任意のプロセスに関与する複数の遺伝子を同定するために一般的に使用されるアルキル化剤である。細胞構造カルシウム(Ca2+)上昇は、ストレス知覚時に活性化される重要な初期シグナル伝達経路である。しかし、Ca2+の受容体、チャネル、ポンプ、トランスポーターのアイデンティティは、多くの研究システムにおいて依然として不可解です。Aequorinは、エーコレアビクトリアから分離され、シロイヌナズナで安定して発現する細胞カルシウムレポータータンパク質です。これを利用して、我々はEMS-変異原性のエクオリントランスジェニックを形成する前方遺伝子スクリーンを設計した。変異植物から種子を採取し(M1)、目的とする表現型のスクリーニングを分離(M2)集団で行った。96ウェルハイスループットCa2+測定プロトコルを使用して、様々なカルシウム応答を有し、リアルタイムで測定されるいくつかの新しい変異体を同定することができる。目的の表現型を有する変異体は、ホモ接合変異植物集団が得られるまで救出され、伝播される。このプロトコルは、Ca2+レポーターのバックグラウンドで遺伝的画面を転送するための方法を提供し、新しいCa2+規制対象を同定する。

概要

生物または非生物的刺激の知覚時の細胞細胞分解性カルシウム(Ca2+)濃度の変化は、多くのシグナル伝達経路1、2、3、42,を活性化する十分に1研究された早期シグナル伝達事象である。3,4その基底安静状態の細胞は、細胞質および隔離剤の細胞質2+濃度を、種々の細胞内小器官および細胞外アポプラストにおいてより低いCa2+濃度を維持し、急なCa2+勾配5,66に至る。5シグナル知覚の際に、細胞外および/または細胞内源からのCa2+の流入により、Ca2+レベルが細胞質ゾル内で上昇し、刺激特異的なカルシウムシグネチャ77、8、98,9を生成する。サイトゾル内のCa2+上昇は多くの刺激によって活性化されるが、特異性はCa2+を放出する別個の店舗によって維持され、ユニークなCa2+シグネチャと適切なセンサータンパク質10,11,11である。

アルキル化剤の使用、変異生成のためのエチルメタンスルホン酸塩(EMS)は、プロセスに関与する複数の独立した遺伝子を同定するための古典的な前方遺伝子スクリーンの強力なツールです。EMSは、主にCからT、GをAに誘導する化学変異原であり、ゲノム全体にランダムに移行し、ゲノムの125kbごとに1bpの変化を生じる。EMS変異生成は、ゲノム12当たり挿入/欠失(InDel)または一塩基多型(SNP)のいずれかの単一塩基対の変化を誘導する。EMS誘導突然変異は、1/300から1/30000の変異頻度を有する複数点突然変異である。これにより、所定の遺伝子に変異を見つけるために必要なM1植物の数が減少します。2000-3000のM1シード集団範囲は、典型的には、シロイヌナズナ13、14,14で関心のある変異を得るために使用される。

エケオリントランスジェニックは、シロイヌナズミシコロンビア-0(Col-0)の植物植物であり、p35S-アポエクオリン(pMAQ2)をサイトゾル15に発現する。Aequorinは、アポタンパク質とルシフェリン分子、コエンテラジンからなる補綴基で構成されるCa2+結合タンパク質である。Ca2+と3つのCa2+結合EF-手部位を有するエクオリンへの結合により、コエンテラジンが酸化され、サイクチ化されてジオキセタノン中間体を得て、続いて二酸化炭素および単一励起したコエレンタミド16の放出を伴うタンパク質の立体構造変化が生じる。生成されたコエンテラミドは、光計17で検出できる青色光(λ max,470 nm)を発光する。max非常に高速なCa2+の標高は、このようにリアルタイムで測定することができ、迅速な前方の遺伝的スクリーンのために利用されます。このプロトコルは、カルシウム応答の特異性を使用して、Ca2+署名に関与する新しい主要プレーヤーを特定することを目的としています。このタスクを達成するために、トランスジェニック・エクポリンでEMS変異生成を使用し、変更されたCa2+シグナル伝達に関連するSNPを同定する。このプロトコルは、刺激付加時にCa2+の標高を示さないか、または減少させた変異体を識別する。これらの変異体は、次いで、Ca2+応答の原因となる遺伝子を同定するためにマッピングすることができる。この方法は、Ca2+の標高をもたらす植物の液体刺激の任意の種類に適用されます。Ca2+上昇は植物防御シグナル経路における最初の応答の1つであるため、上流応答成分の同定は、弾力性のある植物を開発するための遺伝子工学の候補を提供することができる。

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プロトコル

1. EMS変異誘発と単一血統系種子コレクション(1-3ヶ月)

  1. EMS変異発生に対する150mgの種子(約7500mg)のエクオリン(M0種子)の重量を量る。コントロールとして使用する種子の別の150mgの重量を量る。
  2. 種子を50 mLチューブに移し、0.2%EMS(v/v)(注意)の25 mL(治療用)または25mLのオートクレーブ水(コントロール用)を加えます。
    注意:エチルメタンスルホン酸は、植物材料を変異させる化学薬品です。
  3. パラフィルムでチューブを密封し、アルミホイルで包みます。チューブエンドオーバーエンドを室温で18時間回転させます。
  4. 種子が落ち着くことを許可します。EMS溶液を慎重に取り除き、同量の1 M NaOHを含む廃棄物容器に廃棄します(NaOHはEMSを安全に廃棄するのに役立ちます)。使用済みプラスチック製品を1 M NaOH溶液に廃棄します。
    注:24時間後、危険物の実験室の慣行に従って廃棄を処分する。
  5. 40mLのオートクレーブ水で完全に変異原性種子を8回洗浄してください。前述のようにNaOH廃棄物容器に含まれるEMSを廃棄します。
  6. 最後の洗浄のために、100 mMナトリウムチオ硫酸ナトリウムの40 mLを加え、EMSの痕跡を取り除くために3回洗い流す。
  7. 40 mLのオートクレーブ水に種子を浸し、約1時間浸漬して、種からEMSを拡散し、完全に乾燥するまで濾紙に入れます。
  8. 種子をマイクロ遠心チューブに移し、40mLのオートクレーブ水で4〜4日間の種子を層化します。これは、種子休眠を破るのに役立ち、均質な成長を保証します。
  9. 変異原性種子(M0)と対照種子の両方を土壌(土壌組成:農地:土壌、1:1)に移し、16時間光/8時間の暗い光周期、150 μmol∙m-2∙s-1および〜70%の相対湿度−1 の光強度を有する成長室に移します。−2
  10. 突然変異誘発が成功したかどうかを判断するには、発芽速度の低下と苗の成長、およびクロロフィルセター18(図1A)を探す。変異原性植物を対照植物と比較して、これらの生理学的および発達上の違いを特定する。
    注:M1植物から種子を収穫するために異なる方法を使用することができます。このプロトコルでは、単一の血統ベースのシード収集方法を用いた。各M1プラントには、A1からA3500までの一意の番号が与えられます。
  11. 個別に番号付けされたプラントを個別のプラントラインとして維持する (図 1B)。
  12. 成熟すると、これらの個々の変異植物から種子を収穫し、個々のM1ラインとして保存する(図2)。単一の血統ベースの種子コレクションから、我々は3500 M1ラインがスクリーニングされた約5000 M1ラインを得た。

2. 変異体を選択するハイスループットスクリーニング(8ヶ月)

  1. 選択した刺激に対するCa2+応答に基づいて新規変異体を同定する。ここでは、例としてH2O2を用いた。
  2. 変異体を識別するために、M2世代をスクリーニングする。劣性変異体はEMS突然変異誘発14の際にM2生成において1/8周波数で分離するので、8-12M2-分離植物のスクリーニングは1つのM1ラインをカバーし、同種劣性突然変異体を同定する(12種苗を使用すると突然変異体を見つける確率が高くなる)。各独立したM1ラインから、H2O2に対するCa2+応答に対して212M2苗を試験します2(M1ラインあたり12M2苗)。2
  3. 高スループットの種子滅菌および水耕植物成長プロトコル19を使用する。24ウェル組織培養プレートの個々の井戸にM1ラインあたりほぼ12-15 M 2シードを入れ、ガスボンネットの4時間乾燥機に塩素ガス(次亜塩素酸12%の40mL、塩酸、3:1、v/v)を使用して殺菌します。手順の後、デシケータを開き、塩素ガスが蒸発するために一晩放置します。
  4. 滅菌後、プレートを外に持ち出し、液体1/2MS培地(寒天なしの半強度MS)を個々の井戸に加えます。パラフィルムでプレートを密封し、4°Cで2〜4日間種子を層状にし、70%の相対湿度で20〜22°Cで10時間光/14時間暗光周期で成長室に種子を移動させます。
  5. 苗木が8-12日になったら、各ラインから12 M2の苗を96ウェルのルミノメータープレートに個別に配置します。H2O2に対するCa2+応答を測定するには、ルミノメータープレートリーダーを使用してください。
  6. 苗の移入後、暗い/低照度の領域の個々の井戸に5-10 μMのコエレントラジン溶液(メタノールの5 mMの原料から自動洗浄水で希釈する)の150 μLを加え、21°Cの暗闇の中で8時間保存します。
    注:コエレントラジンは、アポエクオリンに結合し、機能的なエクオリンに再構成する義足グループです。コエレントラジンは光に敏感であり、したがって、光から保護された暗い色のボトルに保存されています。
  7. 翌日、10mMH2O2を刺激として2用いて2変異画面を行い、その後のCa2+応答を測定する。
  8. 24個のウェルを同時に測定するには、1分間の背景を測定する自動運動プログラムを作成し、刺激付加(40 μL)と10分間の測定を行い、続いて1〜2分間の全エケオリン放電(2 M CaCl2 in 150 μL 20%エタノール)を作成します。
    注:測定されたCa2+を定量化し、機能的なエクオリンのための追加制御として、総エクオリンの終末放電が必要です。最後の排出は1-2分の短い走行であり、重大な植物死を引き起こさない。あるいは、排出工程後に植物が死んだ場合は、特定のM1ラインを再スクリーニングし、排出することなく救助する。このような変異体は、排出工程を用いてM3およびM4世代で確認することができる。
  9. 測定ポイントあたり 300 ms の統合時間で 7 秒間隔の各行を測定する 24 ウェル形式のスキャン方式を使用します。変異体の比較と評価のために、各行の制御として野生型の苗を使用します。
    注:M2の苗を含む単一の96の井戸の版は8つの個々のM1ライン(8 M1 *12=96 M2)をカバーし、2.5時間でスクリーニングすることができ、毎日32 M1ラインは、月あたり640 M1植物をスクリーニングされる。植物の準備が整った後の全体のスクリーニング手順は約8ヶ月かかります。
  10. H2O2によるCa2+応答の損失または低下に基づいて変異2体を同定する。抗生物質ベースの洗浄プロセスを通じて選択された突然変異体を救出する。25 mg/L セフォタキシ液で苗を2回洗い、1/2 MS寒天で25 mg/Lセフォタキシムを含む培地を救助するために移します。
  11. 10時間光/14時間暗い光周期でプレートを成長させ、変異植物を得る。セフォタキシム洗浄は、苗上の有害な微生物を除去するのに役立ちます。再構成後の苗は密閉されずに保たれるため、無菌状態に戻す際の汚染を最小限に抑えます。
  12. 変異植物を土壌に移し、ホモ接合M3集団を得る。

3. データ分析と変異体の同定(1~3ヶ月)

注: 上記の方法で提供される測定値は、相対光単位(RLU)で提供されます。

  1. [Ca2+]cyt濃度を計算する場合は、次の濃度式20を使用します。
    pCa = 0.332588(-ログ(L/Lmax))+ 5.5593
    ルミネセンス数 () および残りの合計カウント (最大)
  2. 取得した pCa 値を μM の [Ca2+]cyt値に変換するには、106を掛けます。次に、Ca2+応答に対する推定H2O2変異体を同定するためのエクオリン(トランスジェニックCol-02エポリン)制御2+ に対してグラフィカルにプロットする。
  3. 救出されたH2O2アプリケーションに対する応答の損失または減少を2示すレスキュー苗。
  4. 成熟時に、救出された変異体から種子を収穫し、M3苗のH2O2への応答のために再スクリーニングする。12M3の3苗木すべてが母植物と同様のCa2+応答を示す場合、母集団はホモ接合M3突然変異集団であると考える。全12種の苗がそのような応答を示さない場合は、それらをM4世代に持って行き、ホモ接合集団を得るために再スクリーンする。
  5. ホモ接合植物ラインが得られたら、次世代シーケンシングを用いて変性表現型に至る遺伝子を同定する。

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結果

EMS集団を、H2O2誘導Ca2+上昇2+についてスクリーニングした。先に述べたように、各M1ラインから12個のM2苗をスクリーニングした。図3では、このようなM1線が1本ずつプロットされ、各パネルに12個のM2苗を示す。野生型のエクオリンは、変異型応答を比較および評価するための制御として使用されます。劣性変異体は、1:7の比で分離する(変異体:非突然変異体)。M1ライン当たり12個の苗をスクリーニングする場合、1行あたり1または2個の突然変異体を同定することができる。12 M2の苗から2つの推定変異体を同定した(図3)。これらの変異体は、さらにM3およびM4に取られ、ホモ接合集団が生成される。ホモ接合変異体は、さらに因果遺伝子を同定するためにマッピングされる。

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ディスカッション

EMS変異誘発は、集団の突然変異を生成するための強力なツールです。EMSを用いた古典的なフォワード遺伝子スクリーンは、2つの主な理由で新しい遺伝子を同定するための効果的なツールとなっています:第一に、遺伝子同一性に関する事前の仮定を必要とせず、第二に、彼らはバイアスを導入しません。EMS、T-DNA挿入、放射線などのスクリーニング集団を生成する方法はいくつかあります。すべての方法のうち、EMSベースの突然変異誘発は、他の方法よりもいくつかの利点を有する。第1に、現在のプロトコル21,22に記載されているEMSへの曝露により変異体集団を生成しやすくなる22。第2に、十分に多くの変異種子集団を生成することができ、これは1つ以上の刺激のために複数のスクリーンに使用することができる。第3に、ミスセンス変異により生じる必須遺伝子の弱い対立遺伝子を同定することができる。第4に、完全機能喪失、部分機能喪失、機能の変化、構成遺伝子機能を含むEMSスクリーンを用いて遺伝子機能効果の配列を同定することができる。それは他の突然変異誘発法

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開示事項

著者の誰も宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

植物ゲノム研究所 - 植物の成長のためのフィトトロン施設、ビデオ撮影のためのボンベイロケール、および電子資源へのアクセスを提供するためのバイオテクノロジー省eLibraryコンソーシアムに感謝します。この研究は、国立植物ゲノム研究所コアグラント、マックスプランクゲセルシャフト-インドパートナーグループプログラムを通じて、インドのバイオテクノロジー省によって支援されました。CSIRジュニア研究フェローシップ(D.MおよびS.M)およびバイオテクノロジー・ジュニア研究フェローシップ(R.P.へ)を含む。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル組織培養プレートJetbiofil11024苗の成長用
、96ウェル、白いクリニプレート、Thermo Scientific9502887、ルミノメーター測定用
、Aequorin
AgropetLab Chem India植物成長用
塩化カルシウムFisher Scientific12135排出用溶液
セレンテラジンPJK55779-48-1イクオリン
エチルメタンスルホン酸シグマ アルドリッチM0880-5G種子変異誘発用
エタノール 分析試薬1170排出液用
酸メルクライフサイエンス1.93001.0521滅菌液
過酸化水素カルシウム上昇の刺激としてのフィッシャーサイエンティフィック15465
ミノスカ上昇サーモサイエンティフィック5300172イクオリン発光測定
MESバッファーヒメディアRM1128-100G植物成長
ムラシゲとスクーグメディアメディアPT021-25L植物成長
酸化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィック27805中和用 EMS
次亜塩素酸ナトリウムメルクライフサイエンス1.93607.5021滅菌溶液
オ硫酸ナトリウムフィッシャーサイエンティフィック28005ステップ1.6
ソイルライトラボ 化学インド植物成長用
スクエアポットラボ成長のための化学インド
ショ糖シグマアルドリッチS0389苗
レスキューのためのタクシーアルケム7180720
、、、、 塩ルヒ水 チ 植物植物成長

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