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方法論記事

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

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DOI：

10.3791/61270

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2020年5月20日

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

この記事について

訂正のお知らせ

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サマリー

癌細胞の静脈内注射は転移研究でよく用いられるが、転移性腫瘍の負担は分析が難しい。本明細書において、転移の尾静脈注入モデルを示し、生じる転移性肺腫瘍の負担を分析する新しいアプローチを含む。

要約

ほとんどのがん患者の罹患率と死亡率の主な原因である転移は、マウスの前臨床的にモデル化するのが難しい場合があります。自然転移モデルはごくわずかです。したがって、適切な細胞株の尾静脈注入を伴う実験転移モデルは転移研究の主力である。癌細胞が横尾静脈に注入されるとき、肺は植民地化の彼らの好ましい部位である。この技術の潜在的な制限は、転移性肺腫瘍の負担の正確な定量化である。一部の研究者は、事前に定義されたサイズのマクロ転移を数える、または/または組織の切除後の微小転移を含むが、他の研究者は正常な組織領域に対する転移性病変の領域を決定する。これらの定量方法はいずれも転移負担が高い場合に非常に困難な場合があります。本明細書において、画像解析ソフトを用いて転移性腫瘍負担を定量化するための高度な方法を用いて、肺転移の静脈内注射モデルを示す。このプロセスにより、平均転移サイズ、転移の総数、総転移領域など、複数のエンドポイントパラメータを調査して包括的な分析を行うことができます。さらに、この方法は、正確性を確保するために、米国獣医病理学者会(SEK)によって認定された獣医病理学者委員会によって見直されました。

概要

非常に複雑で非効率的なプロセス1であるにもかかわらず、転移は癌患者の罹患率と死亡率に大きく寄与する2である。実際、ほとんどの癌関連死は、疾患の転移性広がりに起因する3,4である。腫瘍細胞が正常に転移するためには、一次部位から切り離し、隣接する間質を通って侵入し、血液循環またはリンパ管に浸潤し、二次部位の毛細血管床に移動し、二次組織に飛び出し、増殖または成長して転移病変を形成する必要がある。マウスモデルの使用は、転移性播種および成長を担う分子機構の理解を深める上で重要であった6,7。ここでは、遺伝子組み換えマウスモデルと移植方法の両方がしばしば使用される乳がん転移に焦点を当てています。

遺伝子組み換え乳腺腫瘍モデルは、MMTV-LTR(マウス乳腺腫瘍ウイルス長末反復)およびWAP(乳清酸性タンパク質)を含む乳腺特異的プロモーターを利用して、乳腺上皮8の遺伝子導入の発現を促進する。ポリオーマ中期T抗原(PyMT)、ErbB2/Neu、c-Myc、Wnt-1、シミアンウイルス40(SV40)を含む腫瘍遺伝子は、この方法で発現されており、これらの遺伝モデルは原発性腫瘍の開始および進行を研究するのに有用であるが、遠くの器官に容易に転移する。さらに、これらの遺伝的マウスモデルは、多くの場合、自発的または実験的な転移モデルよりも時間とコストが非常に高いです。転移を研究する最も遺伝子組み換え乳腺腫瘍モデルの限界を考えると、移植技術はこの複雑なプロセスを研究する魅力的な方法となっています。これには、適切な細胞株の正交性、尾静脈、心臓内注射、頭蓋内注射が含まれる。

いくつかの乳癌細胞株は、乳腺脂肪パッド14,15への交所注入後に容易に転移するが、転移性腫瘍負担の一貫性および再現性は困難であり、そのような研究の持続期間は数ヶ月のオーダーで可能である。肺転移を評価するために、特に、尾静脈への静脈内注射は、典型的には数週間のスパンで起こる転移性広がりを伴うより再現性が高く、時間効果の高い方法である。しかし、静脈内注入モデルは転移性カスケードの初期ステップをバイパスするので、これらの研究の結果を解釈する際に注意が必要である。本デモでは、乳腺腫瘍細胞の尾静脈注射と、正確かつ包括的な分析方法を示す。

研究コミュニティは乳がん転移の複雑なプロセスを理解する上で大きな進歩を遂げましたが、現在150,000人以上の女性が転移性乳癌を持っていると推定されています16。ステージIV乳癌の患者のうち、>36%の患者が肺転移17を有する。しかし、部位特異的パターンおよび転移の発生率は、分子サブタイプ18、19、20、21に基づいて変化する可能性がある。乳癌関連肺転移を有する患者は、この疾患に対する有効な治療法および新規バイオマーカーを同定する必要性を強調するわずか21ヶ月の生存期間の中央値を有する17。腫瘍細胞の静脈内注射を含む実験的転移モデルの使用は、この重要な臨床的課題に関する我々の知識を引き続き進める。デジタルイメージング病理と、このプロトコルに記載されている転移性肺腫瘍負担分析の方法と組み合わせると、尾静脈注射は乳癌転移研究にとって貴重なツールです。

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プロトコル

動物の使用は、OSU機関動物の世話と使用委員会(IACUC)承認プロトコル2007A0120-R4(PI:ジーナ・サイズモア博士)の下で大学実験動物資源(ULAR)規制に従いました。

1. 乳がん細胞の尾静脈注射

  1. 注射用細胞および注射器の調製
    1. 使用するマウスの数と細胞濃度に基づいて適切な数の細胞をプレートします。
      注: 注入される細胞の数と転移の発生に要する時間は、使用される細胞のラインによって異なっており、最適化する必要があります。本デモでは、1 x 106個のMDA-MB-231細胞を NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスに静脈内注射し、注射後24日以上で巨視的な肺病変が観察される。MVT1マウス乳腺腫瘍細胞株17に対して、3 x 106細胞が免疫に優れたFVB/Nマウスに注入され、14日22,23で多数の肺転移が観察される。
    2. 吸気培地と1x PBSで細胞プレートをすすいだ。細胞を最小量でトリプシン化し、適切な量の培地を加え、造馬計または別の好ましい方法を用いて細胞を数える。トリパンブルー(0.4%)または他の生きている/死んだ細胞色素を使用して、生存可能な細胞数を決定することができます。
    3. ペレット細胞は180xgで5分間回転する。
    4. 1回のマウスに100 μLの体積が注入されるよう、滅菌1x PBSの細胞の適切な数を再中断します。生存率を維持するために、細胞懸濁液を氷の上に保管してください。
    5. 注入する前に、凝集を避けるために200 μLまたは1 mLピペットで細胞を十分に再懸濁させる。28Gインシュリンシリンジで100μLを引き上げる( 材料表参照)。
    6. シリンジを垂直に保ち、シリンジをタップし、プランジャーをゆっくりと調整して、気泡を除去します。静脈への気泡の注入は、致命的な可能性がある空気/ガス塞栓症を引き起こす可能性があります。
  2. 横尾静脈注射
    注:実験的な乳癌転移アッセイの場合、注射は生後6週齢の雌マウス>に対して行われる。
    1. 尾でマウスを処理し、適切なサイズのスロットチューブ/拘束装置に動物をスライドさせます(使用する拘束装置 については、材料表 を参照)。
    2. 拘束装置のプラグ部分を挿入し、横方向の尾静脈が見えやすいような側にマウスを置きます。マウスは生殖器、後部静脈、および2つの側尾静脈に沿った腹側動脈を有する。
    3. 無菌ワイプでマウスの尾の表面をきれいにします。人差し指と親指の間の尾を非支配的な手で握り、わずかな緊張を加えます。
    4. 尾の遠位部分から始まり、ベベルが終わる静脈に平行に針を挿入します。
    5. 許可されている場合は、 慎重に 針を要約し、20〜30°の角度に曲げ。片手でアプローチまたは針のリタッピング装置を強くお勧めします。
      注:これは静脈が崩壊する可能性があるため、吸引する必要はありません。しかし、最初に置かれたときに血の小さなフラッシュが見られるかもしれません。針は適切な配置で静脈にスムーズに進みます。
    6. ゆっくりと静脈に完全なボリュームを分配します。プランジャーを押しても抵抗があってはならない。
    7. 抵抗が感じられる場合は、速やかに注射針を取り外します。必要に応じて、尾部の近位端または反対側の側面静脈に向かって移動する針(理想的には3回以下)を再挿入します。
    8. 少量の血液は、注射後に置き換えられる可能性が高い。滅菌ガーゼで穏やかな圧力をかけ、無菌ワイプで拭きます。
    9. 適切なシャープ容器に注射器を速やかに処分する。
    10. 清潔で換気の良いケージにマウスを戻し、苦痛の兆候を監視します。
    11. マウスの転移形成(呼吸困難、姿勢のハンチ、体重減少)および一般的な苦痛の徴候を、週2~3倍に監視する。転移の発生までの時間は、細胞株とマウス株に依存します。
    12. in vivo生きた動物イメージング装置を用いる場合、尾静脈注射直後の画像マウスは、細胞の正常な注入を確認し、時間「ゼロ」データを得る(インビボ生物発光イメージングに関する具体的な詳細はここに含まれていないが、Yangらららによって記載されている)。

2. 肺組織の固定と転移性肺腫瘍の負担の解析

  1. 組織病理学のための肺の構造様式を維持するための肺組織の膨張
    1. 承認された安楽死手順(例えば、チャンバー容積/分の30〜70%の変位で二酸化炭素)が続いた後、マウスの死骸をピンで解剖板に固定します。スプレーまたは70%エタノールを適用して、解剖中にマウスの毛皮を邪魔さないようにします。
      注:二酸化炭素窒息は、特に遅い流速で、期待される背景病変として肺出血を引き起こす可能性があります。
    2. 正中線切開で胸郭を開き、腹膜を通して切開を頸部/尾様に伸ばし、xyphoidプロセスをつかんで横隔膜を切り取る。
    3. 刃を鈍らせないように別のハサミのセットを使用して、胸骨の両側に沿って肋骨を切断し、慎重に肺が拡大するための余地を残す肋骨ケージを取り除きます。
    4. 下顎下唾液腺とインフラヒロイド筋肉を除去することによって気管を分離します。気管の両側にピンを置くと、針の挿入中に不要な動きを防ぐことができます。
    5. 26 G シリンジに 2~3 mL の 10% 中性緩衝ホルマリンを充填し、気管に挿入します。
    6. ゆっくりとホルマリンを注入し、肺が拡大するのを見てください(通常、ホルマリンの約1.5 mLが必要です)。
    7. ホルマリンが肺から漏れ始めたら(インフレを避ける)、鉗子で気管をつまみ、注射針を取り外し、呼吸器装置全体を取り外します。組織の追加のトリミングが後に行うことができるように、肺、心臓などをホルマリンに直接入れる。
    8. 完全な処理、埋め込み、組織の切片、および標準的な方法を使用してヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色。
  2. 転移性肺腫瘍の負担の解析
    1. H&E染色された肺のセクションを、40倍の倍率で高解像度のスライドスキャナーでスキャンします(図3)。
    2. 肺転移の定量化のための画像解析ソフトウェア(例えば、Visiopharm画像解析)に画像をインポートします。
      注: 新しいユーザーは、画像解析ソフトウェアを使用するためにオンサイトまたはオンラインのトレーニングを受けることをお勧めします。市販のウェブページからも多数のウェビナーが利用できます。
    3. ソフトウェアのアプリライブラリから、Visiopharm 10118 H&E肺転移アプリを選択します。
      注:このアプリの目的は、H&E染色されたスライドに肺転移をラベル付けし、定量化することです。10118 H&E肺転移アプリの一部として、最初の画像処理ステップは、組織検出アプリで肺組織をセグメント化します。第二の画像処理ステップは、肺組織内の転移を識別する転移検出アプリを使用しています。転移は、形状が間違っている領域、赤すぎる領域、または転移として識別するにはまばらすぎる領域と共に識別されます。
    4. 形状とスパースを定義するパラメータを調整して、代表的な画像に最適にフィットします。腫瘍転移および正常肺組織のセグメント化領域は、組織タイプごとに異なる色ラベルを使用して表示することができる。
      注: アプリが正常な肺組織から正確に転移を分離できない場合、Visiopharm Decision Forest プログラムを使用するカスタム アプリは、実験で行われたように記述する必要があります ( 図 2 および 図 3 を参照)。カスタム アルゴリズムを記述する詳細は以下のとおりです。それ以外の場合は、ステップ 2.2.9 に進みます。
    5. 所望の画像上の複数の クラス (すなわち、肺組織(非腫瘍性)、転移、赤血球、上皮、および/または白いスペースを訓練することによって動作するDecision Forestプログラムを開きます。 図2では、腫瘍転移は青色、正常組織は緑色、気管支上皮は黄色である。また、赤血球は赤と空気空間にピンク色です。
    6. プロンプトされた一連のイエスまたはノーの質問に従って、各 クラス を適切に画像に合わせて訓練します。アルゴリズムの精度は、イエス/ノーの質問の数を決定します。分析のために、カスタム アルゴリズム/アプリは 50 (範囲 0 から 100) に設定された精度で書き込まれました。
    7. アルゴリズム/App. Visiopharm は、機能と呼ばれる 1 つまたは複数のレンズを通じて各クラスを表示する精度を高めるために、シャープ、ぼかし、形状による並べ替えなどを行うフィルターを適用して、各クラスの機能を調整します。特徴は、特定の色や強度を引き出すために、クラスが画像を見る方法を変更します。
      注: カスタムアルゴリズムでは、8500 μm2 以上のメタスタは、メタスタとしてラベル付けされ、測定されます。これは、サイズの差異と転移が小さすぎて検出できない場合を示します。小さな誤った形状の領域と8500 μm2 の下の小さな転移領域は、正常な組織定量に含まれていた。
    8. アプリまたはカスタムアルゴリズムのいずれかから変更された設定を保存し、その後、全体のセットまたは一連のH&E染色組織にアルゴリズム/アプリを適用します。
    9. 最後に、 表 1 に示した出力変数を含むすべての出力変数をエクスポートします。ミクロン二乗(μm2)の面積は、組織タイプごとに定量化することができ、パーセンテージは標本の総正味組織面積(すなわち、総組織から空気空間を差し引いた)に由来する。
    10. カスタムアルゴリズムを作成する場合は、米国獣医病理学者の米国大学によって認定された獣医病理学者の理事会と協議して組織マークアップをレビューし、正確な測定を保証し、組織タイプを区別します。

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結果

尾静脈注射に標識されていない細胞を用いる場合、(1)マクロメタスターゼが観察される場合は壊死時まで肺の植民地化を確認することが困難であり、顕微鏡転移が存在する場合は(2)組織学的分析に従う。広範な転移性肺腫瘍の負担で、マウスは呼吸を働かされるであろう。他の腫瘍研究と同様に、マウスは研究期間中を通して注意深く監視されるべきである。標識された細胞の使用は、成功した尾静脈注射を確認する簡単な方法です;したがって、デモでルシメラーゼタグ付きMDA-MB-231細胞を使用する。しかし、インビボイメージングは、実験計画やその他の要因に応じて必ずしも可能または必要とは限らない。 図1Aは 、正確な注入の確認として、ルシメラーゼタグ付きMDA-MB-231細胞の尾静脈注入後2時間未満の胸腔における生物発光シグナルを示す。この実験では、胸部領域の光子数は時間の経過とともに増加し、強力な生物発光シグナルは24日目の注射後に存在する(図1BおよびC;スケールバーの変化に注意する)。壊死時には、これらのマウス...

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ディスカッション

研究者が転移の実験モデルとして腫瘍細胞の静脈内注射を使用し続ける中で、得られた転移性腫瘍の負担を分析するための標準的な慣行は欠けている。場合によっては、特定の細胞株の操作や化学化合物の使用時に転移性腫瘍の負担に有意な差が認められる。しかし、他の例では、転移性播種と成長の微妙な違いは、徹底的な病理学的分析なしに見落とされたり、誤って解釈されたりする可能性があります。この研究は、転移性肺腫瘍負担分析の包括的な方法を含めることによって、以前に発表された尾静脈注射プロトコルを進める。重要なことに、このデジタル病理解析法は、自発的転移が可能な腫瘍細胞の交所注入後の肺転移性腫瘍負荷の定量化、ならびに他の実験転移モデル(すなわち心臓内等)および患者由来異種移植片(PDX)モデルにも適用できる。獣医病理学者によるデジタル画像化およびソフトウェアアルゴリズムの開発の使用は転移性肺腫瘍の負担25を分析するためにこのアプローチの再現性、正確さおよび徹底を保障する。

以前に発表された研究または慎重な実験最適化のいずれかに基づいて細胞株、細胞濃度、およびエンド...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

代表的なデータは、国立がん研究所(K22CA218549からS.T.S.)を通じて資金提供されました。ここに報告された包括的な分析方法の開発に協力することに加えて、我々は、オハイオ州立大学総合癌センター比較病理学およびマウスフェノタイピング共有リソース(ディレクター - クリスタ・ラ・ペルル、DVM、博士号)の組織学および免疫組織化学サービス、およびアルゴリズムの開発および分析のための病理イメージングコアに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルコール準備パッドフィッシャーサイエンティフィック22-363-750注射前の尾のクリーニング用
解剖はさみフィッシャーサイエンティフィック08-951-5マウス解剖および肺組織膨張用
DMEM L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、ピルビン酸ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックMT10013CVMDA-MB-231およびMVT1細胞株の細胞培養培地ベース
Dulbeccoのリン酸緩衝塩溶液 1xFisher ScientificMT21030CV注射用腫瘍細胞の再懸濁に使用されます
エタノール (70% 溶液)OSU解剖中のマウスの毛皮を最小限に抑えるために使用されます。
無菌PBSで1%で使用し、尾静脈注射法の練習に使用します。注意して使用 - 危険な試薬
ウシ胎児血清ミリポアシグマF4135細胞培養培地添加物; DMEM鉗子で10%使用
フィッシャーサイエンティフィック10-270解剖および肺組織拡張用
FVB/NJマウスジャクソン研究所001800MVT1細胞用同系マウス系統
血球計算計 (ブライトライン)ミリポアシグマ細胞数を得るための細胞培養で使用する
インスリン注射器(28 G)静脈注射用フィッシャーサイエンティフィック14-829-1B
MDA-MB-231細胞ATCCヒト乳がん細胞株
MVT1細胞乳腺腫瘍細胞
針(26 G)フィッシャーサイエンティフィック14-826-15を膨らませるために使用されます肺の中
性緩衝ホルマリン(10%)フィッシャーサイエンティフィ245685組織固定剤として使用され、肺組織を膨らませるために使用されます。
Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウスジャクソン研究所005557OSUCCC によって維持されています ターゲット検証 共有リソース
ペニシリン ストレプトマイシン 100xサーモフィッシャー15140163細胞培養培地 添加剤
滅菌ガーゼフィッシャーサイエンティフィ出血が発生した場合にマウスの尾部に圧力を適用する
シリンジ (5 mL)フィッシャーサイエンティフィック14-955-458膨らませるために使用されます
Braintree Scientific, Inc.TV-150 STD尾静脈注射のためのマウスを拘束するために使用される
トリパンブルー (0.4 %)ThermoFisher15250061生存率を評価するために細胞培養で使用される
トリプシン-EDTA 0.25 %ThermoFisher25200-114から腫瘍細胞を剥離するために細胞培養で使用される
ためのZ359629尾(BD 329424)マウスマウスックック ためのNC9379092 マウス肺組織尾静脈拘束具を は プレート

参考文献

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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析
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