嚢胞性線維症ゼブラフィッシュ胚における シュードモナス緑膿症 感染に対抗するためのファージ療法アプリケーション

ファージ療法は、細菌感染と戦うために細菌の天敵を使用して、抗生物質に対する細菌耐性が広がり^、1,2,2となるように新たな関心を集めている。この治療法は、東ヨーロッパで何十年も使用され、CF患者における肺感染症を治癒する抗生物質に対する補完的な治療法と、現在使用されているすべての抗生物質^22,33に耐性のある細菌に感染した患者に対する可能な治療代替手段と考えることができる。抗生物質療法の利点は、バクテリオファージが感染部位で増殖するのに対し、抗生物質は代謝され、体内^44、55から排除される。実際、異なる実験室で分離された毒性のあるファージのカクテルの投与は、動物モデルにおけるシュードモナス緑膿菌感染症を、昆虫^{や哺乳類6、7、87,8}と異なるように治療するのに有効であることが証明されている。ファージ療法は、P.緑頭症および大腸菌に感染した火傷の細菌負担を無作為化臨床試験⁹で軽減できることも示した。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、最近、P.緑膿菌^10、11、マイコバクテリウム膿瘍^および11ブルカンディア・セパシア^1212、1313を含むいくつかの病原体の感染症を研究するための貴重なモデルとして浮上している。細菌を直接胚血液循環¹⁴にマイクロ注入することにより、ヒトと同様に好中球およびマクロファージ生成で進化的に保存されるゼブラフィッシュ自然免疫系によって打ち消される全身感染を確立することが容易である。さらに、生後1ヶ月の間に、ゼブラフィッシュ胚は適応免疫応答を欠き、ヒト肺感染症¹⁵における重要な防御機構である先天免疫を研究するための理想的なモデルとなる。ゼブラフィッシュは最近、CFの発症をよりよく理解し、新しい薬理学的治療法^{10、16、1716,17}を開発するための強力な遺伝モデルシステムとして登場しました。¹⁰ゼブラフィッシュのモルフォリノ注射で発生したcftrノックダウンのCFゼブラフィッシュモデルは、湿った呼吸バースト応答を提示し、好中球移動を減少させた¹⁰を呈し、cftrノックアウトは内臓位置の障害および外分泌膵臓の破壊につながり、ヒト疾患^16、17,17を反映する表現型である。最も興味深かったのは、P.緑素座細菌の負担が、マウスおよびヒト気管支上皮細胞^22,1818で得られた結果と平行する感染後8時間の対照(hpi)よりもcftr-機能喪失胚において有意に高いという発見であった。

本研究では、ゼブラフィッシュ胚の P.緑素吸入症 に対してファージ療法が有効であることを実証する。

AB株(欧州ゼブラフィッシュ資源センターEZRC)の成虫ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、国際的なガイドライン(EU指令2010/63/EU)と国のガイドライン(イタリアの法令2014年3月4^日 、n.26)に従って、科学的目的で使用される動物の保護に関して維持されています。標準的な条件は28°Cの光/10時間の暗い周期およびタンク水の温度の14時間と魚の施設で設定される。

1. ソリューションとツールの準備

1. ゼブラフィッシュ胚を成長させるためのE3胚培地用に50xストック溶液と1xの作業溶液を準備する( 表1参照)。
2. 色素沈着遮断溶液を作り、受精後24時間(24hpf)から胚色素沈着を遮断する( 表1参照)。
3. 表1に記載されているように、25xストックと1xの働くトリカン麻酔液を準備する。
   注:ストック溶液に損傷を与える可能性のある溶液の凍結と解凍を繰り返し避けるために、25xトリケーヌの2mLのアリコートを作り、-20°Cで保管してください。
4. 100 mLの蒸留_H2Oをマイクロウェーブ可能なフラスコまたはボトルに溶解することにより、胚微小注射のためのトラックを準備します。アガロースが完全に溶解するまで1〜3分間の電子レンジ。
5. ゼブラフィッシュマイクロインジェクション金型( 材料表を参照)は、ペトリ皿(90mm x 15mm)で裏返し、液体アガロースゲルを幅約10mmで流し込んで表面全体を覆います。
6. アガロースが固まったら、金型を取り外します。ペトリ皿に1x E3胚培地を充填します。4°Cで約1週間保存できます。使用前に、トリケーヌを含む新鮮なE3培地に交換してください。
   注:古い金型は、真菌や細菌の汚染を発生させる可能性があります。
7. 火で磨いた10cmのホウケイ酸毛細血管を使用してマイクロインジェクション用の針を準備し、ハンドルを締めることでマイクロピペットプーラーに固定します。次の設定でプーラーを設定します: 熱 500、速度 100、時間 150、プル 150。

2.P. 緑分 化 (PAO1) 接種製剤

1. LBブロスの5mLで^GFP+P.緑素吸い株PAO1119の1コロニーを接種し、振盪(200rpm)で37°Cで一晩成長させる。¹⁹ Table 1
2. 上記の一晩培養液をLBブロスの_{10mLでOD600=0.1} に希釈し、37°Cで_OD600=0.5 に成長させる(200rpm)。
3. 遠心分離2 mLの培養物を16,100 x g で4°Cで2分間培養し、細胞ペレットをOD₆₀₀₌₁ に再懸濁し、約1 x 10⁹ cfu/mLに相当し、生理学的溶液の1mLで( 表1参照)
4. 生理液中の細胞懸濁液を約5 x 10⁷cfu/mLに希釈し、4°Cで保存します。

3. ファージストック準備

1. P. 緑素吸 い株PAO1の1コロニーをLBスープの5mLで接種し、振盪で37°Cで一晩インキュベートする。一晩培養したOD₆₀₀₌ 0.01をLBブロスの500 mLで希釈し、OD₆₀₀ = 0.05に振るとともに37°Cで成長し、約2.5 x 10⁷ cfu/mLに相当します。
2. P.緑素吸塩の希釈培養物に、約1.25 x 10⁷ファージを加えて、感染の多重性(M.O.I.)を^10-3にする。OD₆₀₀が約0.1〜0.3に低下するまで振盪して37°Cでインキュベートする(使用するファージに応じて約3〜5時間)。
   注:PAO1株に感染するこの実験には、2つのポドビリダエ、GenBank加盟番号vB_PaeP_PYO2、MF490236、およびvB_PaeP_DEV、MF490238、および2つのミオビリダ、vB_PaeM_E215、MF490241、vB_PaeM_E217 mf490240の4つのファージが選択されました。ファージごとに以下の手順を実行します。
3. 37°Cで30分間、DNaseとRNaseの1mg/mLでリゼートをインキュベートします。 4°Cで30分間5,000xgの遠心分離機を慎重に回収し、上清(SN)を慎重に回収します。 x g0.8 μmの孔径を持つフィルターでSNをフィルターします。
4. SNに、NaClの58 g/LおよびPEG6000の105 g/Lを加える。RT 20分で撹拌して溶解し、4°Cで一晩保管してください。 ファージ沈殿のため4°Cで30x g 分間20,000xgの遠心分離機。SNを取り出し、15mLのTNバッファーにファージペレットを慎重に溶解する(表1参照)。
5. 以下の手順で説明されているように、CsCl密度勾配でファージを精製します。
   1. SW41ローター用ポリアロマー超遠心チューブで、 表1に記載の4つのCsCl溶液の2mLを層化してCsClステップ密度勾配を調製する。 4本のチューブに3.5mLのファージ懸濁液を加えます。
      注:CsClは有毒であり、それを処理し、廃棄するための適切な安全手順を採用しています。
   2. ローターにチューブを導入し、チューブのバランスが取れていることを確認します(2つの直面するチューブ間の重量差は≤0.01gでなければなりません)。
   3. 4°Cで2時間の遠心分離機、100、000 x g(SW41ローターの場合は25,000rpm) x g遠心分離後、ゆっくりとチューブを取り外し、慎重に支持体に固定します。19 G針のシリンジを使用して、通常d=1.5とd=1.4密度領域の間にある白/青白色帯を描画します。
   4. SW60ローター用の新しいポリアロマーチューブにシリンジからサスペンションを移し、d=1.4溶液を使用してチューブのバランスを正確に調整します。
   5. 懸濁液を4°Cで150,0000xg(SW60ローターの場合は38,000rpm)以上16時間遠心分離する。 x g
   6. 上記のように可視バンドを収集し(ステップ3.3.3を参照)、6,000ダカットオフと透析管にそれらを転送します。得られた可視バンド2xを500mLの水に対して20分間、そしてTNバッファの500 mLに対して一晩得た。0.22 μmの細孔フィルターでフィルターし、4 °Cで保管します。

4. ファージカクテルの準備

1. PAO1株に感染する4つのファージの混合物を作り、以前に単離し、^特徴8.混合する前に、プラークアッセイ²⁰によって各ファージストックのタンターを推定する。
2. ファージカクテルを5×10⁸ pfu/mLの全体的な力剤で組み立て、各実験の直前に同じpfu/mLで4つのファージ製剤を均等に混合することによって、正確なファージターを確保します。

5. cftrモルフォリノス微小注射用ゼブラフィッシュ胚の採取と調製

注 :cftr モルフォリノ(cftr-MO)マイクロインジェクション用の野生型ゼブラフィッシュから1〜2個の細胞胚を収集します。

1. 細菌微小注入実験の2日前に、前に説明した²¹の繁殖ペアを設定し、胚を収集する。AB株の成虫ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、欧州ゼブラフィッシュ資源センターEZRCから購入しました。
2. 翌日、プラスチックピペットで、または細かいメッシュストレーナーを使用して受精直後に胚を収集します。収集した胚をE3胚培地を含むペトリ皿に入れ、胚の発達に損傷を与える可能性のある汚染を避けるために、プラスチックピペットで破片を慎重に取り除きます。
3. 2つのモルフォリノストック溶液(1mM)を無菌水で0.25 pmol/胚ATG-MO + 0.25 pmol/胚スプライスMOの最終濃度に希釈して5μLのモルフォリノ注入溶液を調製します。胚注射を追跡するには、モルフォリノ注入溶液ミックスに0.5μLのフェノールレッドを加えます。
4. 微細なゲルローディングチップを備えた20 μLマイクロピペットを使用して、モルフォリーノミックス溶液の約5 μLでマイクロインジェクションニードルをロードします。スタンドに接続されたマイクロマニピュレータに針を固定し、実体顕微鏡の下に置きます。
   メモ:マイクロインジェクターポンプの圧力が針を押すので、溶液が針の先端に達する必要はありません。
5. 細かい滅菌ピンセットで針先を切り取って針の先端を切り取ります。顕微鏡の眼のスケールバーを使用して、落下の直径を測定します。あるいは、マイクロメートルスライドに鉱物油の滴を作成し、液滴のサイズを評価するためにオイルドロップに溶液を注入することによってマイクロインジェクション量を設定します。直径156μmのドロップを使用して、2 nLの体積を注入します。
6. 補償圧力を15hPaに調整してマイクロインジェクターを、射出時間を0.5sに、注入圧力を300~600hPaに設定し、使用する針に応じて正しい注入量を得る。
7. プラスチックピペットを使用すると、ステップ5.2から96mmの直径ペトリ皿に配置されたガラスに胚を配置します。
   注:あまりにも多くのE3培地は、胚の絨毛にマイクロインジェクション針の適切な浸透を防ぐことができます。
8. 先に説明した²²のように、卵子を針で貫通し、胚に2nLを注入する。
9. 注入した胚をE3培地でペトリ皿に入れ、28°Cのインキュベーターに入れ、翌日まで発達させる。

6. ゼブラフィッシュ胚の細菌とファージカクテルのマイクロインジェクション

注:全身感染を行うには、通常26 hpf後に開始する血液循環が必要です。

1. 26 hpf (ゼブラフィッシュの発達段階についてはキンメル²¹を参照) 2 mg/mL の濃度で E3 培地にプロナーゼ粉末を溶解することによって調製されたプロナーゼ溶液を伴うデコリオネート胚。胚を軽くピペットして絨毛を壊す。プロナーゼ/E3培地を捨て、新鮮なE3で皿を数回洗いすって、すべてのプロナーゼを取り除きます。
2. 注射の約5分前にトリケーヌを含むE3培地中のゼブラフィッシュ胚を麻酔する。
3. 麻酔下の胚をステップ1で調製したトラックにピペットする。細かいゲルローディングチップを使用して、胚を横位置に並べています。
4. 第5部に記載されているように、約5μLの P.緑素吸物調製 液を用いてマイクロインジェクション針をロードする。
5. クーヴィエのダクトの出発点に針をドーサリーに挿入し、そこで黄身嚢の上に広がり始めます。1~3 nLの体積を注入し、その体積がダクト内で直接膨張し、循環に入ることを確認します。
6. およそ50個の注入胚の後、100 μLの無菌PBSで1.5 mL遠心分離管に細菌の滴を注入し、注入量が同じままであるかどうかを確認します。Lb寒天に接種器をプレート( 表1参照)を一晩で37°Cでプレートし、CFUを評価します。
7. 新鮮なE3培地+PTUを用いて2つのきれいなペトリ皿にマイクロインジェクション胚を移し、28°Cでインキュベートします。
8. 2つの選択された時点で:細菌注入の30分または3時間後に、インキュベーターから細菌注入胚でペトリ皿の1つを取り出し、ファージカクテル注射のために6.3に記載されているようにトラックに整列させる。
9. 微細なゲルローディングチップを用いて約5μLのファージカクテル(ステップ4で調製)をマイクロインジェクションニードルでロードし、マイクロインジェクターに固定します(ステップ5参照)。
10. 以前に細菌を注入した胚のCuvierのダクトにファージカクテルを注入する。
11. 新鮮なE3培地+PTUを用いて2つのきれいなペトリ皿にマイクロインジェクション胚を移し、28°Cでインキュベートします。

7. PAO1およびファージを注入した胚の細菌負担の評価

1. 8 hpiでは、ペトリ皿から1.5mL遠心分離管に15個の麻酔胚をピペットした。
2. 麻酔液をPBS(PBSTritonX)の1%トリトンX-100の300 μLに置き換え、無菌27-G針でインスリン注射器を通して少なくとも15倍の胚を通過させることによって胚を均質化する。
3. 希釈したホモゲン酸100 μLを900 μLの滅菌PBSに移すことで、滅菌PBS中のホモジネートの連続希釈液を調製します。
4. 自然にアンプ耐性PAO1株を選択するには、LB寒天の希釈液のプレート100 μLにアンピシリン(100 μg/mL)を加え、37°Cオーバーナイトでインキュベートします。
5. 翌日、コロニー数を数え、希釈因子を掛けてCFUの総数を求め、均質化された胚数で割ってCFU/感染胚の平均数を求める。

8. PAO1およびファージを注入した胚の致死性の評価

1. PAO1感染の致死性を評価するには、注入された胚を実体顕微鏡で20hpiで採点し、死んだ胚(白/透明ではない)を数える。
2. 20 hpfで注入された胚の50%の死亡を決定するPAO1の半最大致死濃度50(LD50)用量を計算する。

9. GFP⁺ PAO1感染の顕微鏡顕微鏡のタイムラプスイメージングのための胚調製物

1. E3溶液100mLに1.5%低融解アガロースを溶解することにより、生胚イメージング用の鋳型を準備します。
2. 胚を麻酔するために1%トリケーヌ( 表1を参照)を加える。
3. 4 hpiでは、ガラス底皿にプラスチックピペットを入れた1つの胚を移し、暖かい低融点アガロース溶液を加える。
4. ガラス底皿を実体顕微鏡下に配置し、希望の向きに胚を先端の位置に配置します。プラスチック製のピペットを使用して、胚にアガロースを慎重に追加します。
5. アガロースを5〜10分間冷やし、ガラス底皿に麻酔液を含むE3をそっと満たして胚を湿らせます。
6. GFP⁺ 細菌用蛍光フィルター(チャネル488 nm)を用いて、胚を持つガラス底皿を蛍光体顕微鏡(チャネル488nm)に置きます。9、14、18 hpiで同じパラメータを使用してさらに取得するまで、ペトリ皿を取り外しないでください。

10. 炎症促進性サイトカインの発現解析

1. 20 hpiでトリカイン1x溶液で胚を麻酔し、ペトリ皿から1.5mL遠心分離管に移します。
2. ヒュームフードの下で麻酔液を取り除き、200 μLのグアニジウム塩酸試薬と交換してください。
3. 胚を最初に200 μLピペットを繰り返しpipettし、次に滅菌27G針を持つインスリン注射器で少なくとも15倍のピペットをピペット化します。
4. 製造業者の指示に従って市販のグアニジウム塩酸塩試薬を使用して、均質化されたゼブラフィッシュ胚から全RNAを抽出する。
5. メーカーの指示に従って、RNAの各サンプル1μgをDNase I(RNaseフリー)の1U/μLの2μLで処理します。
6. DNase Iの1 μgを使用して、市販キット( 材料表を参照)を使用して、メーカーの指示に従って合計容量20 μLで逆転写反応(RT)にRNAを処理します。
7. 1.5 μLのRT反応希釈を使用して、1x SYBRグリーンマスターミックスを含む全体積10 μLでRT qPCR反応を行います。正規化の目的のために、家事維持遺伝子 rpl8 用のプライマーを使用し、炎症促進サイトカインに対しては 、TNF-αおよび IL-1β用のプライマーを使用する( 表2参照)。qPCRプロトコルは:サイクル1ステップ1:95°C、2分、1回繰り返します。サイクル2:ステップ1 95°C、10 s、ステップ2 55°C、30 s、40倍を繰り返す。サイクル3:ステップ1 72°C、15分。

ここで示した結果および図は、cftrモルフォリノの注入を通じて生成されたCF胚を前述の10およびステップ5で参照する。CF表現型を検証するために、前述の17(図1)のように心臓、肝臓、膵臓などの内臓の位置障害が考えられた。前回の出版物19で報告されたWT胚の場合にも同様の結果が得られた。

細菌の負担はPAO1に感染したCF胚のファージ療法によって減少した。さらに、15個の胚群を均質化して8hpiで細菌の負担を評価した:PAO1感染胚中に存在する細菌(cfu/胚)の平均数はファージ投与後に約20%に減少し、ファージカクテルの存在下での重症感染が少ないことを確認した(図2)。

GFP+細菌PAO1に感染したCF胚におけるファージ療法によって致死性が低下した。CFゼブラフィッシュ胚は48hpfで、20hpi後に50%致死性を引き起こした用量でPAO1株のGFP+細菌を注射した(30cfu/胚、図3A)。注射部位は、全身感染を発生させるCuvierの黄身またはダクトであった。PAO1感染に対するファージ療法は、等しく混合ファージカクテル(300-500 pfu/胚)の2nLを注入することによって試験した。注射は、細菌注射後30分(早期)と7時間(遅れ)の2つの異なる時点で行った。どちらの場合も、20hpiで致死性が低下し、ファージ療法が有効であることを示す(図3B)。

ライブイメージングでは、蛍光顕微鏡を用いて、GFP+PAO1を注入したCF胚の感染の進行を+ 追跡し、卵黄嚢上への蛍光細菌の拡散を低減するファージ療法の有効性を示した。図4、9、14、18hpiでGFP+細菌増殖を有するCF+PAO1注入胚は図4の上側に示されているのに対し、CF+PAO1+ファージ胚は細菌に対するファージ作用による蛍光低下を伴う胚を下部に示している(図4)。

ファージ療法は、CF胚におけるPAO1感染によって生成される炎症反応を減少させた。また、8hpiでPAO1およびPAO1+ファージ注射により発生する免疫応答を評価した。予想通り、qPCR技術で分析したプロ炎症性サイトカインTNF-aおよびIL-1βの発現は、コントロールと比較してPAO1注射後に有意に増加し、ファージカクテルの共注入と共に減少した(図5A,B)。

図1:cftrモルフォリノ(cftr -MO)注射時のcftrCF胚の生成と検証。(A)CF注入胚における心臓の位置およびループの障害は、野生型(WT)胚と比較してである。心は、シンチハイブリダイゼーション技術によってcmlc2発現で可視化される。(B)WTと比較してCF胚における肝臓(矢印)および膵臓の障害位置は、その場でのハイブリダイゼーション技術によってprox1a発現で可視化される。スケールバーは100 μmを示します。リヴ: 肝臓;p:膵臓。図は19から転載されています この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PAO1 またはPAO1+ファージに感染したCF胚における細菌の負担。 PAO1+ファージ対PAO1胚におけるcfu/胚の相対的な割合が与えられる。3つの独立した実験の平均とSDが報告されている。フィギュアは19から転載されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:PAO1およびPAO1+ファージに感染したCFゼブラフィッシュ胚の致死性。 ()1細胞段階でcftr-MOをマイクロインジェクションした48hpfゼブラフィッシュ胚におけるLD50の測定(CF胚)を、増加する細菌を含むPAO1の培養物の2nLで48 hpfで感染した(cfu/胚)。20hpiで胚の致死性が観察された。(B) 48 hpfでPAO1に感染し、ファージカクテル(PAO1+Φ)で治療したCF胚の20hpiでの致死性。 報告された平均およびSDは、それぞれ6回および4回の実験から、それぞれ25〜40個の胚を有する。角度変換は致死率の割合に適用され、一方行ANOVAに続いてダンカンの検定が使用された。フィギュアは19から転載されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ゼブラフィッシュにおけるファージ療法の有効性のイメージング。PAO1注射後のCF胚(上胚)における感染の進行と、4、9、14および18 hpiでのPAO1+ファージ注入胚(下胚)におけるファージ療法の有効性。スケール バーは 100 ミクロンを示します。フィギュアは19から転載されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:PAO1およびPAO+ファージ投与後のプロおよび抗炎症性サイトカインの発現。48hpfでPAO1およびPAO1+Φを注射したCF胚における8hpiでRT-qPCRで測定したTNF-a(A)およびIL-1β遺伝子の発現レベルを48hpfで、rpl8の発現を用いて正規化した。4つの実験の平均とSDが報告されている。統計的有意性は、ANOVAによって評価され、その後ダンカンの検定が続いた:TNF-a(CF)対(CF+PAO1)p = 0.015*; p(CF) 対 (CF+PAO1+Φ) p = 0.019*;(CF +PAO1) 対 (CF+PAO1+ Φ) p = 0.77 n.s.IL-1β(CF)対(CF +PAO1)p = 0.00014***の場合。 p(CF) 対 (CF+PAO1+ Φ) p = 0.00068***;(CF +PAO1) 対 (CF+PAO1+ Φ) p = 0.031*。フィギュアは19から転載されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ソリューションの準備

表 2: RT-qPCR に使用されるプライマー

著者らは開示するものは何もない。