2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

サマリー

ここでは、cDNA中間体を使用せずに短いRNA(ランあたり<35 nt)をシーケンシングする直接的な方法として、また、単一の研究で異なるヌクレオチド修飾を単一塩基の精度でシーケンシングする一般的な方法として使用できるLC-MSベースのシーケンシング法の詳細なプロトコールについて説明します。

要約

質量分析(MS)ベースのシーケンシングアプローチは、相補的DNA(cDNA)中間体を必要とせずにRNAを直接シーケンシングするのに有用であることが示されています。しかし、このようなアプローチは de novo RNAシーケンシング法として適用されることはほとんどなく、主に精製された一本鎖RNAサンプルの既知の配列を確認するための品質保証を支援するツールとして使用されています。最近、私たちは、2次元質量保持時間疎水性末端標識戦略をMSベースのシーケンシング(2D-HELS MS Seq)に統合することにより、ダイレクトRNAシーケンシング法を開発しました。この方法は、単一のRNA配列だけでなく、最大12の異なるRNA配列を含む混合物も正確にシーケンシングすることができます。この分析法には、4つの標準的なリボヌクレオチド(A、C、G、U)に加えて、修飾ヌクレオチドを含むRNAオリゴヌクレオチドのシーケンシング能力があります。これが可能なのは、修飾された核酸塩基が、その同定とRNA配列内の位置に役立つ固有の固有の質量を持っているか、または固有の質量を持つ製品に変換できるためです。本研究では、代表的な修飾ヌクレオチド2種(シュードウリジン(Ψ)と5-メチルシトシン(m⁵C))を組み込んだRNAを用いて、単一のRNAオリゴヌクレオチドと、それぞれ異なる配列および/または修飾ヌクレオチドを持つRNAオリゴヌクレオチドの混合物の de novo シーケンシング法の適用例を示しました。これらのモデル RNA のシーケンシングに関する本書に記載されている手順とプロトコールは、標準的な高分解能 LC-MS システムを使用する場合、他のショート RNA サンプル(<35 nt)に適用でき、修飾された治療用 RNA オリゴヌクレオチドのシーケンシング検証にも使用できます。将来的には、より堅牢なアルゴリズムとより優れた機器の開発により、この方法はより複雑な生物学的サンプルのシーケンシングを可能にする可能性があります。

概要

トップダウンMSやタンデムMS 1,2,3,4などの質量分析(MS)ベースのシーケンシング法は、RNAの直接シーケンシングのために開発されました。しかし、質量分析計で高品質のRNAラダーを効果的に生成するためのin situフラグメンテーション技術は、現在、de novoシーケンシングには適用できません^5,6。さらに、精製されたRNA配列を1つだけde novoシーケンシングするために従来の1次元(1D)MSデータを分析することは非常に簡単ではなく、混合RNAサンプルのMSシーケンシングはさらに困難になります^7,8。したがって、2次元(2D)液体クロマトグラフィー(LC)-MSベースのRNAシーケンシング法が開発され、1D質量ラダーに代わる2D質量保持時間(t_R)ラダーの生成が組み込まれ、RNA8のde novoシーケンシングに必要なラダー成分の同定がはるかに容易^{になりました。}しかし、2D LC-MSベースのRNAシーケンシング法は、1つのラダーのみに基づいて完全な配列を読み取ることはできず、2つの共存する隣接するラダー(5'-および3'-ラ^ダー)8に依存する必要があるため、主に精製された合成短RNAに限定されます。より具体的には、このアプローチでは、低質量領域⁸の末端核酸塩基を読み取るために、双方向のペアエンドリードが必要です。ペアエンド読み取りの複雑さが増すと、未知のサンプルのどのラダーフラグメントがどのラダーに属するかについて混乱が生じるため、この方法はRNA混合物のシーケンシングには適しなくなります。

MSベースのRNAシーケンシングアプローチにおける上記の障壁を克服し、ダイレクトRNAシーケンシングにおけるそのようなアプリケーションを拡大するには、2つの問題に対処する必要があります:1)RNA鎖の最初のヌクレオチドから最後のヌクレオチドまでの完全な配列を読み取るために使用できる高品質のマスラダーをどのように作製するか、2)複雑なMSデータセットで各RNA/マスラダーを効果的に同定する方法。我々は、酸分解の制御を十分に制御するとともに、MSベースのシーケンシング技術に疎水性末端標識戦略(HELS)を導入することで新しいシーケンシング法を開発し、シー^{ケンシングする}RNAの5'末端および/または3'末端に疎水性タグを追加することで、これら2つの問題にうまく対処した9。この方法は、RNAから「理想的な」配列ラダーを作成します—各ラダーフラグメントは、各ホスホジエステル結合のみでの部位特異的なRNA切断に由来し、2つの隣接するラダーフラグメント間の質量差は、その位置でのヌクレオチドまたはヌクレオチド修飾のいずれかの正確な質量です^8,9,10.これが可能なのは、高度に制御された酸性加水分解ステップが含まれており、RNAを装置に注入する前に、分子ごとに平均して1回断片化するためです。その結果、各分解フラグメント生成物は質量分析計で検出され、すべてのフラグメントが一緒になってシーケンシングラダー8,9,10を形成する。この新しい戦略により、RNAの一方のラダーからRNA配列を完全に読み取ることができ、もう一方のRNAラダーからペアエンドを読み取ることなく、さらに、組み合わせヌクレオチ^{ド修飾を含む}複数の異なる鎖を持つRNA混合物のMSシーケンシングが可能になります9。RNAの5'末端および/または3'末端にタグを追加することで、標識されたラダーフラグメントはt_Rの有意な遅延を示し、2つの質量ラダーを互いに区別したり、ノイズの多い低質量領域から区別したりするのに役立ちます。疎水性タグの追加によるmass-t_Rシフトにより、質量ラダーの同定が容易になり、シーケンス生成のためのデータ解析が簡素化されます。さらに、疎水性タグの添加は、タグによって引き起こされる質量および疎水性の増加により、対応するラダーフラグメントがノイズの多い低質量-_{t R}領域に存在するのを防ぐことにより、ストランドの末端基部を同定するのに役立ち、したがって、単一のラダーからRNAの完全な配列を同定することを可能にする。ペアエンドリードは必要ありません。その結果、高度なシーケン^{シングアルゴリズムを使用せずに}、最大12の異なるRNA鎖の複雑な混合物のシーケンシングに成功したこと9をこれまでに実証しており、これにより、標準ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの両方を含むRNAのde novo MSシーケンシングへの扉が開かれ、混合されたより複雑なRNAサンプルのシーケンシングがより実現可能になります。実際、2D-HELS MS Seqを用いて、tRNAサンプル¹⁰の混合集団のシーケンシングに成功し、その応用を他の複雑なRNAサンプルにも積極的に拡大しています。

2D-HELS MS Seqが広範囲のRNAサンプルを直接シーケンシングできるように、ここではこのシーケンシングアプローチの技術的側面に焦点を当て、RNAサンプルの直接シーケンシングに技術を適用する際に必要なすべての重要なステップについて説明します。合成単一RNA配列、複数の異なるRNA配列の混合物、およびシュードウリジン(ψ)および5-メチルシトシン(^m5C)などの標準ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの両方を含む修飾RNAを含む、シーケンシング技術を説明するために具体例を使用する。すべてのRNAはホスホジエステル結合を含んでいるため、あらゆるタイプのRNAを酸加水分解して、^{最適な条件下で}2D-HELS MS Seqの理想的な配列ラダーを生成することができます^8,9。ただし、特定のRNAのすべてのラダーフラグメントの検出は、機器によって異なります。標準的な高分解能 LC-MS(40K)では、精製された短い RNA サンプル(<35 nt)のシーケンシングの最小ローディング量は、1 回あたり 100 pmol です。ただし、追加の実験を行う必要がある場合(たとえば、同一の質量を共有する異性体塩基修飾を区別するため)には、より多くの材料が必要です(RNAサンプルあたり最大400 pmol)。モデル合成修飾RNAのシーケンシングに使用されるプロトコルは、未知の塩基修飾を持つ生物学的RNAサンプルを含む、より広範なRNAサンプルのシーケンシングにも適用できます。ただし、すべての修飾を含む完全なtRNAをシーケンシングするには、標準的なLC-MS機器を使用してtRNAをシーケンシングするための1000 pmol(~76 nt)など、さらに大量のサンプルが必要であり、そのde novoシーケンシング¹⁰には高度なアルゴリズムを開発する必要があります。

プロトコル

1. RNAオリゴヌクレオチドの設計

1. 異なる長さ(19 nt、20 nt、21 nt)の合成RNAオリゴヌクレオチドを設計し、そのうちの1つ(RNA #6)は標準ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの両方を含みます。ψは、質量を変化させない修飾のモデルとして採用されていますが、これは U.^{m と}同一の質量を持つため、MS シーケンシングでは困難です。このアプローチの堅牢性を実証するために、質量を変化させる修飾のモデルとして 5 C が選択されています。
   
   RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAAA-OH-3'
   RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUACGC-OH-3'
   RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3'
   RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGA-OH-3'
   RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. 各合成RNAをヌクレアーゼフリーのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水(特に指定がない限りDEPC処理H₂Oと表される)に溶解して、100 mM RNAストック溶液を得ます。ストック溶液は-20°Cで長期保存します。
3. RNAサンプルの分解を避けるために、DEPC処理水、微量遠心チューブ、ピペットチップなど、RNaseフリーの実験用消耗品を使用してください。RNase除去ワイプを使用して、ラボ用品の表面を頻繁に拭きます。

2. RNAの3'末端をビオチンで標識します。

1. 2段階反応プロトコール(アデニル化とライゲーション)
   1. 50 mM 酢酸ナトリウム、pH 6.0、10 mM MgCl₂、5 mM ジクロロジフェニルトリクロロエタン (DTT)、0.1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 μL 1 μL 1 mM ATP、100 μM ビオチン化シチジンビスリン酸 (pCp-ビオチン) 1 μL 1 μL、50 μM Mth RNA リガーゼ 1 μL および 6 μL の DEPC 処理 H₂O (総容量 10 μL) を含む 10x アデニル化反応バッファーを RNase フリーの薄肉 0.2 mL PCR チューブに加えます。
      注:試薬は、2ステップ反応の前に-20°Cで保存してください。試薬を室温で解凍し、ボルテックスと遠心分離でよく混合してから反応に加えます。
   2. PCR装置で反応液を65°Cで1時間インキュベートし、85°Cで5分間反応液を不活性化します。
   3. 前のステップの反応液10 μLを含むRNaseフリーの薄肉0.2 mL PCRチューブで、50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)-HCl、pH 7.8、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、シーケンシングするRNAの100 mMサンプルストックの1.5 μLを含む10x T4 RNAリガーゼ反応バッファーを3 μL添加してライゲーションステップを行います。 10%(v/v)に達するには3 μLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)、1 μLのT4 RNAリガーゼ(10 units/μL)、および11.5 μLのDEPC処理H₂O(総容量30 mL)が必要です。反応液をPCR装置で16°Cで一晩インキュベートします。
      注:DMSOは凝固点が高い(18.45°C)ため、反応成分を室温で組み合わせてください。
   4. 反応液を16°Cで一晩インキュベートします。
   5. Oligo Clean & Concentrator(Zymo Research、カリフォルニア州アーバイン、米国)を使用して、カラム精製により反応をクエンチおよび精製し、酵素と遊離pCp-ビオチンを除去します。オリゴ結合バッファー、DNA洗浄バッファー、スピンカラム、コレクションチューブがキットに含まれています。Binding Bufferを添加する前に、反応溶液に20 mLのDEPC処理H₂Oを加えてサンプル容量を50 mLにします。
   6. 各反応溶液に100 mLの結合バッファーを加えます。エタノール400μLを加え、ピペッティングで混合し、カラムに移します。10,000 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
   7. 750 μL の DNA Wash Buffer をカラムに加えます。10,000 x g で遠心分離し、最大速度をそれぞれ30秒と1分間遠心分離します。
   8. カラムを1.5 mLの微量遠心チューブに移します。DEPC処理したH₂O15 μLをカラムに加え、10,000 x g で30秒間遠心分離してRNA産物を溶出します。
      注:この段階では、次のステップが実行されるまで、サンプルを-20°Cで保存できます。
2. ワンステップ反応プロトコール
   1. 2 μL の 150 μM アデノシン-5'-5'-ジリン酸-{5'-(シチジン-2'-O-メチル-3'-リン酸-TEG}C-ビオチン (AppCp-ビオチン)、3 μL の 10x リガーゼ反応バッファー、1.5 μL のシーケンシング対象 RNA の 100 mM サンプルストック、3 μL の無水 DMSO を 10% (v/v) に到達、1 μL の T4 RNA リガーゼ (10 units/μL) を組み合わせて 1 ステップ標識反応を行います。 19.5 μL の DEPC 処理 H₂O (総容量 30 mL) を 1.5 mL の RNase フリー微量遠心チューブに入れます。
   2. 反応液をPCR装置で16°Cで一晩インキュベートします。
   3. 上記のステップ2.1.5-2.1.8で説明したようにカラム精製を行います。
      注:各RNAサンプル(RNAの150 pmolスケール)に対して、個別の/排他的な反応チューブを準備します。RNAの5'末端をスルホシアニン3(Cy3)またはCy3で標識することが必要な場合があります(例えば、双方向シーケンシングの検証のため)。この方法は3'-ビオチン化の方法とは異なり、以前の論文⁹に記載されている。

3. ビオチン化RNAサンプルをストレプトアビジンビーズに捕捉

1. 1.5 mL RNaseフリーの微量遠心チューブに 200 μL の 1x B&W バッファー (5 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl) を添加して、200 μL のストレプトアビジン C1 マグネットビーズを活性化します。この溶液をボルテックスし、マグネットスタンドに2分間置きます。次に、溶液を慎重にピペッティングして上清を捨てます。
2. ビーズを200 μLの溶液A(DEPC処理0.1 M NaOHおよびDEPC処理0.05 M NaCl)で2回、200 μLの溶液B(DEPC処理0.1 M NaCl)で1回洗浄します。各洗浄ステップで、溶液をボルテックスしてマグネットスタンドに2分間置き、続いて上清を捨てます。次に、2x B&Wバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl)100 μLを加えます。
3. ビオチン化RNAサンプルに1x B&Wバッファーを添加し、容量が100 μLになるまで加えます。次に、この溶液を100 μLの2x B&Wバッファーに保存した洗浄済みビーズに加えます。100 rpmのロッキングプラットフォームシェーカーで室温で30分間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに2分間置き、上清を捨てます。
4. コーティングしたビーズを1x B&Wバッファーで3回洗浄し、各洗浄ステップで上清の最終濃度をNanodropで測定して回収分析を行い、目的のRNA分子がビーズに残っていることを確認します。
5. ビーズを10 mM EDTA、pH 8.2、95%ホルムアミド、65°C、65°Cで5分間PCRマシンでインキュベートします。チューブをマグネットスタンドに2分間置いておき、上清(ストレプトアビジンビーズから放出されたビオチン化RNAを含む)をピペットで回収します。
   注:酸分解前のこの物理的分離ステップは、 図 1c の RNA#1 のシーケンシングにのみ使用され、疎水性ビオチン標識により LC-MS 測定中に 3' 標識ラダーフラグメントの t_R が大幅に遅延する可能性があるため、2D-HELS MS Seq では必須ではありません。これにより、2D mass-t_R プロットで標識された 3'-ラダーフラグメントと標識されていない 5'-ラダーフラグメントを明確に区別できます。

4. シーケンシング用のMSラダーを生成するためのRNAの酸加水分解

1. 各RNAサンプルを3つの等しいアリコートに分割します。例えば、15 μL の RNA サンプルを 5 μL の 3 つのアリコートに分割します。
2. 等量のギ酸を添加して、反応混合物^8,9で50%(v / v)ギ酸を達成します。
3. PCR装置で反応を40°Cでインキュベートし、1つの反応をそれぞれ2分間、1つの反応を5分間、1つの反応を15分間実行します。
4. 酸分解を急冷するには、各反応終了後すぐにサンプルをドライアイスで凍結します。
5. 遠心真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させます。通常、サンプルは30分以内に完全に乾燥され、ギ酸の沸点(100.8°C)はH₂O(100°C)と同程度であるため、乾燥プロセス中にヒ酸はH₂Oとともに除去されます。
6. LC-MS測定のために、DEPC処理したH₂Oの20 μLに合計3つの乾燥サンプルを懸濁して組み合わせます。
   注:この段階では、LC-MS測定を待つ間、サンプルを-20°Cで保存できます。

5. ψをCMC-ψ付加物に変換する

1. 0.0141 gのN-シクロヘキシル-Nʹ-(2-モルフォリノエチル)-カルボジイミドメト-p-トルエンスルホン酸(CMC)と0.07 gの尿素を含む1.5 mLのRNaseフリー微量遠心チューブに、DEPC処理したH₂O80 μLを加えます。シーケンシングするRNAの100 μMサンプルストック10 μL、1 Mビシンバッファー(pH 8.3)8 μL、0.5 M EDTA1.28 μLを添加します。DEPC 処理した H₂O を添加して総容量 160 μL にすると、最終濃度は 50 mM ビシン (pH 8.3) 中に 0.17 M CMC、7 M 尿素、4 mM EDTA です¹¹。
   注:このプロトコルは、単一の合成RNA配列またはRNA混合物のいずれかに適用できます。
2. 160 μLの反応溶液をRNaseフリーの薄肉0.2 mL PCRチューブで4等分し、PCRマシンで37°Cで20分間インキュベートします。
   注:チューブあたり50μLは、PCR装置で使用できる最大反応量です。
3. 10 μLの1.5 M酢酸ナトリウムと0.5 mM EDTA(pH 5.6)で各反応をクエンチします。
4. 4つの平行スピンカラムでカラム精製を行い、ステップ2.1.5-2.1.8で説明されている手順に従って過剰な反応物を除去します。精製した製品を、各1.5 mL RNaseフリー微量遠心チューブ内の15 μLのDEPC処理H₂Oに溶解します。
5. 精製した製品を4本のRNaseフリーの薄肉0.2 mL PCRチューブに移します。精製された製品15 μLごとに0.1 M Na₂CO₃バッファー(pH 10.4)を20 μL加え、DEPC処理されたH₂Oを添加すると、各反応チューブ(合計4本のチューブ)の最終容量が40 μLになります。反応液を37°Cで2時間PCR装置でインキュベートします。
6. ステップ2.1.5で説明したように、4つの平行スピンカラムによるカラム精製により、反応をクエンチおよび精製します。CMC-ψ変換した製品を、それぞれ15 μLのDEPC処理H₂Oを含む1.5 mLのRNaseフリー微量遠心チューブに溶出します。
7. 精製したCMC-ψ変換されたサンプルを4つのコレクションチューブから1本のチューブに結合します。ステップ 4.1 から 4.6 で説明されている手順に従ってギ酸分解を 50% (v/v) 行い、シーケンシング用の MS ラダーを生成します。

6. LC-MS測定

1. LC-MS 測定用の移動相を調製します。移動相 A は、25 mM ヘキサフルオロ-2-プロパノールと 10 mM ジイソプロピルアミンを LC-MS グレードの水に溶かしたものです。移動相Bはメタノールです。
2. サンプルをLC-MSサンプルバイアルに移し、分析します。各サンプル注入量は、100〜400 pmolのRNAを含む20 μLです。
3. 以下のLC条件を使用してください:カラム温度35°C、流速0.3mL/分;2 〜 20% 移動相 B から 15 分間かけて線形グラジエントを行い、その後 90% 移動相 B で 2 分間の洗浄ステップを行います。
   注:セクション 2 で述べた Cy3 や sulfo-Cy3 などの疎水性の末端標識では、サンプル溶出に高い割合の有機溶媒が必要になる場合があります(つまり、同様のグラジエントを使用できますが、移動相 B の割合範囲が広くなります)。例えば、移動相 B を 2 〜 38% で 30 分間、2 分間の洗浄ステップで 90% 移動相 B を 30 分間混合します。
4. Agilent Q-TOF(Quadrupole Time-of-Flight)質量分析計と、オートサンプラーおよびMS HPLC(High Performance Liquid Chromatography)システムを搭載したLCシステムを組み合わせて、サンプルを分離して分析します。LCカラムは、粒子径が1.7 μmの50 mm x 2.1 mmC18カラムです。次のMS設定を使用します:マイナスイオンモード。範囲、350 m / z〜3200 m / z;スキャンレート、2スペクトル/秒;乾燥ガス流量、17 L / min;乾燥ガス温度、250°C;ネブライザー圧力、30 psig;キャピラリー電圧、3500 V;フラグメント電圧、365V。これらのパラメータは、使用する質量分析計のタイプまたはモデルに固有のものであることに注意してください。
5. Agilent MassHunter 取得ソフトウェアでデータを取得します。Agilent 分子特徴抽出(MFE)ワークフローを使用して、質量、保持時間、容量(各イオン種のMFE存在量)、品質スコアなどの化合物情報を抽出します。 次のMFE設定を使用します:「重心データ形式、低分子(クロマトグラフィー)、高さ≥100のピーク、最大1000、品質スコア≥50」。
   注:MFE設定を最適化して、最大1000個まで、品質スコアが50≥、できるだけ多くの潜在的な化合物を抽出します。

7. 計算アルゴリズムによるRNA配列生成の自動化

注:この手順は、 図1cのRNA #1についてのみ示されています。

1. MFE抽出化合物を、体積(ピーク強度)とt_Rの減少順にソートします。1)ビオチン標識された質量ラダー成分のt_Rsがこのt_Rウィンドウ(4分から10分)にシフトされるため、ビオチンによって標識されたRNAフラグメントを選択するために_{t R}を4分から10分に設定して選択し、2)アルゴリズム計算のためにラダーフラグメントの数よりも桁違いに高いインプット化合物を使用して、ボリュームに基づくデータ量を減らすことで、データの事前選択を行います。例えば、20 nt RNAの場合、20 nt RNAのシーケンシングには20個の標識された_{mass-t R}ラダー成分が必要になるため、MFEデータファイルから200個の化合物が体積に基づいて選択されます。質量分析計の種類や機種が異なると、_{t R}ウィンドウが異なる場合がありますので、ご注意ください。
2. 公開されたアルゴリズム⁸の改訂版を使用してRNA #1のデータ処理と配列生成を実行します。改訂されたアルゴリズムのソースコードは、前述(https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹に記載されている。
3. アルゴリズムを使用してシーケンス生成を自動化するだけでなく、ベースコールのために2つの隣接するラダーコンポーネント間の質量差を手動で計算します。RNA内のすべての塩基は手動で呼び出すことができ、RNAヌクレオチドおよび修飾データベース⁸の理論上の塩基と照合できます。したがって、RNA鎖の完全な配列を手動で正確に読み取ることができ、アルゴリズムによって報告された配列の読み取り精度を確認するために使用されます。RNA修飾のさらなる構造は、RNA修飾データベース¹²に見出すことができ、それらに対応する理論質量はChemBioDrawによって得られる。表 S1 から S2 では、特定のラダー成分について観測された質量とその理論質量と比較すると、ppm (100 万分の 10 万) の質量差が示されており、10 ppm 未満の値は各ベースコールで良好に一致していると見なされます。

8. RNA混合物のシーケンシング

1. ステップ2.2で説明したワンステッププロトコールを使用して、3'末端の5本のRNA鎖(RNA #1〜#5)の混合物をA(5')pp(5')Cp-TEG-ビオチンで標識します。総容量150 μLの反応液中に、10x T4 RNAリガーゼ反応バッファー15 μL、各RNA鎖1.5 μL(RNA #1から#5のストック100 μM、総容量7.5 μL)、150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-ビオチン10 μL、無水DMSO15 μL、 5 μL の T4 RNA リガーゼ (10 units/μL) と 97.5 μL の DEPC 処理 H₂O. 反応溶液を 5 つのアリコートに均等に分配します。各RNaseフリー微量遠心チューブには、30 μLの反応溶液が含まれています。
2. 反応液をPCR装置で16°Cで一晩インキュベートします。
3. ステップ2.1.5-2.1.8で説明した手順に従って、5本の平行スピンカラムを使用してカラム精製を行います。3'-ビオチン化5 RNA鎖の混合物サンプル(RNA #1から#5の混合物)を、15 μLのDEPC処理H₂Oを含む1.5 mLのRNaseフリー微量遠心チューブに溶出します。
4. 5つの収集チューブから精製された混合物サンプルを1つのチューブに結合します。セクション4に記載されている手順に従ってギ酸分解を行います。
5. セクション 6 で説明したように LC-MS でサンプルを測定し、ステップ 6.5 で説明したように、最適化された MFE 設定のデータ解析ソフトウェアを使用してデータを分析して、質量、t_R、および体積を含むデータを抽出します。一般的な処理アルゴリズムとベースコールアルゴリズムは、混合物によってデータの複雑さが大幅に増加するため、適用されません。混合サンプルのRNA中のすべての塩基は、セクション7.3と同様の方法で手動で呼び出され、RNAヌクレオチドおよび修飾データベース⁸の理論上の塩基とよく一致するため、混合サンプル中の5本すべてのRNA鎖の完全な配列が正確に読み取られます。 表S7〜S11には、観測質量、_{t R}、体積、品質スコア、ppm質量差など、すべての情報がリストされています。

結果

RNAの3'末端にビオチンタグを導入し、容易に識別できるmass-t_Rラダーを作製します。2D-HELS MS Seqアプローチのワークフローを図1aに示します。RNAの3'末端に導入された疎水性ビオチン標識(セクション2を参照)は、標識されていないラダー成分と比較して、3'標識ラダー成分の質量とt_Rsを増加させます。したがって、2D mass-t_R プロットでは、3' ラダー曲線は y 軸の値が大きい値にシフトされ (t_Rs の増加による)、x 軸の値が大きい値にシフトします (質量の増加による)。図 1b は、2D-HELS MS Seq の 3'-末端へのビオチンタグの導入を含むサンプル調製プロトコルを示しています。図 1c は、RNA #1 の 3'-ビオチン標識 mass-t_R ラダーフラグメントの t

ディスカッション

タンデムベースのMSフラグメンテーションとは異なり、高度に制御された酸性加水分解は、質量^{分析計9,10}での分析前にRNAをフラグメンテーションするために、2D-HELS MS Seqアプローチで使用されます。その結果、酸分解された各フラグメントを装置で検出でき、シーケンシングラダーと同等のものを形成します。最適な条件下では、この方法は、ホスホジエステル結合^8,9,10でのみ、平均して分子あたり1つの部位特異的RNA切断を介して、RNAから「理想的な」配列ラダーを作成する。分解された各フラグメントを質量分析計で 1 回の分析で測定した後、隣接する 2 つのラダーフラグメント間の質量差は、その位置での RNA ヌクレオチドまたは修飾の正確な質量に対応します...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5' DNAのアデニル化のキット	ニューイングランドのBiolabs	E2610S	50uMの集中
6550 Q-TOFの質量分析計	Agilent Technologies	5991-2116EN	1290 Infinity LCシステム
A(5´)に結合されてpp(5´)Cp-TEG-ビオチン-3´	ChemGenes	91718	HPLC精製
ATP&γ;S	Sigma-Aldrich	11162306001	リチウム塩
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (滴定)
ビオチン マレイミド	Vector Laboratories	SP-1501	ロングアーム
C18 カラム	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 カラム、粒子径 1.7 μm
遠心真空濃縮器	Labconco	Refrig 115V/60Hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	化学構造と特性データを生成する 構造とフラグメント
CMC (N-シクロヘキシル-N?-(2-モルフォリノエチル)-カルボジイミドメト-p-トルエンスルホン酸)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purifiy
シアニン3 マレイミド (Cy3)	Lumiprobe	11080	水不溶
DEPC処理水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9906	オートクレーブ滅菌済み、ヌクレアーゼフリー認証
ジイソプロピルアミン(DIPA)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich		276855 無水ジメチルスルホキシド、99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	無水、結晶性、BioReagent、細胞培養に適した
ギ酸	メルク	64-18-6	98-100%、ACS reag、Ph Eur
ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS サンプルバイアル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C4000-11	プラスチックねじバイアル
LC-MS バイアルキャップ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C5000-54A	オートサンプラーバイアルねじキャップ
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
>Oligo Clean &コンセントレーター	Zymo Research	D4060	スピンカラム
OriginLab	OriginLab OriginPro		データ解析およびグラフ作成ソフトウェア
pCp-biotin	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	カスタム RNA オリゴ	19nt-21nt 一本鎖 RNA、さらなる精製なしで使用
ロッキングプラットホームシェーカー	VWR	オービタルシェーカー スタンダード 1000	速度範囲 40 〜 300 rpm
ストレプトアビジン磁気ビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88816	結合 約 55ug ビオチン化ウサギ lgG ビーズのmgあたり
スルホン化シアニン3 マレイミド	Lumiprobe	11380	水溶性
T4 DNAリガーゼ 1	ニューイングランドバイオラボ	M0202S	400 ユニット/uL
T4ポリヌクレオチドキナーゼ	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	ファージ T4 am N81 pse T1 感染 大腸菌 BB
Tris-HCl バッファー	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl バッファー、pH 10、10 倍;、抗原レトリーバー
尿素	Sigma-Aldrich	81871	合成用尿素。CAS番号57-13-6、EC番号200-315-5。