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方法論記事

形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養

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DOI:

10.3791/61283

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2020年9月27日

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Mary's College of California

この記事について

サマリー

本論文では、上方の頸神経節からの胚性ラット交感神経の単離と培養について述べている。また、免疫細胞化学染色や質量分析のためのニューロン抽出物の準備のための詳細なプロトコルも提供します。

要約

胚性ラットの優れた子宮頸神経節(SCG)の交感神経ニューロンは、軸索成長、軸索密化、シナプトジェネシス、樹状増進、樹状可塑性および共培養系における神経標的相互作用を研究するための末梢ニューロンのインビトロモデルシステムとして使用されてきた。このプロトコルは、E21ラット胚の優れた子宮頸神経節からのニューロンの分離および解離、続いて無血清培地における純粋な神経細胞培養の調製および維持について説明する。ニューロンはコーティングされていないプラスチックに付着しないため、ニューロンは12mmのガラスカバーリップまたはポリD-リジンでコーティングされた6ウェルプレートのいずれかで培養されます。抗ミトキ薬(Ara-C、シトシンβ-D-アラビノフラノシド)による治療後、このプロトコルは、5%未満の非神経細胞を有する健康な神経培養を生成し、1ヶ月以上インビトロで維持することができる。胚性ラットSCGニューロンは生体内で5〜8デンドライトを有する多極であるが、;無血清条件下では、これらのニューロンは培養中の単一の軸索のみを拡張し、培養期間中はユニポーラであり続ける。しかし、これらのニューロンは、膜内抽出物、骨形態形成タンパク質(BMP)、または10%の胎児子牛血清の存在下でデンドライトを拡張するように誘導することができる。これらの均質な神経培養は、免疫細胞化学的染色および生化学的研究に使用することができる。また、これらのニューロンにおける微小管関連タンパク質-2(MAP-2)の免疫細胞化学的染色および質量分析用のニューロン抽出物の調製に対する最適化されたプロトコルについても説明する。

概要

胚性優子宮頸神経膠小(SCG)由来,の交感神経細胞は、成長因子依存、神経標的相互作用、神経伝達物質シグナル伝達、軸索成長、樹状突起の発達および可塑性、神経標的/神経グリアと神経グリア相互作用の基礎となるシナプス形成およびシグナル伝達機構を,2,3,4,5,6,7含む、神経発達の多くの側面を研究するための主要な神経細胞培養システムとして広く用いられている。,8その小さなサイズ(約10000ニューロン/神経節)にもかかわらず、この培養系の開発と広範な使用の3つの主な理由は、交感神経鎖の最初の神経節であり、交感神経節10の残りの部分よりも大きく、したがって分離しやすいです。ii)中央ニューロンとは異なり、SCGのニューロンはかなり均質で、すべてのニューロンは神経堤に由来し、同様の大きさを有し、神経成長因子に依存し、またアドレナリン症である。これにより、形態学的およびゲノム学的研究のための貴重なモデル,となる10、11,11およびiii)これらのニューロンは、10、12ヶ月以上の神経成長因子を含む定義された無血清培地で維持することができる。12周産期SCGニューロンは、樹状突起2の開始および維持の根底にあるメカニズムを研究するために広く使用されてきた。これは主に、SCGニューロンは生体内に広範な樹状樹状樹状の樹状樹状のアーバーを有するが、血清の不在時にインビトロで樹状突起を拡張しないが、骨形態形成タンパク質2、12、1312,のような2特定の成長因子の存在下で樹状突起を成長させることが誘導され得るからである。13

本論文では、胚性ラットSCGニューロンを単離・培養するためのプロトコルについて述べる。過去50年間、SCGの主要な神経細胞培養は、主に大規模なゲノムまたはプロテオミクスの変化を調べる研究の限られた数で形態学的研究に使用されてきました。これは主に組織サイズが小さく、少量のDNAまたはタンパク質の単離が原因であり、これらのニューロンにゲノムおよびプロテオミクス分析を行うことが困難です。しかしながら、近年、検出感度の上昇により、樹状成長発達14、15、16、17,15の間にSCGニューロンにおけるゲノム、miRNomeおよび16プロテオームを調べる方法の開発が可能になっている。また、免疫細胞化学を用いたこれらのニューロンの形態学的解析方法と、質量分析のためのニューロンタンパク質抽出物を得るためのプロトコルについても述べる。

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プロトコル

動物を含む研究で行われたすべての手順は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。セントメアリーズカレッジの動物ケアと使用ガイドラインは、国立衛生研究所(https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdfおよびhttps://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf)の動物福祉研究所が提供するガイドラインに基づいて開発されました。

1. 培養培地の作成(制御媒体ともいいます)

  1. 以下の成分を、以下に記載されている順序で、無菌500 mLフラスコに加える:1x低グルコースDMEMの190 mL、DMEMの20mg/mL脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(FAF-BSA)の10 mL、 2.8 mL L-グルタミン、100xインスリンセレントランスフェリン混合物の4 mL、125 μg/mL神経成長因子の0.4 mL(DMEMでは0.2%不活性タンパク質安定剤)、および200 mLハムのF-12培地。
  2. ピペットへのタンパク質の付着を防ぐために、インスリン-セレントランスフェリンやNGFなどのタンパク質含有溶液を添加する前に、FAF-BSAを含む培地でピペットをコーティングしてください。
  3. フラスコを旋回し、添加するたびに材料を混ぜます。F-12を加えた後、25 mLピペットと十分に混ぜます。
  4. アリコートは10mLアリコートで培養培地を、-80°Cで保存する。 アリコートは活動を失うことなく6ヶ月間保存することができる。

2. ニューロンを培養するためのプレートの調製

  1. ポリD-リジン(0.5 Mトリスバッファー、pH 8で作られた)の1mg /mLストックを滅菌蒸留水で100μg/mLに希釈します。
  2. プロテオームまたはゲノム解析では、解剖の1〜2日前に、ポリD-リジン(PDL)の無菌100 g/mL(PDL)の約2 mLで6ウェルプレートをコーティングします。これは、ウェルへの細胞接着を確保するために必要です.プレートをしがみつくフィルムで包み、4°Cで一晩保管してください。
  3. 形態解析および顕微鏡検査のために、12 mm2 前処理されたドイツのガラスカバーリップ(これは、以前に説明した18 または購入した硝酸処理を使用して洗浄することができる)を24ウェルプレートの各ウェルに配置します。
    1. ポリD-リジン(PDL)の無菌100 g/mLの0.3 mLでカバーリップをコーティングします。プレートを4°Cで一晩保管してください。
  4. 解剖の日には、解剖が始まる前に、ポリD-リジン溶液を井戸から取り出し、滅菌蒸留水で井戸を5回リンスし、続いて低グルコースDMEMで1回ずつすすがします。
  5. 神経節の酵素消化中(細胞をめっきする約1時間前)、DMEMをプレートから吸引し、0.3mLの制御培地に交換します。プレートを加湿室に5%CO2 以下で35.5°Cで保管してください。

3. 解剖の設定

  1. 解剖用200mLのメディアの調製(解剖メディアと呼ばれる)
    1. 低グルコースDMEM(1mg/mLグルコースを含む)に20mg/mL脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(FAF-BSA)の8 mLと100xペニシリンストレプトマイシンの2 mLを無菌ライボヴィッツのL-15培地(または任意のエアバッファリング培地)の193 mLに加える
  2. フードには、解剖のために次のアイテムを設定します:各チューブに約20 mLの解剖媒体を備えた4つの50 mL滅菌円錐管、解剖媒体の1.5 mLを備えた4つの無菌35mm皿、1つの無菌50 mL円錐管、20mLの解剖培地を用いた1つの、解約細胞を集めた1つの無菌10mLチューブを含む。
  3. 乾燥ビーズの滅菌器を使用して、1対の細かい鉗子(4または5鉗子)を少なくとも1分間殺菌してください。

4. 胚性ラットの子犬からの上頸神経節の分離

  1. 妊娠ラットからのE21胚の除去
    注:周囲の領域が完全に殺菌されている場合、子宮ホーンの除去はフードの外側で行うことができます。
    1. CO2吸入を使用して妊娠中2のラットを安楽死させる。腹部の領域から毛皮を剪断し、それを殺菌するために70%アルコールで領域内の皮膚を拭きます。
    2. 無菌ハサミと鉗子の新鮮なセットを使用して、皮膚を切断し、次に筋肉層を切断し、胚を含む子宮の角を露出させる。新しいハサミと鉗子を使用して胚で子宮の角を取り除き、その過程で腸に損傷を与えないように注意してください。
    3. 胚を含む子宮ホーンを150mm2 の滅菌ペトリ皿に移し、フードに移します。
    4. 鉗子とはさみの新しいセットを使用して、子宮の角から胚を取り除き、羊膜と胎盤から胚を分離する。
    5. 胚を安楽死させるために、右腕の下の正中線に沿って胚の脊髄を切断する。これはまた、SCGの除去中に頸動脈からの出血を減少させる。
    6. これらの胚を解剖培地を含む調製された50 mL円錐管に移す。胚がメディアに沈んでいるか確認してください。各チューブは、最大3個の胚を保持できます。
  2. 胚からの上頸神経節の分離
    1. 解剖培地から1匹の子犬を無菌150mm2 ペトリ皿に半分充填した固体基板(パラフィンワックスまたはシリコーンポリマーのいずれか)に移し、その後ろ面を基板に移します。3本の無菌23G針を使用して、各腕の下に1本の針を持ち、口を通して3本目の針で子犬を皿に固定し、首を慎重に伸ばします。
    2. 下の唾液腺を露出させるために無菌の細かい鉗子(第4または第5鉗子)を使用して首の領域の皮膚を切り裂く。細かい鉗子を使用してこれらの腺を取り除きます。
    3. 鎖骨と気管の近くに胸骨筋とオモヨイドの筋肉をそれぞれ見つけます。まず、横断性胸骨結節筋を切断し、細いオモヨイド筋肉を細い鉗子を使用して慎重に切断する。これらの筋肉が取り除かれると、前側端部の頸動脈の分岐が気管の両側に見え、SCGは頸動脈のこのフォークの下に位置する。
    4. 閉じた鉗子を使用して、頸動脈を静かに持ち上げてSCGを視覚化する。SCGの両側に1つの鉗子を使用して、頸動脈を引き出し、準備された無菌35 mm2 皿に移す。この組織は、頸動脈を有するSCG、無用量神経節を有する迷走神経ならびに領域内の筋肉または脂肪の他のセグメントを含む可能性が最も高い。
    5. 反対側で解剖プロセスを繰り返します。以下に概説する残りの解剖ステップを続行する前に、すべての胚からSCGを取り除きます。35 mm2 の皿の 2 つの間の分離されたティッシュを分配してティッシュサンプルの処理を容易にする。
  3. SCGの後処理
    1. SCGを解剖組織から分離するには、まず細かい鉗子を使用して、脂肪や筋肉などの余分な組織を取り除き、頸動脈分岐の近くの領域を避けるように注意する。
    2. これらの組織が取り除かれると、2つの神経節が見える。無用量神経節は小さく円形で、SCGはアーモンド型です。迷走神経を優しく引っ張って迷走神経と無用量神経節を頸動脈から分離し、頸動脈からSCGを分離する。
    3. SCGを取り囲むカプセルを取り除くために細かい鉗子を使用してください。SCGを新しい35mm培養皿に移します。解剖された組織サンプルをすべて使用して、このプロセスを繰り返します。
    4. ティッシュがピペットの壁に付着するのを防ぐために、滅菌された綿のプラグガラスピペットに解剖媒体を塗ります。ピペットを使用して、脱剖培地をコラゲターゼII型II型(1mg/mL)/ジスパーゼII型II型(5mg/mL)のカルシウムおよびマグネシウムフリーHBSSの無菌2mLに置き換え、37°Cで50分間インキュベートして組織を分解します。
      注:インキュベーション時間はコラゲラーゼ/ディスパーゼの異なるバッチで最適化する必要があり、通常40分から1時間の範囲です。
    5. インキュベーション中に、DMEMをプレートから吸引し、0.3 mLの制御媒体に交換してください。プレートを加湿室に5%CO2 以下で35.5°Cで保管してください。
    6. インキュベーションの後、コラゲターゼ/ディスパーゼのSCGを無菌15 mL円錐形チューブに移します。解剖培地を使用してプレートをすすい、チューブに溶液を移します。ボリュームを約 10 mL まで上げるのに十分な解剖メディアを追加します。
    7. 200 x g (1000 ~ 1200 rpm) で 5 分間の遠心分離機を室温で試料をペレット化する。上清を吸引し、ペレットを外さないよう注意する。ペレットを10mLの解剖培地で再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。
    8. 1-2 mLの培養培地に交換する。狭孔、ベント先端の無菌パスツールピペット(培養培地で前コーティング)を使用して、5〜6回穏やかに三度引きすることによって塊を機械的に解化する。大きな塊を約1分間落ち着かせてください。上清細胞懸濁液を新しい10 mLチューブに移します。
    9. SCGのほぼ完全な解離を確実にするために毎回トリアーレーションの力を増やすと、このプロセスをさらに3回繰り返します。
    10. ボリュームを 8 ~ 10 mL にする十分な培養メディアを追加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、ヘモサイトメーターで細胞密度を定量化します。
    11. 実験に適した細胞密度で細胞懸濁液をウェルに分配する。めっきプロセス中に細胞懸濁液を継続的に混合し、ウェルへの細胞の均等な分布を確保します。
      注:形態学的分析のために、24のウェルプレートに約8,000個の細胞/ウェルの細胞をプレートし、ゲノムおよびプロテオミクスプロトコルのために、30,000個の細胞/ウェルの高い細胞をプレートします。
    12. プレートを下部に滅菌水を入ったガラスデシケーターに移し、加湿チャンバーを作ります。十分なCO2( 約120mL)を注入して、密閉前にデシケータで5%のCO2 環境を得ます。プレートを35.5°Cに保ちます。 これは、プロトコルでは Day 0 と呼ばれます。
      注:これらのプレートは、通常の5%CO2インキュベーターで維持することもできます。上記の方法は、温度とpHの変化を最小限に抑え、また、クロス汚染を防ぐのに役立ちます。

5. 培養されたSCGニューロンおよび治療の維持

  1. 1日目(めっき後24時間)に、培養培地の半分を慎重に取り出し、2μM Ara-C(シトシンβ-D-アラビノフラノシド、抗ミトティック剤)に交換します。48時間細胞に治療を残します。通常、この治療期間は、培養中の非神経細胞を排除するのに十分である。
  2. 3日目に、培地の半分を軽く吸い込み、制御媒体に交換します。
  3. 4日目、細胞は実験的治療の準備ができています。適切な培地で1日おきに培養を供給し、ウェル内の培地の半分を新鮮な培地にそっと置き換える。
  4. 無血清培地中の培養SCGニューロンは軸索のみを伸ばす。実験が樹状突起の存在を必要とする場合は、10%の胎児の子牛血清、75-100 μg/mLの基体膜マトリックス抽出物または骨形態形成タンパク質-7の50 ng/mLを用いて細胞を治療する。樹状の成長は、治療の1週間以内に観察された精巧な樹状樹状樹状の樹状樹状の樹状の樹状の樹状の樹状の樹状の樹状の治療の48時間以内に観察される。

6. 免疫染色培養SCGニューロン

  1. 徐々に0.1 Mリン酸緩衝液で4%パラホルムアルデヒド、ヒュームフードでpH 7.2でウェル中の細胞培養培地を交換します。
    1. ウェル内の培養培地の半分を取り除き、4%パラホルムアルデヒドにそっと交換します。次に、この処理を少なくとも2回以上繰り返し、毎回ウェル内の培地の3分の2を取り除き、4%パラホルムアルデヒドに置き換えます。このプロセスの最後に、井戸のメディアの色はピンクから無色に変わったはずです。
    2. すべての培地を4%パラホルムアルデヒドに置き換えたら、室温で15〜20分間ウェルをインキュベートします。
  2. 上記と同様の方法で、4%パラホルムアルデヒド溶液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2に徐々に置き換える。5分間放置します。井戸をさらに2回、PBSで5分間リンスします。
    1. 4%パラホルムアルデヒドを取り除いたら、プレートをベンチトップに移動してさらに処理します。このステップは、プレートを一晩4°Cで保存できる良好な停止点です。
  3. すべての PBS を削除します。細胞を覆うのに十分な量の0.1%トリトンX-100をPBSに加える。5分間培養液に残して、ニューロンを透過させます。このステップのタイミングは、細胞の完全性を維持しながら良好な染色を確保するために重要です。
  4. トリトンX-100溶液を慎重に取り出し、PBSで毎回5分間ウェルを3回リンスします。PBS 溶液を削除します。
  5. 細胞を覆うのに十分な5%のBSAをPBSに加え、室温で20分間インキュベートして非特異的抗体結合を低減します。
  6. ブロッキング溶液を取り出し、PBSで5%BSAで希釈したMAP-2タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体と交換してください。一次抗体を4°Cで一晩細胞に残します。
  7. 再使用のために一次抗体を除去して保存します。一次抗体は、検出強度を失うことなく少なくとも2回再使用することができる。
  8. 細胞を覆うのに十分なPBSで3回リンスします。PBSを細胞に10分間放置します。
  9. PBS溶液を取り出し、PBS中の5%BSAで1:1000希釈時に、蛍光タグ共役ヤギ抗マウスIgG二次抗体と交換してください。室温で暗闇の中で2時間インキュベートする。
  10. 二次抗体を取り出し、PBSに交換します。1回10分間PBSで3回ウェルをすすいすります。水で井戸を一度すすいで塩を取り除きます。
  11. 蛍光標識サンプルに適した水性マウントタントの滴を含むガラススライドにカバースリップを取り付けます。スライドをイメージの準備ができるまで、スライドフォルダ内の4°Cに保存します。

7. 液体クロマトグラフィーと質量分析法を用いたプロテオームの分析用サンプル調製

  1. 培養ニューロンのリシス
    1. 井戸の中の培養培地をすべてそっと取り除きます。冷たい、無菌カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4と交換してください。すぐに取り出し、PBSに置き換え、5分間座らせます。このステップは、培養培地中に存在するタンパク質を除去するために行われる。
    2. 特定の治療のためにすべての井戸から慎重にすべてのPBSを取り除きます。このプロセスをもう一度繰り返します。細胞をライシングする際に氷の上にプレートを維持し、神経の損傷やタンパク質分解を最小限に抑えます。
    3. 100 ~ 150 μLの 50 mM重炭酸アンモニウム、pH 7.5 (NH4HCO3)を、滅菌セルスクレーパーを使用してウェルとスクレープセルの 1 つに加えます。マイクロピペットを使用して、液体を移し、特定の処理のためにすべてのウェルで掻き取りプロセスを繰り返します。掻き取った後、顕微鏡下の井戸を調べて、ほとんどの細胞が除去されていることを確認します。
      1. ニューロンの数が少ない場合は、限られた体積を使用して細胞を分解し、プロテオミクス分析に十分な濃度を確保します。
    4. 細胞溶解を助けるために一晩-80 °Cで溶液を凍結します。ライセートは、さらなる処理の準備ができるまで、この段階で保存することができます。
    5. 解凍したら、26 G または 28 G の針でサンプルを噴出し、細胞を機械的に融解します。
    6. 10分間2回超音波水浴でサンプルを超音波処理します。水浴に氷を加えて、タンパク質の過熱や変性を防ぎます。遠心分離機は12,000 x gで4°Cで5分間。
    7. タンパク質濃度を測定します。典型的なタンパク質濃度は0.4~1μg/μLの範囲
  2. プロテオーム分析用サンプル調製とトリプシン消化
    1. 最大60 μLのライセートまたは50 μgのタンパク質をDNase、RNase-およびプロテアーゼフリーの1.5 mLチューブに移します。ライセートの体積が60μL未満の場合は、ボリュームを構成するのに十分な50 mM重炭酸アンモニウムを加えます。
    2. 0.2%の酸不安定界面活性剤と渦の25 μLを加えます。80°Cのブロックヒーターでチューブを15分間インキュベートします。30 sの12,000 x g でチューブを遠心分離します。
    3. 100 mM のジチオトレイトールと渦を 2.5 μL 加えます。これにより、タンパク質はアルキル化と消化のためによりアクセスしやすくなります。ブロックヒーターで60°Cで30分間インキュベートします。室温と遠心分離機に冷却します。
    4. サンプルと渦に300 mMのヨウドアセトアセトアミドを2.5 μL加えます。このステップは、システインをアルキル化するのに役立ち、二硫化物結合の改革を防ぎます。暗闇の中で室温で30分間チューブをインキュベートします。
    5. 質量分析グレードのトリプシン(0.5 μg/μL)をトリプシンでチューブに加えます:タンパク質比1:10。一晩37°Cでサンプルを消化します。
    6. 5%トリフルオロ酢酸(TFA)と渦を10μL加えます。37°Cで90分間インキュベートします。この工程は、質量分析中の干渉を防止するために、酸不安定界面活性剤を加水分解する必要がある。
    7. サンプルを4°Cで30分間遠心分離し、g上澄みをクロマトグラフィー認定クリアガラスバイアルに移し、プリスリットテフロン/シリコーン中隔キャップを使用します。サンプルは、質量分析分析の前に-20 °Cで保存することができます。
    8. サンプルバイアルを液体クロマトグラフィーに供し、高精細質量分析法と結合する。

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結果

胚性SCGニューロンの神経培養の分離と維持
ラット胚SCGからの解離細胞は、ポリD-リジン被覆板またはカバースリップでめっきし、b神経成長因子を含む血清遊離培養培地中に維持した。ニューロンとグリア細胞の混合物を含む解解化細胞は、めっき時に円形に見える(図1A)。めっきの24時間以内に、ニューロンは位相コントラスト顕微鏡の下で位相暗くグリア細胞を平坦化して現れる小軸索プロセスを拡張する(図1B)。Ara-Cによる治療の後、99%のグリア細胞が排除され、培養物には楕円形の細胞体、広範な軸索成長および樹状突起のない主に神経細胞が含まれている(図1C)。

培養胚ラット優子宮頸神経細胞の免疫細胞化学的染色
これまでの研究では、無血清培地で増殖した培養交感神経は軸索のみを拡張し、基基膜抽出物の存在下で精巧な樹状樹状樹状樹状の樹状樹状の樹状...

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ディスカッション

本論文では、胚性ラットの上位脳神経節から交感神経を培養するためのプロトコルについて述べている。このモデルシステムを用いる利点は、成長因子に対して同様の応答を提供するニューロンの均質集団を得ることができることであり、またこれらのニューロンに対する成長因子要件が十分に特徴付けられているため、これらのニューロンを定義された培地において、無血清条件下で成長させることができる。プロトコルは、SCGをE21ラットの子犬から隔離するプロセスを記述しているが、このプロトコルは、E17からE21へのラットの子犬からのSCGの解剖および胚マウスSCG10、22、2322,23の解剖のために使用10することができる。この解剖プロトコルは、初期ステップにわずかな変更を加えた出生後ラットからSCGを単離するためにも使用することができる。これらの改変は、Cセクションの必要性の排除、二酸化炭素を用いた出生後動物の安楽死、および70%ア...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの教員開発基金とサマーリサーチプログラム助成金によって支援されました。著者らはまた、カリフォルニア大学デービス校のパメラ・レイン博士とUCバークレー質量分析施設のアンソニー・イアバロン博士に、これらのプロトコルの開発中に助言を求めて感謝したいと考えています。著者らはまた、ビデオ制作と編集に関する彼女の助けのためにカリフォルニア州セントメアリーズカレッジのカレッジコミュニケーションズオフィスのヘイリー・ネルソンに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2D nanoACQUITYウォーターズコーポレーション
重炭酸アンモニウムSigma-Aldrich9830
BMP-7R&D Systems354-BP
ウシ血清Sigma-Aldrich5470
細胞スクレーパーCorningCLS-3010
コラゲナーゼWorthington Biochemical4176
Corning Costar または Nunc 平底 細胞培養プレートフィッシャーサイエンティフィック07-200、140675、142475
シトシン &β;- D-アラビノフラノシドSigma-AldrichC1768
D-リン酸緩衝生理食塩水(カルシウムおよびマグネシウムフリー)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - 低グルコース + グルタミン、+ ピルビン酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック11885
脂肪酸フリー BSAカルバイオケム126609低グルコース DMEM
ファイン鉗子 デュモン no.4 および no.5テッド ペラインク 5621、5622
解剖用鉗子およびはさみテッド ペラ インク1328、1329、5002
ガラス カバーリップ - 12mmノイビトロ コーポレーションGG-12
ヤギ抗マウス IgG Alexa 488 結合型サーモフィッシャーサイエンティフィックA32723
ハムの F-12 栄養ミックスサーモフィッシャーサイエンティフィック11765
ハンクスバランスソルトソルト ソルトソルト フィサイ14185
スリン-セレン-トランスフェリン (100X)サーモフィッシャー サイエンティフィック41400-045
ヨードアセトアミドSigma-AldrichA3221
L-グルタミンサーモフィッシャーサイエンティフィック25030
リーボビッツ L-15 培地サーモフィッシャーサイエンティフィック11415064
ガラスカバースリップ用封入剤サーモフィッシャーサイエンティフィックP36931, P36934
マウス抗MAP2抗体 (SMI-52)BioLegendSMI 52
神経成長因子Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μDMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicillin-Streptomycin (100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% 溶液、100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1mg
Synapt G2 高精細質量分析ウォーターズコーポレーション
トリフルオロ酢酸 - シーケンシンググレードサーモフィッシャーサイエンティフィック2890410 X 1 mL
トリトン X-100シグマ-アルドリッチX100
トリプシンプロメガまたはNEBV511A、P8101S100 μgまたは5 X 20 mg
Waters Total Recovery VialsWaters Corporation186000385c
アルミ ッシャー エンティフィック イン

参考文献

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).

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