Method Article

マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

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1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

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提示は、マイクロベシクルおよびエキソソームの効果的な濃縮および分離のための紙ベースのデバイスを製造するためのプロトコルです。

Abstract

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マイクロベシクルおよびエキソソームは、細胞外環境に放出され、全身に循環する小さな膜小胞である。DNA、mRNA、miRNA、タンパク質、脂質などの様々な親の細胞由来生体分子が含まれているため、その濃縮と単離は、臨床応用の潜在的なバイオマーカーとしての活用に不可欠なステップです。しかしながら、従来の分離法(例えば、超遠心分離)は、微小胞およびエキソソームに重大な損失および損傷を引き起こす。これらの方法では、試薬の超遠心、荷重、および無駄の複数の繰り返しステップが必要です。本稿では、マイクロベシクルとエキソソームの効果的な濃縮と分離を簡単に行えるように設計された折り紙ベースのデバイス(Exo-PAD)を製造するための詳細な方法について説明します。収束したサンプル領域を持つアコーディオンのような多折層からなるExo-PADのユニークなデザインは、イオン濃度偏光技術と統合され、それによって特定の層上の微小胞およびエキソソームの5倍の濃縮を可能にする。さらに、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームは、単にExo-PADを展開することによって分離されます。

Introduction

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マイクロベシクルとエキソソームはそれぞれ0.2-1 μmと30-200 nmの小膜小胞です。それらは、いくつかの異なる,細胞タイプ1、2、3、4、52,3,によって細胞外環境に分泌される。145それらはDNA、mRNA、miRNA、タンパク質、および脂質のサブセットの形態の親の細胞情報を含み、血清、血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液66、7、8、97,8,9のような様々な体液を介して全身を循環する。このように、生物学的流体からの微小胞およびエキソソームを効率的に単離する技術は、疾患の診断、予後、およびリアルタイムモニタリングの分野において、ならびに新しい治療薬の開発において広範な機会を提供することができる。

しかし、超遠心分離に基づくミクロベシクルおよびエキソソームの従来の分離法は非常に時間がかかり、サンプルの著しい損失および汚染を引き起こす。これは、超遠心,,,55、6、10、11、126を繰り返した様々な試薬の、いくつかの面倒なピペットとローディングステップと廃棄を伴うからです。101112また、超遠心分離(〜100,000 x g)によって引き起こされる高剪断応力は、微小胞およびエキソソームの物理的なリシスを引き起こし、回復率が低い(5−23%)6、13、14を生じる。6,13,14そのため、損傷や損失を低減するために、マイクロベシクルおよびエキソソームの非常に効率的で目立たない分離技術を開発し、より高い回収率を達成する必要があります。

折り紙ベースのデバイス (Exo-PAD) は、マイクロベシクルとエキソソームの分離を簡単に、より穏やかで、高効率に開発しました。Exo-PADの設計は、直径が徐々に減少する連続的に接続されたサンプル領域を有する多重折紙である。このユニークな設計と統合された、電位分子を事前濃縮するナノ電気運動現象であるイオン濃度偏光(ICP)技術。Exo-PADを使用すると、特定の層の微小胞とエキソソームの5倍の濃縮と、単にデバイスを展開するだけで分離しました。この記事では、Exo-PAD について詳細に説明し、デバイスの全体的な製造と操作からその使用の分析まで、その方法を説明し、代表的な結果6を示します。

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Protocol

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1. デバイスの製造

  1. プリンタソフトウェアを使用して用紙に印刷する領域を定義します ([資料一覧] )。
    注:設計には12のワックスパターンの層があり、円形サンプル領域の直径は5mmから2mmに徐々に狭くなります(図1A)。
  2. セルロース紙の両面の指定領域に疎水性ワックスを印刷し、市販のワックスプリンタ(材料表)を使用して(図1B)。
  3. ワックスプリント紙を120°Cの80sの実験用オーブンに入れます。
    注:このステップは、印刷されたワックスの熱リフローを達成することによって、ワックスが紙の内側に到達することを可能にします。このインキュベーションプロトコルでは、パターンの分解能は〜2mmです。したがって、2mm未満のパターンを印刷しないように注意してください。
  4. ワックスプリントの紙をカッターで切って、個々のデバイスを作ります(図1C)。
  5. 5 μL および 2 μL の透過性膜(例えば、ナフィオン;資料一覧)それぞれ、左端と右端のレイヤーのサンプル領域に(図1D)
  6. パーミセレクティブ膜でコーティングした層をホットプレートの上に70°Cで30分間置き、透過膜溶媒を蒸発させます。
  7. 緩衝液に面したコーティングされた層の最表面を感圧テープで密封し、小さな穴を残します。
  8. 印刷した個々のデバイス(Exo-PAD)を白い線に沿って前後に折り畳みます。
    メモ:デバイスを折りたたむと、すべてのサンプル領域が収束接続されます(図1E)。この収束設計は、電圧がICPに印加される際に電界線に焦点を当て、マイクロベシクルおよびエキソソームのより集中的な事前集積を達成する。

イオン濃度分極による微小胞とエキソソームの濃縮と空間的焦点化

  1. ミクロベシクルおよびエキソソームサンプルの15 μL(0.1x11リン酸緩衝生理食塩水[PBS]0.1x 0.05%Tween 20)の15μLを、ピペット処理によって収束サンプル領域に負荷し、数秒待ってすべてのサンプル領域を完全に濡らします(図1F)。
  2. Exo-PADの両端に2つのアクリルチャンバーを置き、展開を防ぐために小さなバインダークリップでExo-PADをしっかりとクランプします(図1G)。
  3. チャンバに0.1x PBSの110 μLを充填し、Ag/AgCl電極を2個挿入します(図1H)。
  4. 電流電圧源測定システム(材料表)を使用して、電極に30Vを20分間塗布します。
    注:印加電圧はICP現象を発生させ、Exo-PADの8および9の層にマイクロベシクルとエキソソームを事前に濃縮します。

3. 濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームの分離

  1. 折りたたまれたExo-PADをアクリルチャンバーから分離し、デバイスを展開して濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを他の層から分離する(図1I)。
  2. 下流解析のために、マイクロベシクルとエキソソームが豊富に含まれるレイヤー8と9のサンプル領域をパンチアウトします(図1J)。

4. 走査型電子顕微鏡解析

  1. 0.1 Mのカコチル酸ナトリウムバッファーに2.5%のグルタルアルデヒド、1.1 Mのカコチル酸ナトリウムで1%の四酸化オスミウムに1時間浸漬することにより、濃縮されたミクロ胞およびエキソソームを固定します。
    注意:四酸化オスミウムは非常に有毒で有害な化学物質です。四酸化オスミウムはプラスチックに浸透することができるので、ガラスに保管する必要があります。四酸化オスミウムの任意の取り扱いは、二重ニトリル手袋と化学ヒュームフードで行われなければなりません。
  2. 200個の証拠エタノール(すなわち、50%、70%、90%、および100%)の上昇グレードで固定マイクロベシクルおよびエキソソームを脱水するそれぞれ30分間。
  3. ヘキサメチルジシルラザンに30分間乾燥剤を浸してサンプルを化学的に乾燥させます。
    注意:ヘキサメチルジシルラザンは可燃性で湿気に敏感な化学物質です。それは点火源から離れて乾燥し、換気の良い区域に貯えられる必要がある。
  4. 完全に乾燥したマイクロベシクルとエキソソームを金/パラジウム(〜20nm)で植え付け、スパッタリングを介して、走査型電子顕微鏡(SEM)画像をキャプチャします。

5. ナノ粒子追跡解析

  1. デバイス操作の20分後に生検パンチを使用して、サンプル領域をレイヤー6、8、および10でパンチアウトします。
  2. 各パンチアウト領域をバッファ溶液(0.01%Tween 20で0.1x PBS)に浸します。
  3. 渦は10分間、遠心分離機は6,000rpmで30s、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを再中断する。
  4. 溶液からパンチアウト領域を取り除き、ナノ粒子追跡解析(NTA)機器(材料表)によってマイクロベシクルおよびエキソソームの濃度を測定する。

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Results

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濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームの最大の回収率を達成するために、操作時間を最適化する必要があります。時間が不十分なため、微小胞やエキソソームの十分な移動が可能で、富化が低下するのに対し、過度の時間は空間的な集着を悪化させ、したがって微小胞およびエキソソームを分散させる。したがって、時間最適化ステップを通じて、マイクロベシクルとエキソソームの最大事前集積因子と、マイクロベシクルとエキソソームが最も豊かにされる最終位置を同定することができる。マイクロベシクルおよびエキソソームの最終的な位置を見つけるために、蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス移動を顕微鏡で観察し(図2A)、全てのサンプル領域の蛍光強度をImageJソフトウェアを用いて定量した(図2B)。濃縮処理(図2A、0分)の前に、マイクロベシクルおよびエキソソームは、紙マトリックスのわずかなフィルタリング作用のために強度が徐々に減少して、すべてのサンプル領域に分散した(<...

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Discussion

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Exo-PADはマイクロベシクルおよびエキソソームの濃縮および分離のために正常に使用されましたが、いくつかの重要な点を慎重に検討する必要があります:1)デバイス調製中のオーブンインキュベーション時間と温度、2)処理時間、3)様々な層数とサンプル面積径の電圧の適用、および4)臨床サンプルへの適用性。

プロトコルで与えられたインキュベーション時間と温度は、信頼性の高いデバイスを製造するために最適化された条件です。より長いインキュベーション時間または高温は、プリントされたワックスの過度のリフローのために収束設計の歪みを引き起こす可能性があります。これにより、電界線の形成を防ぎ、エレクトロキネティックエンリッチメントプロセス中の移動抵抗を増加させます。

処理時間は、最大の濃縮と分離を考慮する要素でもあります。<20 分の処理時間は、マイクロベシクルおよびエキソソーム移行を可能にする十分な時間がないため、事前濃度が低下します。一方、処理時間が20分の場合、焦点の効率が低下し、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームの分散が可能になります...

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この研究は、韓国国立研究財団、グラントNRF-2018R1D1A1A09084044によって支援されました。J.H.リーは、2019年に光明大学からの研究助成金によって支援されました。キム・ヒエリンは、韓国産業振興機構(KIAT)が運営する韓国産業エネルギー省の「産業専門家コンピテンシー開発プログラム」の支援を受けました(No.P0002397、ウェアラブルスマートデバイスの産業コンバージェンスのためのHRDプログラム)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl電極A-M Systems, Inc.531500直径0.15インチ
ウシ血清由来のアルブミン(BSA)、Alexa Fluor 594コンジュゲートサーモフィッシャーサイエンティフィックA13101BSAとAlexa Fluor 594(Ex/Em:590/617 nm)
炭酸塩-重炭酸バッファーSigma-AldrichC3041-50CAP炭酸塩バッファー
CorelDrawソフトウェア(Coral Co.、カナダ)Corel Corporationワックス印刷を定義するプリンターソフトウェア地域
ColorQube 8870Xerox Corporationワックスプリンター
クロマトグラフィー紙 グレード 1Whatman3001-861セルロース紙、寸法: 20 * 20 cm
蛍光標識エクソソーム標準HansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100FITCラベル付きエキソソーム(Ex/Em:490/520 nm)
ケースレー2410型電流/電圧源計Keithley Instruments, Inc.現在–電圧源測定システム
Nafionパーフルオロ樹脂溶液Sigma-Aldrich31175-20-9透過膜、低級脂肪族アルコールと水の混合物で20重量%、水34%を含む
NanoSight LM10NanoSight Technologyナノ粒子追跡分析(NTA)装置
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)サーモフィッシャーサイエンティフィック10010001
、

References

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