このプロトコルは、細胞の生存率を効率的に決定するための、高速で高スループット、信頼性、安価、および公平なアッセイを記述します。このアッセイは、細胞のミトコンドリアが損傷し、他のアッセイに干渉する場合に特に有用である。このアッセイは、Hoechst 33342とヨウ化プロピジウムの2つの核染料で染色された細胞の自動カウントを使用します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
発癌性転換へのミトコンドリアの寄与は、広い関心と活発な研究の対象である。がん代謝の分野が複雑化する中で、ミトコンドリアの損傷を与える様々な化合物(いわゆるミトカン)を用いてミトコンドリアを標的にするという目標が非常に人気を集めています。残念なことに、テトラゾリウム塩やレサズリンに基づくものなど、多くの既存の細胞傷害性アッセイは、その性能のために機能的なミトコンドリア酵素を必要とします。ミトコンドリアを標的とする化合物によって与える損傷は、しばしばこれらのアッセイの正確さを損なう。ここでは、2つの蛍光色素による微分染色に基づく改変プロトコルについて説明するが、そのうちの1つは細胞透過性(Hoechst 33342)であり、他方は(ヨウ化プロピジウム)ではない。染色の違いにより、生きている細胞と死んだ細胞を区別することができます。このアッセイは、自動顕微鏡検査と画像解析に適しており、スループットを向上させ、バイアスを低減します。これにより、アッセイは96ウェルプレートを使用してハイスループットの方法で使用することができ、特に問題の薬物がある程度の有糸分裂性がある場合には、創薬の取り組みに実行可能な選択肢となる。重要なことに、Hoechst/PI染色アッセイによって得られた結果は、トリパンブルー排除結果と、アッセイが他の方法と比較されたときに生物学的複製の間の両方で、一貫性の増加を示す。
概要
効果的ながん治療を特定するための最初のステップは、治療の効果を調べるために使用できる堅牢で公平な細胞傷害性アッセイの選択です。低スループット実験の一般的な選択肢は、生細胞からのトリパンブルー染料の除外です。この方法は、細胞生存を定量化するための比較的公平な方法を可能にするので好ましい。trypanブルーは、膜が損なわれている細胞に受動的に拡散するが、健康な細胞1に入るのを効果的に遮断される。生きている細胞と全細胞の商は、治療の有効性を示す生存率の割合を表す。trypan blue アッセイの最も大きな欠点は、高スループットの方法論に適していることです。それは比較的低い信号対雑音比を有し、長期染色は、生存細胞の染色のために人工物をもたらす可能性がある。したがって、trypan blue の除外は通常、必ずしも2ではなく、手動カウントに降格されます。これはあまりにも遅くなり、研究者の主観的判断によるバイアスの可能性が強くなります(ブラインドまたは独立したカウントを使用しない限り、実験室のスループットをさらに低下させます)。一般に、このアッセイのスループットは、現代の創薬には不十分です。
一般的にスループットがはるかに高い生存アッセイは、研究者がこの制限を回避することを可能にしますが、重大な注意点が付属しています(表1を参照)。これらの方法は、一般的に2....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. 細胞毒性アッセイ: セットアップ
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
前述のプロトコルは、代表的な急性骨髄性白血病細胞株として取られたOCI-AML2細胞を用いて開発された。AMLは、骨髄26における未分化および非機能的造血細胞の異常増殖を特徴とする。AML標的療法の最近の発展にもかかわらず、ケアの水準は数十年間変わらず、誘導療法(典型的には3日間のアントラサイクリン、例えば、ダウノルビシン、イダルビシン、またはアントラセネジオンミトキサントロント座、および7日間のシタラビンの回復期から構成される)から成る)
図1Aに概説したプロトコルに従って、OCI-AML2細胞を96ウェルプレートに播種し、ミトコンドリアアンカボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)または解糖分解阻害剤2-デオキシDグルコース(2-DG)で一定の濃度で処理した。細胞を無血清RPMI-1640培地中で37°Cで24時間処理し、次いでトリパンブルー(TB)排除または4つの生存アッセイ(Hoechst.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
Hoechst/PI細胞毒性アッセイのプロトコルは堅牢で、比較的実践的な時間を必要としますが、正確な結果を確実にするために非常に重要な実験的な詳細がいくつかあります。まず、DMSOの濃度が0.5%(v/v)未満であることを確認することが不可欠です。DMSOの低用量への暴露は、細胞の形態および付着を実質的に変化させ、細胞周期進行を39,40に著しく遅らせることができるということは一般に合意されている。
第二に、染色は、処置後できるだけ早く行われるべきである。洗浄ステップがないので、化合物は井戸に残り、細胞に損傷を与え続けることができます。先のプロトコル35と比較して、細胞は15分間だけ染色された。これは、実行可能な細胞が誤ってヨウ化プロピジウムで染色される可能性を制限します。このため、2つ以上のプレートを処理する場合は、驚異的な治療と染色をお勧めします。これにより、プレート間の撮像時間が可能になり、再現性が向上します。<.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
がん研究のCPRIT学者であるNVKは、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)の寛大な支援、CPRIT助成金RR150044に感謝します。この研究は、ウェルチ財団研究助成金C-1930、およびNVKに授与された国立衛生研究所R35 GM129294によっても支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-デオキシ-D-グルコース/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-ブロモ-ピルビン酸 | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96ウェルプレート | Greiner Bio-One | 655090 | 黒色または透明平底96ウェルプレート |
| Alamar blue HS細胞生存試薬(100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II 全自動セルカウンター | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; 最終濃度 1:1,000 |
| HyClone ウシ胎児血清 | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-クロロフェニルヒドラゾン/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS 錠剤 | サーモフィッシャー | BP2944100 | 1 錠 + 滅菌水 200 mL = 1x PBS 溶液 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | サーモフィッシャー | 50-103-5952 | |
| ヨウ化プロピジウム | サーモフィッシャー | 50-596-072 | 乾燥粉末;PBSに1 mg / mLをストック;最終濃度5 &g / mL(白血病細胞)、1およびマイクロ;g/mL (正常 PBMC) |
| ロテノン | アーク ファーム | AK115691 | |
| RPMI-1640 中 L-グルタミンと重炭酸ナトリウム、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適しています | シグマ アルドリッチ | R8758-500ML | |
| チアゾリル ブルー テトラゾリウム ブロマイ | ド アクロス オーガニックス | AC158990010 | |
| トリパン ブルー ステイン (0.4%) | ギブコ | 15250-061 | |
| 細胞株 | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML細胞株 |
| MOLM-13 | ATCC | AML細胞株 | |
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL細胞株 |
| OCI-AML2 | ATCC | AML細胞株 |
参考文献
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
