このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ 胚および画像核内アクチン棒集合体にローダミン共役球状アクチンを注入することです。
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この記事について
サマリー
要約
このプロトコルの目的は、熱ストレスに続く生きたショウジョウバエメラノガスター胚に集まり、核内アクチン棒を可視化することです。アクチンロッドは、神経変性疾患を含むヒト病理に付随する保存された誘導アクチンストレス応答(ASR)の特徴である。以前は、ASRが形態形成の失敗と胚の発達の生存率の低下に寄与することを示した。このプロトコルは、イメージング、遺伝学および生化学に非常に適したモデルシステムにおけるアクチンロッドアセンブリおよびASRの基礎となるメカニズムの継続的な研究を可能にする。胚は回収され、注入のためにそれらを準備するためにカバースリップに取り付けられる。ローダミン共役球状アクチン(G-アクチンレッド)を希釈し、マイクロニードルに装填する。各胚の中心に1回の注射が行われる。注射後、胚は高温でインキュベートされ、核内アクチン棒は共焦点顕微鏡で視覚化される。光漂白(FRAP)実験後の蛍光回復はアクチン棒に対して行われ得る。細胞質中のアクチンが豊富なその他の構造も画像化することができる。我々は、G-アクチンレッドが内因性G-アクチンのように重合し、単独では正常な胚の発達を妨げないことを発見した。このプロトコルの1つの制限は、胚への重大な傷害を避けるために注射中に注意を払わなければならないということです。しかし、練習では、ショウジョウバエ胚にG-actinRedを注入することは、アクチンロッドを視覚化するための迅速かつ信頼性の高い方法であり、任意の遺伝子型のハエや低酸素症や酸化ストレスを含む他の細胞ストレスの導入で簡単に使用することができます。
概要
このプロトコルは、誘導アクチンストレス応答(ASR)1を受けている熱ストレス胚における核内アクチン棒の集合体を可視化するためにG-アクチンレッドを注入する方法を説明する。我々は、胚において形態形成の破壊および生存率の低下をもたらすASRの研究を支援するためにこのプロトコルを開発し、成人のヒト細胞型は腎不全2、筋筋筋症3、アルツハイマー病およびハンチントン病4、5、6、7、8を含む病理に関連している。このASRは、ヒートショック9、10、11、酸化ストレス4、6、および異常ハンチンチンまたはβアミロイドオリゴマー化4、5、6、7、9、13、14、15、16を含む多数の細胞ストレスによって誘発される。ASRの特徴は、アクチン相互作用タンパク質のストレス誘発過活性化によって駆動される細胞質または影響を受ける細胞の核のいずれかに異常なアクチン棒の組み立てであり、Cofilin1、5、6、10。残念ながら、ASRに関する重要な知識のギャップは残っています。例えば、アクチン棒の機能は知られていない。私たちは、いくつかの細胞型の細胞質にロッドが形成される理由を理解していないが、他の人の核。また、ASRがストレスを受けている細胞や胚に対して保護的または不適応であるかどうかも明らかではない。最後に、コフィリンの過剰活性化やアクチンロッドアセンブリの根底にある詳細なメカニズムはまだ分かりません。したがって、このプロトコルは、生きたフルーツフライ胚の非常に難しい実験システムにおけるアクチンロッド形成およびダイナミクスを視覚化することによってASRを探査するための迅速かつ汎用性の高いアッセイを提供する。
生きているショウジョウバエ胚にG-アクチンレッドをマイクロインジェクトするプロトコルは、組織構築イベント中に正常な細胞質アクチン構造17のダイナミクスを研究するために最初に開発された。これらの研究では、G-アクチンレッド注射は、サイトカネシスまたは胃の17、18を含む胚の初期の発達過程に悪影響を及ぼさないことを発見した。その後、プロトコルを変更し、ASR1を受けている熱ストレス胚のアクチンロッドのイメージングを可能にするために、胚処理およびG-アクチンレッド注入を適応させる。G-アクチン赤注射以外の他の方法は、胚中のアクチンを視覚化するために使用することができる。これらの方法は、アクチンまたはウトロフィン-mCherry、ライフアクト、F-トラチンGFP、およびモージンGFPなどのアクチン結合タンパク質のドメインにタグ付けされた蛍光タンパク質(FP)を発現させることに依存している(19でレビュー)。しかし、これらのFPプローブを使用すると、いくつかのアクチン構造を安定または破壊する可能性があるため注意が必要であり、すべてのアクチン構造20に等しくラベルを付け、アクチンGFPの場合は、応力依存だけでなくアクチン濃度依存性のロッドアセンブリの分析に問題がある。したがって、G-アクチンレッドは、フライ胚のロッド研究のための好ましいプローブであり、胚の大きなサイズは、その容易な注射を可能にする。
このプロトコルのワークフローは、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27にタンパク質、核酸、薬物、および蛍光指標を注入するために使用されてきた他の確立されたマイクロインジェクション技術に似ています。しかし、ここでのG-アクチンレッドのマイクロインジェクションに続いて、胚は、ASRおよび核内アクチン棒集合体を誘導するために軽度の熱ストレスにさらされる。ハエや注入リグにアクセスできるラボでは、異なるストレスによる誘導や、異なる遺伝的背景での変調など、ASRに関する特定の研究ラインに対して、この方法を容易に実装し、適応可能にする必要があります。
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プロトコル
1. 胚コレクションカップとリンゴジュース寒天プレートを準備する
- 注射実験の5日前に、28 を構築するか、または少なくとも2つの小さな胚採取カップを調達する。小さなコレクションカップ28で使用される新鮮な60ミリメートルリンゴジュース寒天プレートを作ります。4°Cで湿ったペーパータオルで覆われたプラスチック製の箱にプレートを保管してください。
注:ステップ1.3で説明したようにフライ番号が設定された小さな胚コレクションカップは、実験ごとに十分な胚数を提供すると同時に、胚の取り扱いと注射を早期発達段階のイメージングを可能にするのに十分な時間で行うことができるようにします。 - 18°Cにリンゴジュースプレートを温め、プレートの中央に酵母ペーストのダブを追加します。酵母ペーストは、活性酵母と蒸留水の簡単なペーストです。
- 最も寛大な産卵を促進するために、実験の2日前にハエとコレクションカップを設定します。コレクションカップに少なくとも100匹のメスと50匹の雄のハエを加え、準備されたリンゴジュースプレートを上に付けます(図1、ステップ1)。注射実験に至るまでの日には、リンゴジュースプレートを1日に少なくとも2回、朝に1回、夕方に1回変更します。
注:胚の採取のコップが12時間のライトオン/ライトオフサイクルで18°Cに保たれている場合、最良の注入および画像化の結果が得られる。
2. マイクロインジェクション用G-アクチンレッド の作業ストック溶液を準備する
注:この準備は、G-actinRedの5mg / mL作業ストックの2μLしか作らず、マイクロインジェクション技術に慣れていない場合は、ステップ3にスキップして、貴重な作業ストックを節約するために中性のpHバッファでマイクロインジェクションを練習することが有利です。ベンダーのG-actinRed の10 μgストックは、最大6ヶ月間、4°Cで乾燥剤の〜500 gの16オンススクリュートップジャーに元の包装に保管することができます。
- G-バッファストックソリューションを事前に準備します:5 mM Tris-HCl、0.2mM CaCl 2、pH 8.0。フィルターを使用し、室温で保管します。
- 注射の日に、ステップ2.1からGバッファストックを使用して氷上の新鮮なスナップキャップマイクロ遠心分離管にGバッファ作業溶液の1 mLを準備し、示された最終濃度で次の補充:1 mMジチオスライトール(DTT)および0.2 mMM ATP、pH 8.0。
注:Gバッファ動作ソリューションの1 mL量は、実験に必要なもの以上ですが、準備を簡素化します。実験後に超過分を破棄するか、ユーザーが好みに応じてスケールダウンできます。- 氷の上に10 μgのG-actinの赤 いストックを保ち、最初にチューブの中のG-actinRed のピンクの液滴の上にろ過された蒸留水の1 μLを加えます。
- 次に、ステップ2.2から冷たく、作りたてのGバッファ作業溶液を1μL加えます。ピペットのボリュームを1 μLに設定してよく混ぜ合わせるため、上下に20回ピペットを入れる。G-actinレッド ストックは5mg/mLの最終希釈になります。
- 準備したG-アクチンレッド を氷の上で30分間インキュベートします。
- 遠心分離機は、マイクロ遠心分離機で4°Cで20分間16,000xgで調製したG-アクチンレッドを任意の沈殿物を除去する。
- 慎重に氷の上に新鮮なスナップキャップマイクロ遠心チューブに上清の1.5 μLをパイプし、濃いピンクのペレットを避けます。
- マイクロニードルにロードする準備ができるまで、準備したG-actinレッド 上清を氷の上に最大6時間保管してください。
注:マイクロニードルは、マイクロピペットの引き手で事前にキャピラリーチューブから引っ張ることができ、その後、100 x 20ミリメートルペトリ皿にモデリング粘土のストリップに室温で保存することができます。マイクロニードルプルの推奨パラメータは、ピペットクックブック29にあります。
3. 胚を収集し、注射用にマウント
- ハエが18°Cの酵母ペーストでリンゴジュースプレートに30分間胚を置くことを許可します。
- ハエが横たわっている間、 酵母ペーストのない リンゴジュース寒天プレートを室温に事前に温め、かみそりの刃でリンゴジュース寒天の4cm x 1cmの長方形のくさびを切り取り、25mm x 75 mmのガラススライドに置きます。
- 30分採取およびデコールリオネート胚から採取した収穫プレートは、新鮮な漂白剤を注ぎ込み、蒸留水で1:1希釈し、プレート上に1分間旋回し、28(図1、ステップ2)に記載するようにプレートを旋回させた。
注:漂白剤の異なるブランドは、異なる濃度で販売されています。ここで使用される漂白剤は、ボトルから6%次亜塩素酸ナトリウムであり、3%次亜塩素酸ナトリウムの最終濃度に希釈されます。わずかに低い濃度で他の漂白剤ブランドも同様にうまく機能します。 - 漂白剤とデコリオネート胚を回収バスケット(70μm細胞ストレーナー)に注ぎ、噴出ボトルの蒸留水でプレートを2回リンスし、これらのくすを回収バスケットに加えます。
- 酵母の塊が見えず、ペーパータオルに点がけられたときに余分な漂白剤からピンクの跡が残らないまで、蒸留水で採取バスケット内のデコリオネート胚を精力的に洗浄する。
- 30分採取およびデコールリオネート胚から採取した収穫プレートは、新鮮な漂白剤を注ぎ込み、蒸留水で1:1希釈し、プレート上に1分間旋回し、28(図1、ステップ2)に記載するようにプレートを旋回させた。
- 蒸留水で湿らせた毛を持つ絵筆を使用して、デコリオネートを移し、コレクションバスケットからガラススライド上の準備されたリンゴジュース寒天ウェッジに胚を洗浄します。
- 細かい先端ピンセットまたは解剖針を使用して、長方形の寒天ウェッジの長い軸に沿って10個の胚を直線に並べ替えます(図1、ステップ3)。前極が右向きで、後側が研究者に向かうよう、胚を頭から尾に並べてください(図1、ステップ3、拡大)。
- P200ピペットチップの端部の0.5cmをカミソリの刃で切り取り、「胚接着剤」(28に記載)に浸す。幅5mmの領域(図1、ステップ4)を24mm×50mmの長方形のカバースリップの長い端に沿って寛大にコーティングし、乾燥させて接着剤を付けます。乾燥は〜30 sを取り、接着剤コーティングされた領域全体が濡れたり光沢なくマットに見えたら完了します。
注:少なくとも48時間前に「胚接着剤」を準備してください。28に記載されているようにシンチレーションバイアルで両面テープのストリップにn-ヘプタンを追加します。 - 「胚接着剤」が乾燥したら、カバースリップの端と胚の列の間に2〜3mmのスペースを残して、寒天の上に整列した胚の列の上にカバースリップ接着剤をそっと下に置きます。
注:カバースリップの端に近すぎる胚を貼り付けると、実験の過程で胚が乾燥しすぎる可能性があります。 - 胚が上を向いることができるようにカバースリップをひっくり返します。カバースリップの 1 つの長いエッジに沿って、そしてカバースリップの最も近い端に向かう腹側領域 (図 1、ステップ 4、拡大) に沿って、ラインで立ち往生する必要があります。
- 16オンスのスクリュートップジャーに保存された新鮮な青の乾燥剤の150 gの上に優しく胚でカバースリップを置くことによって胚を乾燥させる。蓋をしっかりとねじ込み、8~10分間インキュベートします(図1、ステップ5)。
- 乾燥後、デシカンジャーからカバースリップを取り出し、カバースリップの各短い側を顕微鏡スライドにテープで貼り付け、胚側を上にして、2枚の4cm2片の両面テープを使用して、胚カバースリップが注入段階に収まるようにする(図1、ステップ6)。
- パツールピペットを使用した2~3滴のハロカーボン27オイルを加えて、整列した胚を覆い、さらに脱水から保護する(図1、ステップ6)。
4. アクチンロッド形成を促進するために、胚を注入し、熱する
注:すべての注入は18°Cの温度管理された部屋で行われる。
- ガラスペトリ皿から湿度の高いインキュベーションチャンバーを少なくとも100mm x 20mmの大きさで準備し、蒸留水で湿らせたラボティッシュワイパーのねじれでチャンバーに並ぶ(図1、ステップ8)。32°Cでインキュベーションチャンバーを予熱するか、または胚を注入する前に所望のインキュベーション温度を温める。
- マイクロインジェクタ用の気流弁を開き、マイクロインジェクタをオンにします(圧縮空気またはハウスエア、圧力が90psi以上で適しています)。
- 胚が乾燥している間、マイクロローダーチップを使用して、以前に準備されたG-アクチンレッド 上清をマイクロニードルにバックロードします。ピペットを1-1.5 μLに描画するように設定します。
注: アクチンの粘性のため、積み込み量が正確でない場合があり、少なくとも1~2マイクロニードルをロードするのに十分なアクチンが残っている可能性があります。マイクロニードルが適切に較正され、実験の過程で詰まっていない場合、ロードされたマイクロニードルあたり最大60個の胚を注入することができます。 - マイクロニードルを針ホルダーに取り付け、ネジを締めます。マイクロインジェクターにエアチューブを接続し、マイクロニードルの逆流圧力が30 hPaに平衡していることを確認します。
- マイクロインジェクターの設定を調整して、スライドマイクロメータ上にG-アクチンレッド (〜500 pL)の直径100μmの気泡を出します。マイクロインジェクターで圧力ノブ(500-1500 hPa)と射出パルスタイムノブ(0.1-0.5 s)を回転させて、適切なバブルサイズを得る。アクチン粘度とマイクロニードルチップサイズの変動を考慮して、新しいマイクロニードルがロードされるたびにこれらの設定を調整します。
注:準備されたG-アクチンレッド は粘性であり、胚を注入する前に排出されるべきマイクロニードルの先端に空気があるかもしれません。G-アクチンレッド がマイクロニードルの先端から容易に排出されない場合は、スライドマイクロメーターの端にマイクロニードル先端をそっと壊します。 - 取り付けられた胚を持つスライドを顕微鏡のステージに置きます。
注:設定されたすべての注入は異なるので、研究者はそれに応じて注射方法を調整する必要があります。ここで胚は静止したマイクロニードルに対して移動し、胚をマイクロニードルに動かして各胚を注入する。 - マイクロマニピュレーターのステージと10倍の目的の焦点を光顕微鏡で調整し、胚が見えるようにします。胚は、ビテリン膜の輪郭が最も鋭く、胚が最も大きく見えるとき、正しい焦点面にある。正しい発達段階にある胚を注入して、注入後のインキュベーションが完了するまでに、クラッチのほとんどが所望の発達段階に達するように(例えば、ボウネスのステージ2-3 30 で胚を注入して、32°Cでの熱ストレス後の細胞化でロッドを観察する)。
- マイクロニードルコントロールを使用して、針を胚と同じ焦点面に持ち込みます。
注:マイクロニードルがステージまたはマイクロニードルを移動中にカバースリップに引っかかる場合、マイクロニードルはスライドに近すぎて正しい焦点面にありません。マイクロニードルは、カバースリップに平行で、かなりの角度ではなく、必要があります(図1、ステップ7)。 - マイクロニードルを胚に挿入して、腹側領域の真ん中、胚「赤道」で胚に当たる。マイクロニードル先端が胚の中央の内側に見えるときに、フットペダルまたは「注入」ボタンでトリガーインジェクション(図1、ステップ7)。
- G-アクチンレッド を一度注入し、ゆっくりとマイクロニードルを取り除きます。ステージを移動し、適切な発達段階の各胚について繰り返します。
注:Gアクチンレッド が注入され、細胞質のビットが胚から漏れ出す可能性があるため、胚の膨張は正常です。 - すべての胚が注入された後、準備された湿気の注入室に胚を入れてスライドを置き、蓋を閉じる(図1、ステップ8)。細胞化に達する胚を得ようとする場合、湿気の多いインキュベーションチャンバーで32°Cで60〜75分間胚を熱ストレスさせる。
注:インキュベーション時間は、熱ストレス胚の細胞化における棒の視覚化を可能にする注目されています。より低い温度31で発達が遅くなるので、非熱ストレス制御胚のインキュベーション時間は長くなります。これらの対照胚は、特定の実験の設計および問われる質問に応じて、18°Cまたは25°Cなどの温度で湿気の多いチャンバーでインキュベートすることができる。G-アクチンレッド が胚全体に拡散するのに必要な最小インキュベーション時間は30分です。
5. 共焦点顕微鏡による熱ストレス胚中の画像アクチン棒
- 胚が熱ストレスを受けている間、共焦点顕微鏡をオンにして、561 nmレーザーチャネルを選択します。
- 対物レンズ(推奨25倍、40倍、63倍)を作業位置に移動します。
- 熱を強調した胚をイメージングする場合は、加熱されたステージインキュベーターを32°Cの内部温度を達成するように設定する。 ポイントアンドシュートまたは赤外線温度計を使用して、目的またはその近くの温度を確認できます。
- インキュベーションが完了した後、湿気の高いインキュベーションチャンバーから注入された胚でスライドを取り外す(図1、ステップ9)。
- 素早く作業し、取り付けられた胚を付けたカバースリップをスライドに付着させるために使用された両面テープピースをそっとこじ取る(図1、ステップ9)。
注意:あまりにも多くの力が加えられるとカバーリップが簡単に粉々になる可能性がありますので、これらのステップ中は穏やかにしてください。 - 2枚の長さ2枚の長さのテープを2枚一緒に貼り付け、テープを半分に半分に切って2つのストリップ、2つのストリップ、2.5 x 0.5 cmの長さを作ります(図1、ステップ10)。
- 各テープストリップの長さの3分の2を最初のカバースリップに貼り付け、Halocarbon 27オイル(図1、ステップ10、オレンジ)の胚の両側に隣接し、テープストリップの3分の1が胚が貼り付けられている最初のカバースリップの端にぶら下がったままにします。手袋をはめた手を使用し、このステップ中に胚に触れないように注意してください。
- テープストリップの上に2つ目の長方形のカバースリップをそっと置き、カバーリップの間に胚を挟みます(図1、ステップ10、青)。25 mm のエッジを位置合わせしますが、幅を 1 cmずつずれ 50 mm の端に保ちます。
注:この2番目のカバースリップの完全な表面は、対物レンズに面する新しいイメージング表面 になりますので、この第2のカバースリップ表面に指紋やHalocarbon 27油を取得しないように注意してください。オフセットは、余分なハロカーボン27油を均等に胚を浸漬するために添加することができるように必要です。必要に応じて、2つのカバーリップがサンドイッチの上部で交う縫い目にHalocarbon 27オイルを加え、毛細血管作用によって胚をコーティングします( 図1、ステップ10の破線を参照)。 - カミソリの鈍い側でテープストリップの上にあるカバースリップの領域をそっとタップして、カバースリップをテープに付着します。
- カバースリップサンドイッチをひっくり返し、ラボのティッシュワイパーの上に置いて、画像表面を清潔に保ち、共焦点顕微鏡に運びます(図1、ステップ11)。イメージングの前にテープが両方のカバーリップに完全に貼り付けられていることを確認します。
- 加熱された段階が温度であることを確認し、反転顕微鏡を使用する場合は、選択した対物レンズに浸漬液を追加します。
- カバースリップサンドイッチを慎重にステージに配置して、新しい撮像面(2番目のカバースリップ)が浸漬液に触れるものであることを確認します(図1、ステップ11)。
注:必要に応じて、カバースリップサンドイッチを両面テープの2つの小片でステージに貼り付けて、カバーリップが加熱されたステージにうまく収まらない場合にイメージング中に不要な動きを防ぎます。 - 細胞化中の胚(Bownesステージ4a30)または透過光または蛍光のいずれかを使用した望ましい発達段階に焦点を当てる。
- 胚に焦点を当てたら、共焦点顕微鏡のレーザー取得モードに切り替え、必要に応じてレーザーパワーとゲイン、フレームサイズ、タイリング、投影設定を調整します。
- 胚の核の焦点面を通して表面図を撮り、核内アクチン棒を見つける。ロッドは、比較的暗い核の内側に明るい筋やドットとして複数の方向に表示される必要があります(図2A、2C)。
6. 代替画像実験
- FRAPを行い、核内アクチン棒の長さや細胞質のアクチン構造(細胞化中の血漿膜の毛穴の先端など)でのアクチンのターンオーバーを調べる。
- イメージングソフトウェアでは、実験を取得するファーロウ先端またはアクチンロッドの周りの長方形の領域を選択します。
- 矩形の集録領域内のアクチンロッドの中心の小さな正方形領域を漂白するために選択します。アクチンロッドの先端が見えるようにし、核内のロッドの正確な追跡を可能にするために、実験の過程で漂白を取得しないことを確認します。
- 漂白剤レーザーを50倍に設定し、漂白剤レーザーパワーを最大に設定します。
- 時間経過を選択して、最大ピクセルのドウェル速度で合計120秒までの画像を毎秒取得し、画像取得の最初の2秒後にレーザーを漂白するように設定します。
- データを定量化して、蛍光回復の半時間を決定する1.
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結果
胚処理の概略的なワークフローを 図 1に示し、代表的な実験のタイムテーブルを 表 1に示します。良好な実験結果の推定は、注入された10個の胚ごとに、見られる胚の少なくとも半分が正しい発達段階にあり、損傷を受けておらず、32°Cの熱ストレスを伴う堅牢なASRを示すということです。 このASRは、 図2A( 右パネル)の胚の代表的な表面図像に示すように、核内アクチン棒の組み立てによって証明される。アクチンロッドは、核内のいくつかの向き(画像平面に平行または垂直)で現れ、いくつかの焦点面を通して画像化することができます。それに比べて、18°Cでインキュベートされたコントロール胚はアクチン棒を表示しない(図2A、左パネル)。 図2Bに示すように、ロッドを含む原子核のパーセントを定量化できます。また、FRAP実験はロッド(図2C)
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ディスカッション
この方法の意義は、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27におけるマイクロインジェクションの確立されたプロトコルを利用して、ASRおよび付随するアクチンロッドアセンブリに関する新しい研究を可能にすることです。生きた胚にG-アクチンレッドを注入する主な利点は、ASRが様々な文脈下で研究できることである。将来の研究のために、これらの文脈は、変異型スクリーンの一部として他の遺伝子型の胚を注入するか、酸化ストレス4、32
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
著者らは、ソカック研究所でこの技術のパイオニアを助けたリリウ・ジェンとゼングイ・シューと、分析を支援したハサン・シーデの作品を感謝して認めている。この研究のための仕事はNIHからの助成金によって資金を提供される(R01 GM115111)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アデノシン三リン酸(ATP) | ミリポアシグマ | A23835G | G緩衝 |
| の成分 リンゴジュース、モッツ、64液量オン | モッツ | 014800000344 | リンゴジュースプレートの成分 |
| バクト寒天 | BD | 214010 | リンゴジュースプレートの成分 |
| 漂白剤、ピュアブライト殺菌剤、6.0%次亜塩素酸ナトリウム | KIKインターナショナル | 059647210020 | 胚の脱角化用 |
| 塩化カルシウム | ミリポアシグマ | C1016500G | Gバッファー |
| 細胞ストレーナーの成分, 70 μm | Falcon | 352350 | デコレーション胚の収集用 |
| 共焦点顕微鏡、LSM 880 34チャンネル、Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | 核内アクチンロッドのイメージング用 |
| 乾燥剤 | Drierite | 24001 | 胚用 |
| 解剖顕微鏡、Stemi 508 8:1ズーム付きステレオスコープ | ツァイス | 4350649000000 | 寒天ウェッジ上に胚を配置するため |
| 解剖針、 | フィッシャーサイエンティフィック | 08965A | 天ウェッジ |
| ジチオスレイトール(DTT) | ッシャーサイエンティフィック | BP1725 | Gバッファーの成分 |
| 両面テープ、スコッチパーマネント、0.5インチx 250インチ | 3M | 021200010323 | 胚の接着剤を作るため |
| 胚収集ケージ | ジェネッシーサイエンティフィック | 59100 | 成虫のハエの飼育と胚の収集用 |
| 細い先端ピンセット、デュモントピンセット、スタイル5 | 電子顕微鏡科学 | 72701D | 寒天ウェッジ上の胚の配置用 |
| ガラスキャピラリー、ホウケイ酸ガラス、薄い1mm×0.75mm | ワールド・プレシジョンズ・インク | TW1004 | マイクロニードル用 |
| ハロカーボンオイル 27 | ミリポアシグ | マH8773100ML | 胚の水分補給用 |
| 加熱ステージインキュベーター | ツァイス | 4118579020000、4118609020000、4118609010000 | 共焦点イメージング用 |
| ラボ組織ワイパー、キムワイプ | キンバリー・クラーク | 34155 | ラボティッシュワイパー |
| 光学顕微鏡、インボトスコップ 40C 逆位相コントラスト顕微鏡、再生品 | ツァイス | 製造中止 | 注射顕微鏡 |
| メチル-4-ヒドロキシ安息香酸 | ミリポアシグマ | H36471KG | リンゴジュースプレートの成分 |
| マイクロインジェクター、FemtoJet4x | エッペンドルフ | 5253000025 | マイクロインジェクター |
| マイクロローダーチップ、epT.I.P.S. 20 μL | エッペンドルフ | 5242956003 | マイクロニードルの装填用 |
| マイクロマニピュレーターと注射ステージ x,y,zダイヤル付き 針調整用 | Bernard Instruments, Inc (ヒューストン、テキサス州) | カスタム | マイクロインジェクションを行うため |
| マイクロピペットプーラー、モデルP-97、フレーミング/ブラウン | サッター インスツルメンツ | P97 | 毛細管を引っ張ってマイクロニードルを作るため |
| 顕微鏡カバーガラス 24x50-1.5 | フィッシャーサイエンティフィ | 12544E | 胚のマウント用 |
| 顕微鏡スライド、ライラックカラーフロスト、洗浄済み、25 x 75 x 1mm | フィッシャーサイエンティフィ | 22037081 | 注射用胚のマウント用 |
| n-ヘプタン | フィッシャーサイエンティフィック | H3601 | 胚接着剤のコンポーネント |
| 対物レンズ、10x | ツァイス | 製造中止 | 注射顕微鏡 |
| 用10倍対物レンズ対物レンズ、C-アポクロマート 40x/1,2 W Korr.FCS | Zeiss | 4217679971711 40x 水対物レンズ 共焦点 | |
| 対物レンズ用, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 油、水、シリコーンオイル、またはグリセリン浸漬用 (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x 混合液浸対物レンズ 共焦点 |
| 対物レンズ, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x 共焦点用油対物レンズ |
| 絵筆、ロバート・シモンズ 表現 E85 尖った ラウンドサイズ 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | 胚移植用 |
| ペーパータオル、クリネックス Cフォールドペーパータオル、白 | キンバリークラーク | 884266344845 | 吸い取り細胞ストレーナー用 |
| パスツールピペット、5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | 胚をオイルで覆うため |
| ペトリ皿、ガラス、100 x 20 mm | コーニング | 3160102 | 湿潤インキュベーションチャンバー用 |
| ペトリ皿、プラスチック、60 x 15 mm | VWR | 25384092 | リンゴジュースプレート用 |
| ピペット、エッペンドルフ リファレンス 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | マイクロニードルピペットチップのローディング用 |
| 、xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | カバースリップに胚接着剤を加えるため |
| カミソリ刃 | VWR | 55411050 | 寒天ウェッジ、テープ、ピペットチップの切断用 |
| ローダミン結合球状アクチン、ヒト血小板(非筋肉; 4x10 μg) | サイトスケルトン株式会社 | APHR-A | G-actin^Red |
| シンチレーションバイアル、20mL ガラスホウケイ酸、ポリエチレンライナーと尿素キャップ付き | フィッシャーサイエンティフィ | 033377 | 胚接着剤を作るため |
| スクリュートップジャー、16オン | ナルゲン | 000194414195 | 胚の乾燥用 |
| ステージマイクロメーター | 電子顕微鏡科学 602104PG | G-アクチン注射の量を校正するため | |
| スクロース | ミリポアシグマ | 840971KG | リンゴジュースプレートの成分 |
| ズマベース | ミリポアシグマ | T15031KG | Gバッファー |
| 酵母の成分、レサフレ酵母コーポレーション酵母、レッドスターアクティブドライ、32オン | レサフレ酵母コーポレーション | 117929157002 | 酵母ペーストの成分 |
参考文献
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