膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

サマリー

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。

要約

細胞膜系におけるタンパク質間相互作用は、細胞間相互作用からシグナル伝達まで、幅広い生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。環境信号のセンシングから生物学的応答まで代謝調節から発達制御へ。タンパク質相互作用の正確な構造情報は、膜タンパク質複合体の分子機構を理解し、これらのタンパク質を調節する非常に特異的な分子の設計に不可欠です。インビボおよびインビトロアプローチの多くは、タンパク質とタンパク質相互作用の検出と分析のために開発されています。その中でも構造生物学のアプローチは、原子レベルでタンパク質とタンパク質相互作用の直接的な構造情報を提供できる点でユニークです。しかし、現在の膜タンパク質構造生物学は、依然として洗剤ベースの方法に限られています。洗剤ベースの方法の主な欠点は、彼らのネイティブ脂質二重層環境が洗剤分子によって除去されると、しばしば膜タンパク質複合体を解別または変性させることです。膜蛋白質構造生物学のネイティブ細胞膜ナノ粒子系を開発しています。ここでは、AcrBのオリゴマー状態のケーススタディを用いて細胞膜上でのタンパク質相互作用の解析におけるこのシステムの使用を実証する。

概要

タンパク質相互作用(PPI)は、タンパク質の構造と機能の維持からシステム全体の調節に至る生物学全体で重要な役割を果たします。PPI はさまざまな形式で提供され、どのような種類の相互作用を形成するかに基づいて分類できます。そのような分類の1つは、同一のサブユニットまたはサブユニットとして作用する異なるタンパク質間の相互作用であるかどうかに基づくホモオリゴメリックまたはヘテロオリゴメリックである。別の分類は、相互作用が安定した複合体または過渡的な複雑な状態の形成につながる場合の相互作用の強さに基づいています。タンパク質間のPPIに関する構造情報は、タンパク質が機能するメカニズムを理解する上で非常に重要です。タンパク質の80%以上が、その機能的役割を果たすために複雑な形成に依存していると推定されている^。生物学におけるその重要性を適切に機能させるためにPPIに依存することが観察されたタンパク質の割合を考えると、容易に明らかであるが、タンパク質がPPIを形成しているときに実験的に観察できる技術の限界のために、これらの相互作用に関与するタンパク質を適切に調査できることは依然として困難である。

ノイズ、偽陽性、および偽陰性の高い量が現在利用可能なPPI決定技術の多くから導き出されるため、多くの実験的に決定されたPPIの結果の間には、高い意見の相違があります。これは特に酵母ツーハイブリッド(Y2H)系では、タンデムアフィニティー精製質量分析(TAP-MS)、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)、PPI測定^{2、3、4、5、6、7}に最も一般的に使用される方法の3つを表す。それに比べて、核磁気共鳴(NMR)、X線結晶学、電子顕微鏡(EM)などのタンパク質構造生物学技術を用いて、タンパク質とタンパク質の相互作用に関する高解像構造情報を原子レベルまで得ることができ、目的のタンパク質に対して発生する相互作用の直接的な視覚的確認を可能にする。現在利用可能な非構造ベースPPI決定研究技術(例えば、Y2H、TAP-MS、およびFRET)の全てがこの能力を欠き、さらにタンパク質間の弱い相互作用および一過性相互作用を同定するのが困難に苦しむ^5。これらの欠点は、適切な第四級構造およびヘテロマー錯体集合体の形成に影響を与える脂質環境の追加変数によってもたらされる複雑性の増大に起因する膜タンパク質を研究する際にさらに強化される。

膜タンパク質はプロテオームの大部分を占めており、すべての生物の中で適切な細胞機能において多くの重要な役割を果たすことが知られています。膜タンパク質はヒトゲノムの27%を占め、現在の薬物標的の60%程度を占めると推定されているにもかかわらず^、全ての公表タンパク質構造^の約2.2%を占める膜タンパク質の解剖モデルの数に大きな異常^がある。構造情報の入手可能性の不一致の主な原因は、膜タンパク質自体の本質的な特性にあります。溶解性が悪く、天然の構造や機能を維持するための脂質環境との相互作用に依存し、脂質膜自体の様々な物理化学的特性を研究する際に、膜タンパク質は大きな問題を引き続き表しています。これらの固有特性の中で、正確な構造情報を得るために最も重要なのは、天然の脂質環境との相互作用を持つことで、天然の構造と機能を維持する必要があります。脂質環境は膜蛋白質の構造や機能の一部としてこのような不可欠な部分であり、膜蛋白質の構造と機能¹¹の基本単位としてメムテイン(膜とタンパク質との組み合わせ)の概念が提案されている。脂質とタンパク質の相互作用の重要性にもかかわらず、現在利用可能な構造ベースのPPI決定技術は、多くの場合、研究されているタンパク質が溶解しているか、洗剤で可溶化されている必要があります。過酷な洗剤への暴露は、タンパク質を変性させたり、脂質異常による偽陽性および陰性を引き起こし、凝集、タンパク質の変性、非共有結合相互作用の解離、人工オリゴマー状態の形成を誘発する可能性があります。膜蛋白質のネイティブオリゴマー状態を正確に決定するために自然な脂質環境を維持する必要性のために、我々は、以前に報告されたスチレンマレイン酸脂質粒子(SMALP)13法に基づいてネイティブ細胞膜ナノ粒子システム(NCMNs)12を開発した。

SMALPは、膜活性ポリマーとしてスチレンマレイン酸共重合体を使用して、膜タンパク質を抽出し、可溶化します。ポリ(スチレン-コマレイン酸)(SMA)は、その疎水性スチレン部分と正反対の親水性マレイン酸部分に起因するユニークな両親媒性ポリマーです。pH依存機構¹⁴に吸着し、不安定化し、細胞膜を破壊することによってナノ粒子を形成する。SMAのこの機能活性は、膜タンパク質抽出および可溶化のための洗浄剤フリーシステムとして利用することを可能にするものである。NCMNシステムは、いくつかの側面でSMALPシステムとは異なります。NCMNシステムの最もユニークな特徴は、安定性とネイティブ機能のために異なる条件を必要とする多くの異なる膜タンパク質の単離に適したユニークな特性を有する多数のポリマーを有する膜活性ポリマーライブラリーを有することである。NCMNシステムは、ナノ粒子の調製に関しては、SMALP法と比較して異なるプロトコルを有する。そのような例の1つは、NCMNsが高分解能構造の決定のために単一ステップニッケル親和性カラム精製を使用することです。これらの異なるプロトコルの効果は、3.2および3.0 Å cryo-EM AcrB構造を生成したNCMNsプロトコルを比較する際に、SMALP法を用いた同様の研究を行い、8.8Å解像度^12,15でクライオEMAcrB構造を生じさせた。NCMNシステムのこれらのユニークな特徴は、以前に確立されたSMALP法で行われた改善であり、PPIの研究のための理想的な候補になります。

多剤流出トランスポーターAcrBは、大腸菌¹²において機能的なホモトリマーとして存在する。変異原性分析は、AcrBトリマーの安定性を担うループ上に位置する単一のP223G点突然変異が、三量体状態を不安定化させ、天然の青いゲル電気泳動¹⁶で検出できる洗剤DDMで調製するとAcrBモノマーを生じさせることを示唆した。しかし、AcrB-P223G変異体のFRET分析は、天然細胞膜脂質二重層環境において、変異型AcrB-P223Gの大部分が依然として三量体として存在し、野生型AcrBおよびAcrB-P223Gの両方の発現レベルが類似していることを示唆した。しかしFRET分析結果にもかかわらず、変異型トランスポーターの活性アッセイは、野生型¹⁶と比較すると活性が劇的に低下することを示した。FRET技術はタンパク質とタンパク質相互作用の分析に広く使用されてきたが、研究は、しばしば偽陽性^{17、18、19、20}を与えることができることを示している。

最近、AcrBトリマーの高解像度クライオEM構造は、NCMNs12の使用を通じてAcrBと関連する天然細胞膜脂質二重層との相互作用を示す決定された。原則として、NCMNsは、天然細胞膜に見られるタンパク質とタンパク質の相互作用の分析に容易に利用することができます。本システムの試験では、天然細胞膜ナノ粒子と陰性染色電子顕微鏡を用いてAcrB-P223Gのオリゴマー状態を直接観察する実験を行った。野生型AcrBナノ粒子と比較するために、NCMNライブラリー¹²に見られるAcrBおよび代替ポリマーの高解像度クライオEM構造決定に用いられている同じ膜活性ポリマー(NCMNライブラリでNCMNP1-1としてインデックス化された研究室製のSMA2000)を用いた。先に報告された結果に基づいて、AcrB-P223G変異体の大部分が三量体天然細胞膜ナノ粒子²¹の形で存在することが期待された。しかし、野生型AcrBで観察されたものなど、サンプルにはAcrB三分子は見つからなかった。これは、AcrB-P223Gの大部分が、以前に示唆されたように、ネイティブ細胞膜に三量子を形成しないことを示唆している。

ここでは、NCMを用いた野生型 大腸菌 AcrBとの比較における変異型 大腸 菌AcrB-P223Gの詳細な分析を報告する。AcrBのこのケーススタディは、NCMNがタンパク質とタンパク質相互作用分析に適したシステムであることを示唆しています。

プロトコル

1. タンパク質発現

1. BL21(DE3)PLysS細胞を含むプラスミドを含む素晴らしいブロス(TB)培地を15mLで37°Cで一晩で37°Cで250rpmで振盪させた。
2. 600 nm (OD₆₀₀₎での一晩培養の光学濃度を確認し、2.0 を超えるようにしてください。
3. プラスミドに特異的な抗生物質を含む結核培地の1Lに5mLの細胞培養を希釈し、OD₆₀₀=0.8まで振盪して37°Cでインキュベートし、最終的な濃度が1mMのIPTGで誘導する。
4. 20°Cで20時間振る回して誘導を行います。
5. 4°Cおよび4,000 x gで15分間の遠心分離を使用して細胞を下にペレット.

2. 細胞のリシスと膜の分離

1. バッファーA内の細胞ペレットを再懸濁(表1、DDM バッファAまたはNCMNsバッファAに従う精製スキームに応じて)を用いて、細胞ペレットの20gごとに80 mLを使用する。
2. ガラスDounceホモジナイザーを4°Cで使用するか、室温であれば、再懸濁セルペレットを均質化し、すぐに氷の上に置いてください。
3. サンプルを氷の上の金属ビーカーに移し、4°Cおよび1,500棒で高圧ホモジナイザーにセットして細胞を溶解させる。
   1. ホモジナイザーに細胞をロードし、ホモジナイザーを通過させて3〜4サイクル、またはリセートが明確になるまで通過させるプロセスを繰り返します。
4. 4°Cで30分間15,000xgでリセートを遠心分離する。
5. 上清を収集し、4 °Cで1時間215,000 x g で超遠心チューブと遠心分離機に負荷を入れ.
6. 上清を捨てて、超遠心チューブから膜ペレットを収集します。過剰な膜ペレットを-80°Cで保存します。

3. 天然細胞膜ナノ粒子の調製

1. 10 mL NCMNsバッファA中の膜ペレット1gを再懸濁する(表1)。
2. 再懸濁した細胞膜試料をガラスDounceホモジナイザーを20°Cで均質化する。
3. 懸濁膜試料を50 mLポリプロピレンチューブに移し、膜活性ポリマーストック溶液および追加のNCMNsバッファAを加えて、最終濃度2.5%(w/v)膜活性ポリマー(NCMNP1-1またはNCMNP5-2)にサンプルを持ち込みます。
   注:膜活性ポリマーのストック溶液は、二重蒸留水で作られ、様々な濃度で保つことができますが、通常は10%(w/v)です。
4. 試料を20°Cで2時間振る。
5. サンプルを超遠心分離機にロードし、20°Cで1時間150,000 x g で回転させます。
6. サンプルが超遠分化されている間にNCMNsバッファAの25 mLと5 mL Ni-NTAカラムを平衡化し始める。
7. 超遠心分離が完了した後に上清を収集し、シリンジポンプを使用して0.5 mL /minの流量で室温でNi-NTAカラムの5mLにロードします。
8. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) ラインを十分な NCMNs バッファ B (表 1)で洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、カラムを FPLC マシンに接続します。
9. 30 mLのNCMNsバッファBで1mL/minの流量でカラムを洗浄し、流れを通して集めます。
10. 30 mLのNCMNsバッファC(表1)で流量1 mL/minでカラムを洗い、流れを通して集めます。
11. 20 mL の NCMNs バッファ D (表 1)を流量 0.5 mL/min で溶出し、分画コレクタと画分をそれぞれ 1.0 mL に設定してサンプルを収集します。
12. タンパク質サンプルを4°Cに保存してください。
13. FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認するために、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行します。

4. SDS-ページゲル電気泳動

1. ガラスを鋳造装置にクランプして鋳造室を準備します。
2. 表1に示したレシピに従って12%分離ゲルを調製する。
   注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。
3. ゲルを注ぎ、櫛の底から2cm下に2cm残して、スタッキングジェルを出します。
4. ゲルの上部に100%イソプロパノールを重ねて気泡を取り除き、分離ゲルが重合するのを待ちます。
5. イソプロパノールを取り除き、蒸留水でイソプロパノールの痕跡を洗い流します。
6. 表 1に示したレシピに従って、スタックゲルを準備します。
   注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。
7. 分離ゲルの上に積み重ねゲルを注ぎます。
8. ウェルを形成するために部屋に櫛を追加し、積層ゲルが完全に重合するのを待ちます。
9. ゲル上で実行する必要がある各画分サンプルのマイクロ遠心分離チューブに1 M DTTの1 μLを入れる。
10. 各チューブに4x負荷バッファの7 μLを追加します。
11. ゲル上で実行する必要のある分数から各マイクロ遠心チューブに20 μLのサンプルを加えます。
12. サンプルを含むチューブを渦出します。
13. 3 sの卓上マイクロ遠心分離機を使用してサンプルチューブをスピンダウンし、すべてのサンプルがチューブの底に戻っていることを確認してください。
14. ゲル電気泳動セルを調製するために、12%ポリアクリルアミドゲルカセットを所定の位置に固定し、細胞の内側および外側のチャンバーをトリス-酢酸EDTA(TAE)バッファで満たします(表1)。
15. 指示に必要な適切な体積で、ゲルの最初のレーンに分子量マーカーをロードします。
16. DTTと負荷バッファを混合した各チューブからサンプルの28 μLをロードします。
17. 電気泳動セルの蓋を箱の上に置き、蓋を電源に差し込みます。
18. 電源を入れ、100 Vに設定し、20分間稼働します。
19. 20分後、電源電流を140Vに上げ、さらに30〜40分間、またはローディングバッファ色のバンドがゲルカセットの底に達するまでそれを実行し続けます。
20. 電気泳動染色を完了した後、ゲルを脱染色して、ゲル内に含まれるタンパク質バンドを可視化する。

5. DDMを用いたタンパク質精製

注:この精製プロセスを実施する目的は、膜活性ポリマーを利用した実験の制御として機能することです。

1. 6〜10gの膜ペレットを再懸濁し、ステップ2.6から、5mL/gの膜ペレットを用いてDDMバッファA(表1)に入れる。
2. 再懸濁試料をガラスDounceホモジナイザーを4°Cで均質化するか、室温であれば、すぐに氷の上に置いてください。
3. サンプルをポリプロピレンチューブ50 mLに移し、DDMとDDMバッファAを追加して、サンプルを2%DDMの最終濃度にします。
4. サンプルを4°Cで2時間振ります。
5. 4 °Cおよび150,000 x gで1時間超遠心チューブと遠心分離機にサンプルをロードします。
6. 試料が超遠心状態にある間、25mLのDDMバッファAで洗浄してNi-NTAカラムの5mLを調製し始める(表1)。
7. 超遠心分離が完了したら、上清を集め、シリンジポンプを使用して0.5 mL/minの流量で4°Cの5 mL Ni-NTAカラムに積み込みます。
8. 十分な DDM バッファ B + 0.05% DDM (表 1) で FPLC ラインを洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、FPLC マシンにカラムを取り付けます。
9. 30 mLのDDMバッファB + 0.05%DDMで、流量1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。
10. 30 mLのDDMバッファC + 0.05%DDM(表1)の流量を1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。
11. 20 mL の DDM バッファー D + 0.05% DDM (表 1) の流量 0.5 mL/min でタンパク質を溶出し、分画コレクタと各画分を使用して流れを 1.0 mL に設定して流れを収集します。
12. 500 μLに達するまで4,000 x g および4°Cで遠心濃縮器と遠心を使用して、プールおよび濃縮のための溶出ピークを含む分数を選択します。
13. 500 μL ループを使用して、サンプルを FPLC マシンにロードし、4 °C の 25 mL サイズの除外カラムに積み込みます。 30 mL の DDM バッファ E + 0.05% DDM (表 1) を流速 0.5 mL/min で使用し、分数サイズが 1 分あたり 0.5 mL に設定された分数として収集します。
14. 画分を取り、FPLC溶出グラフからUV-Vis曲線を確認するために280 nmの吸光度を使用してタンパク質濃度を測定する。
15. FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応する各サンプル画分から20μLを収集し、吸光度試験で正確であることが確認されました。
16. 必要なアリコートで液体窒素またはドライアイスを使用してこれらのサンプル画分の残りを凍結し、-80°Cでタンパク質サンプルを保存します。
17. 前述のとおり、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行して、FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認します。

6. 陰性染色グリッドの準備

1. サンプル調製に使用するグリッドを、フィルターペーパーで包んだガラススライドに、カーボン側を上に向けて配置します。
2. 電子顕微鏡グリッドを備えたガラススライドを2つの電極間のグロー放電器のチャンバーに入れ、ガラス蓋を交換して、中央に収まり、密閉されていることを確認します。
3. グロー放電機を実行し、プラズマによって生成された紫色の光が見えるようにします。
4. 機械の走行が終わったら、チャンバーが大気圧に達するまで待ってガラス蓋を取り外し、サンプルが積み込まれるベンチにグリッド付きのスライドを戻します。
5. 適切なバッファーでサンプルを希釈するか、遠心濃縮器を使用して濃縮することにより、精製されたタンパク質サンプルの濃度を約 0.1 mg/mL に調整します。
6. 3.5 μLのタンパク質サンプルを10 nm厚いカーボングリッドに積み込み、1分待ちます。
7. フィルターペーパーでEMグリッドの表面から液体を取り除きます。
8. グリッドで3μLの水滴を拾い、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッドから水を取り除くことによって、グリッド表面3倍を洗浄します。
9. 3 μLの新鮮な、ろ過された2%の酢酸ウランの液滴を拾ってグリッド表面2xを洗浄し、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッド上の洗浄液を取り除きます。
10. 3 μLの新鮮な、濾過された2%酢酸ウランの1分間のグリッドを染色します。
11. EMグリッドの表面にある酢酸ウラン溶液を濾紙で取り除き、空気乾燥してグリッドを少なくとも1分間乾燥させます。
12. 後で使用するためにグリッド ボックスにグリッドを格納します。

7. EMイメージング

1. 準備したグリッドを安全なワークベンチのグリッドホルダーに積み込みます。
2. 顕微鏡をポリスチレンボックスに入れ、液体窒素の3/4を満たして顕微鏡を準備します。
3. 顕微鏡窓のゴムカバーが覆っていることを確認し、プラットフォームに収まるまで銅線をデュワーに入れて顕微鏡にロードします。
4. 残りの残りの部分を液体窒素で満たし、それをカバーするためにデュワーの上にキャップを置きます。
5. ハイテンションをオンにし、顕微鏡を調整し、顕微鏡がウォームアップし、使用するための安全な真空レベルを確立するのを待ちます。
6. 顕微鏡が準備ができたら、カラムバルブを開き、顕微鏡ウィンドウのゴムカバーを取り外してビームが存在することを確認します。
7. ビームの強度を調整して、広がってビームの汚名を確認します。乱視が存在する場合、ビームはクロスオーバーから離れて移動し、ビームは両側で同じ楕円形でなければならないので、楕円形になります。
8. 顕微鏡双眼鏡を、観察者の目に合わせて正しい高さと距離に調整します。
9. 3 つのモードすべてを循環して、ビームの位置を 検索、 フォーカス、 および露出 モードで確認します。
10. カラムバルブを閉じて、グリッドホルダーを電子顕微鏡にロードします。
11. 顕微鏡のウォブラー特徴を使用し、中央にサンプルの左右の動きがなくなるまでZ軸を使用してステージの動きを調整することにより、マイクロスコープをユーセントリックな高さに調整します。
12. 顕微鏡上の低用量 検索 モードを使用して、サンプルに焦点を当てるために存在するサンプル分子との妥当な対比の望ましい領域をグリッドを検索します。
13. サンプルが見えるまで高いステップサイズを使用して 、フォーカス モードでサンプルに焦点を当て、次にステップを減らすことで正しいフォーカスレベルを見つけます。
14. ゼロとビームをブランクし、ゴムパッドが顕微鏡の窓を覆っていることを確認してください。
15. 露出モードを使用して、62,000x倍率で1s露光のために目的のグリッド領域の画像を取り、取得した画像を確認します。
16. グリッドのイメージングが完了したら、列バルブを閉じ、グリッドホルダを列から取り外します。
17. 目的のすべてのグリッドのイメージングが終了すると、フィラメント電源をオフにして、顕微鏡から液体窒素デュワーを除去することによって、顕微鏡をシャットダウンします。
18. 顕微鏡の銅コイルから結露をキャッチするために、デュワーが座ったスタンドに水分を吸収するために何かを置きます。
19. クライオサイクルモードを有効にして、ターボポンプがオフになっていることを確認します。

結果

ここで提示した手順を用いて、 大腸菌 AcrB野生型および 大腸菌 変異体AcrB-P223Gのサンプルを精製した。次いで、試料を、カーボンネガティブ染色電子顕微鏡グリッドに吸着し、ウラニル酢酸を使用して、サイドブロッティング法²²で染色した。負の染色画像は透過型電子顕微鏡を用いて収集した。DDMで精製されたAcrB野生型試料の陰性染色像は、明確に定義された三量体四晶構造を示すタンパク質を有する単分散粒子の均質な溶液を明らかにする(図1A)。これらの三量体構造は、精製時の観察サイズ排除クロマトグラムに対応する(補足図1)。これに対して、AcrB-P223G変異体の陰性染色像を見ると、DDMで精製しても、凝集に向かう傾向を持つ多分散ナノ粒子の不均一な溶液を観察することができるが、観察可能なネイティブ三量体はない(図1B)。これらの結果は、サイズ排除クロマトグラフィーを実施する際に観察された溶出プロファイル...

ディスカッション

タンパク質とタンパク質の相互作用は、膜タンパク質の構造と機能の完全性にとって重要です。タンパク質とタンパク質の相互作用を調べるアプローチが数多く開発されています。可溶性タンパク質と比較すると、膜タンパク質およびそのPPIは、膜タンパク質の固有の本質的な特性のために研究することがより困難です。この難しさは、主に構造安定性と機能性のためのネイティブ脂質二重層環境に埋め込まれる膜タンパク質の要件から来ています.タンパク質の高解像度構造を決定するためには細胞膜から抽出する必要があるため、これは問題になります。FRETは細胞膜上のタンパク質とタンパク質相互作用を調べる一般的な技術であったが、解像度は低く、しばしば偽陽性^{17、18、19、20}を産生する。ここでは、天然細胞膜上の野生型AcrBトリマーとAcrB-P223Gモノマーを構造的に分析し、FRETを用いた以前の分析結果と比較することで、N...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Chemicals
30% アクリルアミド/BIS SOL (37.5:1)	Bio-Rad	161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)	Bio-Rad	1610747
Acetic Acid Glacial	ThermoFisher Scientific	A38S-212
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700
クロラムフェニコール	Goldbio	C-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 タンパク質染色粉末	Bio-Rad	161-0400
DTT (Dithiothreitol) (>純度 99%) プロテアーゼフリー	Goldbio	DTT10
グリセロール	ThermoFisher Scientific	G33-4
HEPES	ThermoFisher Scientific	BP310-1
イミダゾール	Affymetrix	17525 1 KG
IPTG	Goldbio	I2481C100
Kanamycin	Goldbio	K-120-25
塩化マグネシウム六水和物	ThermoFisher Scientific	AA3622636
メタノール	ThermoFisher Scientific	A412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)	Merck	8.03779.0100
NCMNS-P5-2	まだ市販されていません	著者
プレシジョンプラスプロテイン デュアルカラースタンダード	バイオラッド	161-0374
SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)	バイオラッド	161-0301
SMA2000	クレイバレー	リクエストを責任著者
塩化ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S271-10
TCEP-HCl	Goldbio	TCEP25
TEMED	Bio-Rad	161-0800
Terrific Broth Media	Affymetrix	75856 1 KG
Tris Base	Bio-Rad	161-0719
酢酸ウラニル	Ambinter	Amb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPI	ベックマン・コールター	B14538
アバンティ JXN-30	ベックマン・コールター	B34193
カーボン電子顕微鏡グリッド (10 nm)	電子顕微鏡科学	CF300-Cu-TH
コントルク組織ホモジナイザー	エーベルバッハ	E7265
コーニング LSE ミニ微量遠心機	ThermoFisher Scientific	07-203-954
EmulsiFlex-C3	Avestin
フラクションコレクター F9-R	GE Healthcare Life Sciences	29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-8004
NanoDrop 2000 分光光度計	ThermoFisher Scientific	ND-2000
オプティマ L-90K 超遠心分離	ベックマン・コールター	PN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow グロー放電洗浄システム	テッド・ペラ	91000S-230
ポッター・エルヴェジェム セーフ・グラインド・ティッシュ・グラインダー	ウィートン	・358013
パワーパック ベーシック電源	バイオ・ラッド	164-5050
Razel R99-E 可変速シリンジポンプ	Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	28990944
Tecnai F20 200kV	FEI
Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	ThermoFisherサイエンティフィック	05-408-129
4 ml アミコン ウルトラ-4 30 kDa	ミリポア シグ	マ UFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLC	GE ヘルスケア ライフサイエンス	29018225
BL21(DE3)pLysS 細胞	サーモフィッシャー サイエンティフィック	C606003
ファルコン 50 ml コニカル遠心チューブ	サーモフィッシャー サイエンティフィ	14-959-49A
HisTrap HP 5mlカラム	GEヘルスケアライフサイエンス	17524802
pET-24aEMD	バイオサイエンス	69749-3