ここで提示されるのは、高効率(>90%)を有する誘導多能性幹細胞からのヒト腎臓ポドサイトの誘導のための化学的に定義されたプロトコルであり、遺伝子操作または亜集団選択とは無関係である。このプロトコルは、26日以内に望ましい細胞タイプを生成し、腎毒性試験および疾患モデリングに有用であり得る。
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この記事について
サマリー
要約
腎臓病は世界人口の10%以上に影響を及ぼし、連邦支出に数十億ドルの費用がかかります。腎臓病の最も重篤な形態および最終的な末期腎不全は、しばしば、内皮細胞および糸球体地下膜と一緒に機能する高度に特殊化された上皮細胞である糸球体ポドサイトの損傷によって引き起こされ、腎臓の濾過障壁を形成する。腎医学の進歩は、一次組織の利用が限られており、ポドサイトなどの機能性ヒト腎臓細胞の誘導のための堅牢な方法の欠如によって妨げられてきた。幹細胞などの再生可能な供給源からポドサイトを導き出す能力は、ヒト腎臓の発達と病気のメカニズムに関する現在の理解を進めるだけでなく、治療的発見のための新しいツールを提供するのに役立つ可能性があります。このプロトコルの目的は、高効率かつ特異性のヒト誘導多能性幹細胞(hiPS)細胞から、化学的に定義された条件下で成熟した、後の有糸球体を導き出す方法を開発することであった。この方法で生成されたhiPS細胞由来ポドサイトは、系統特異的マーカー(ネフリン、ポドシン、ウィルム腫瘍1を含む)を発現し、成熟した機能的ポドサイトに関連する特殊な形態学的特徴(一次および二次足プロセスを含む)を示す。興味深いことに、これらの特殊な特徴は、この分野で広く使用されている不死化ポドサイト細胞株には特に存在せず、本明細書に記載されているプロトコルは、ヒト腎臓生物学を研究するために典型的に使用される既存のポドサイト細胞株よりも発達的により成熟した表現型を有するヒト腎臓ポドサイトを産生することを示唆している。
概要
ヒト多能性幹細胞培養の進歩は、再生医療、疾患モデリング、および薬物スクリーニングに革命をもたらす準備ができているので、研究者は、人体内のほぼすべての細胞型を得るように設計することができる再生可能でスケーラブルな生物学的材料の供給源を提供する1。この方法は、他の方法では入手が困難な特殊な機能型のセル型を派生する場合に特に役立ちます。ヒト人工多能性幹細胞(hiPS)細胞2、3、4、5は、体細胞起源と個別化医療の可能性から特に魅力的です。しかし、hiPS細胞から他の細胞系統を導き出す方法の開発は、不十分に定義された培養条件を頻繁に使用し、不十分な培養条件を使用し、6,7の異種細胞集団の低効率および非特異的生成を招くため、依然として困難である。
ここで提示される、化学的に定義された条件下で特異性および高効率のhiPS細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの導出のための方法である。細胞微小環境内での複数因子の役割を考慮することにより、細胞培養培地に示される可溶性因子の最適化や....
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プロトコル
1. 試薬の調製
- HiPS細胞培養基底培地で解凍した5x hiPS細胞培養培地(CCM)サプリメントを希釈し、hiPS CCMの1x溶液を得た。
注:冷凍5x hiPS CCMサプリメントは、理想的には一晩4°Cで、ゆっくりと解凍プロセスを必要とします。1x hiPS CCMのアリコートは-20°Cで6ヶ月まで保存することができます。 - hiPS細胞培養用基膜(BM)マトリックス1コーティングプレートの調製:4°Cで氷上でBMマトリックス1を一晩解凍する。解凍したら、メーカーが提案した適切な希釈因子を持つアリコートを準備します。
注:通常、アリコートは、50 mL円錐管内の冷たいDMEM/F12の25 mLで、BMマトリックス1を完全に溶解し、残留結晶の形成を避けるために完全に混合して、その後の希釈のために準備されます。 - BMマトリックス1溶液の1mLを6ウェルプレートのウェルに移し、37°Cで1〜2時間、または4°Cで最低24時間インキュベートし、パラフィンフィルムで包みます。BMマトリックス1-被覆されたプレートは、4°Cで最大2週間保存することができます。
- 基質膜(BM)マトリックス2の調製-コーティングされた版:9 mLの無菌蒸留水のBMマトリックス2の適切な量を希釈して5μg/mLの最終濃度を作製する。BMマトリックス2溶液700μLを12ウェルプレートのウェルに加え、室温でプレートを2時間または4°Cで一晩インキュベートします。<....
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結果
このプロトコルの目的は、成熟したヒトポドサイトが化学的に定義された条件下でhiPS細胞から誘導できることを実証することであった。この原稿に記載されたデータは、DU11 hiPS細胞株17を用いて生成され、最初に試験され、マイコプラズマが含まれなかったことが判明した。染色体分析も行われ、細胞はカルヨタイプ正常であることが判明した。未分化DU11 hiPS細胞から、この報告書に概説されている分化戦略(図1)を用いて、まず、小子状(T)を発現する中皮細胞(図1Bおよび図2B)に幹細胞を分化し、続いてPAX2陽性の中間中間メソダーム細胞(図2C)に分化し、最終的に成熟した腎細胞に分化した。 図 2D
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ディスカッション
本報告では、hiPS細胞からの腎臓糸球体ポドサイトの生成プロトコルについて述べている。hiPS細胞由来ポドサイトは、成熟した腎臓ポドサイト表現型13に関連する形態学的および分子的特徴を示す。これまでの刊行物では、hiPS細胞由来ポドサイトが、透過性マイクロ流体臓器オンチップ装置8,11で糸球体微小血管内皮細胞と共培養した場合に腎臓糸球体の構造および選択的濾過機能を模倣できることを示した。
このプロトコルの適応に関心のある研究者は、次の重要なステップを考慮する必要があります。まず、中皮細胞の誘導のためのラミニンコーティングプレートへのhiPS細胞の播種が重要なステップです。100,000個の細胞/ウェルの播種密度が推奨されますが、研究者は研究に使用される幹細胞ラインの複製速度に応じて、初期細胞播種密度を調整することができます。必要に応じて、この最適化により、メソダーム誘導段階で十分な細胞密度が確保され、メソダーム、中間メ.......
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開示事項
S.Mは、多能性幹細胞からの腎臓ポドサイトの生成方法の特許出願中の著者です(米国特許出願14/950859)。残りの著者は、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。
謝辞
この研究は、デューク大学のプラット工学部、デューク医科大学腎臓学科、デューク大学医学部の椅子研究賞、バロウズウェルカム基金PDEPキャリア移行 アドホック 賞によって支援されました.M。M.Bは、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの支援を受けています。DU11幹細胞ラインを寛大に提供してくれたBursac Labと、デューク大学のヴァルゲーゼラボが組織培養施設を一時的に共有してくれたことに感謝します。この出版物は、60歳の誕生日 を祝って、マサチューセッツ工科大学のノバルティス化学教授ローラ・L・キースリング教授に捧げられています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| DU11ヒトiPS細胞 | DU11(Duke University clone #11) iPS細胞株は、デューク大学のiPSCコアファシリティで作製され、デューク大学のBursac Labから提供されました。この系統はマイコプラズマについて試験され、2019年7月に当研究室で最後に核型が決定され、核型が正常であることがわかりました。 | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans レチノイン酸 (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | 細胞システム | 足細胞維持培地 |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutaine supplement |
| 熱不活化 FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| ヒトアクチビン A | PHC9564 | Thermo/Life技術 | |
| ヒト BMP7 | PHC9544 | サーモ/ライフ テクノロジー | |
| ズ ヒト VEGF | PHC9394 | サーモ/ライフ テクノロジー | |
| mTeSR1 培地 | 05850 | 幹細胞技術 | hiPS 細胞培養培地 (CCM) |
| ペニシリン–ストレプトマイシン、液体(100回;) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK阻害剤 | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–標識二次抗体 | A32744;A32754;A-11076;A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | アブカム | |
| ネフリン | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BDBiosciences | 基底膜(BM)マトリックス 1.ロット間の変動を示す場合があります |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | 細胞剥離液 |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSOは有毒です。化学物質安全フード、 |
| 酵素フリー細胞解離バッファー、Hank'で取り扱う必要がありますS balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| エタノール溶液、70% (vol/vol)、バイオテクノロジーグレード | 97065-058 | VWR | エタノールは可燃性で有毒 |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFAは、手袋、白衣、安全眼鏡などの適切な個人用保護具を備えた化学ドラフトで取り扱う必要があります。吸入や皮膚との接触を避けてください。 |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| 滅菌蒸留水 | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| 吸引ピペット、個別包装 | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| コニカル遠心チューブ、15 mL | 352097 | Corning | |
| コニカル遠心チューブ、50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | 冷凍保存用アリコート |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | 固定および染色されたiPS細胞およびその誘導体の画像を取得するために使用される蛍光顕微鏡 |
| 血球計算盤 | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2インキュベーター | 51030403 | Thermo/Life Technologies | iPS細胞およびその誘導体の |
| 日常的な培養とメンテナンスにInverted Zeiss Axio Observer with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | 足細胞分化の各段階における生きたiPS細胞とその誘導体の位相コントラスト画像の取得に使用 |
| Kimberly-Clarkニトリル手袋 | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, Large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, Small | 21905-026 | VWR | |
| P10精密バリアピペットチップ | P1096-FR | デンビルサイエンティフィック | |
| P100バリアピペットチップ | P1125 | デンビルサイエンティフィック | |
| P1000バリアピペットチップ | P1126 | デンビルサイエンティフィック | |
| P20バリアピペットチップ | P1121 | デンビルサイエンティフィック | |
| P200バリアピペットチップ | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological ピペット、10 mL、個別包装 | 356551 | Corning | |
| Serological pipette、25 mL、個別包装 | 356525 | Corning | |
| Serological pipette、5 mL、Corning | 356543 | ||
| 、0.22 μメートル、PES | SCGP00525 | EMDミリポア | |
| 滅菌マイクロ遠心チューブ | 1138W14 | トーマス科学 | 成長因子の組織培養を分注するため |
| 。Corning | Tissue | 353043 | |
| –処理された6ウェルプレート | 353046 Corning | ||
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
参考文献
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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再版と許可
