方法論記事

インプラント用金属に対する関節軟骨滑走の生物化学検査と分析

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DOI：

10.3791/61304

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2020年5月14日

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1Faculty of Health and Medicine, Department for Health Sciences, Medicine and Research, Center for Regenerative Medicine, Danube University Krems, 2Department of Orthopedics and Traumatology, LK Baden-Mödling-Hainburg, 3AC2T research GmbH

この記事について

サマリー

このプロトコルは、金属インプラント材料に対して滑る骨軟骨シリンダーの調製、生物的検査、および分析について説明する。このプロトコルに含まれる結果対策は、代謝活性、遺伝子発現および占地である。

要約

中年患者の骨軟骨欠損は、焦点金属インプラントで治療される可能性がある。膝関節の欠陥のために最初に開発されたインプラントは、肩、股関節、足首および最初の中足アルファランジアル関節のために利用可能になりました。疼痛の軽減および臨床的改善を提供する一方で、多くの患者において、対向する軟骨の進行性変性変化が観察される。この損傷につながるメカニズムは完全には理解されていません。このプロトコルは、関節軟骨の金属対軟骨の組み合わせと包括的な分析をシミュレートするためのトライボロジー実験を記述します。金属インプラント材料は、ヒト関節軟骨のモデルとして牛骨軟骨シリンダーに対して試験される。異なる負荷と滑り速度を適用することにより、生理学的な負荷条件を模倣することができます。関節軟骨に及ぼす影響の包括的な分析を提供するために、本プロトコルに記載されているヒストロジー、代謝活性および遺伝子発現解析。トライボロジーテストの主な利点は、負荷パラメータを自由に調整してin vivo条件をシミュレートできることです。さらに、潤滑剤や炎症促進剤の影響を調べるには、異なる試験溶液を用いることができる。軟骨特異的遺伝子や異化遺伝子に対する遺伝子発現解析を用いることで、機械的負荷に応じた関節軟骨細胞の代謝の初期変化が検出される可能性がある。

概要

骨軟骨欠損の治療は厳しく、多くの場合手術が必要です。中年患者における焦点骨軟骨病変の場合、焦点金属インプラントは、特に骨髄刺激(BMS)または自家軟骨細胞移植(ACI)のような一次治療の失敗後に実行可能な選択肢である。部分的な表面置換は、痛みを軽減し、運動2の範囲を改善することができるサルベージ手順と考えることができます。これらのインプラントは、通常、CoCrMo合金で構成され、通常の解剖学3に一致するように異なるサイズとオフセット構成で利用可能です。最初は膝の内側大腿骨顆の欠陥のために開発されましたが、そのようなインプラントは現在利用可能であり、股関節、足首、肩、肘4、5、6に使用されています。満足のいく結果を得るためには、対向する軟骨の機械的な関節の位置合わせと状態を評価することが重要です。さらに、インプラントの突起のない正しい移植は、基本的な7であることが示されている。

臨床研究は、様々な場所5、6、8の中年患者における疼痛軽減および機能の改善の点で優れた短期的な結果を実証した。同種移植と比較して、焦点金属インプラントは早期の重量の負担を可能にする。しかし、対向する関節軟骨は、患者数9,10で加速摩耗を示した。したがって、適切な配置であっても、多くの場合、ネイティブ軟骨の変性は避けられないようですが、根本的なメカニズムは不明のままです。同様の変性変化は、股関節11の双極性関節形成術後に観察され、活性およびローディング12と共に増加する。

トライボロジー実験は、このような組み合わせをインビトロで研究し、生理学的条件13の下で起こる異なる負荷状況をシミュレートする可能性を提供する。骨軟骨ピンの使用は、在来の軟骨または任意のインプラント材料14 に対して滑る関節軟骨のトライボロジーを調査するための単純な幾何学モデルを提供し、さらに関節シミュレーションモデル15全体で使用されるかもしれない。金属上軟骨の組み合わせは、軟骨上の組み合わせと比較して、軟骨摩耗の加速、細胞外マトリックス破壊、および表面領域における細胞生存率の低下を示す。軟骨の損傷は主に表面領域と中間ゾーン17の間の剥離の形で発生した。しかし、軟骨変性につながるメカニズムは完全には理解されていません。このプロトコルは、関節軟骨の生合成活性の包括的な分析を提供します。異化遺伝子の代謝活性と遺伝子発現レベルの決定により、軟骨破壊の初期の適応症が同定される可能性がある。in vitroトライボロジー実験の利点は、負荷パラメータを調整して様々な負荷条件を模倣できることです。

したがって、以下のプロトコルは、実験的なヘミアルスロプラスティモデルを表す金属対軟骨の組み合わせをシミュレートするのに適しています。

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プロトコル

1. 金属シリンダーの準備

  1. 化学組成用の外科インプラントの標準仕様を満たす円筒形コバルト-クロムモリブデン(CoCrMo)ロッドを、メーカーのプロトコルごとのエネルギー分散型X線分光法で走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて分析し、提供された値を確認します。
    注:この実験に使用されるCoCrMo合金の元素組成は、65%Co、28%Cr、5%Mo、その他2%です。
  2. 500の粒径から始まる炭化ケイ素粉砕紙でサンプルを湿潤。4000の粒径まで昇順に粉砕紙を使用してください。
  3. 3 μmと1 μmペーストでシリンダーを研磨し、金属外科インプラント(ISO 5832-12:2019)および全部分関節置換インプラント(ISO 21534:2007)の表面仕上げ要件の許容範囲内にある表面粗さを達成します。
    注: 平均表面粗さは、共焦点顕微鏡を使用して決定されます。
  4. 長さ10mmの円柱にCoCrMoロッド(Ø 6 mm)をカットします。

2. 骨軟骨シリンダーの収穫

  1. 骨格成熟した動物(犠牲の時に18〜24ヶ月齢)から牛の息苦しい関節を使用し、犠牲後24時間以内に解剖するまでそれらを封じ込めて冷却する。
    注:ジョイントは地元の肉屋から購入されます。関節は解剖するまで閉じたままである。
  2. 無菌条件下で円筒状の骨軟骨栓を収穫するために、膝を消毒し、関節切除術を行い、内側大腿骨顆を露出させる。
    注:解剖は関節面を損傷しないように注意して行う必要があります。
  3. 関節面に大当てな損傷がないか調べます。
    注:軟骨が白っぽく滑らかで光沢のある外観を欠いている場合、または水ぶくれ、裂け目、またはより大きな欠陥がある場合は、サンプルを廃棄します。
  4. 重量軸受領域の関節面に垂直な切断チューブを位置合わせし、ハンマーでしっかりしたストロークで軟骨と軟骨下骨にデバイスを駆動します。15 mm の貫通深さで、突発的な動きで時計回りにデバイスをねじります。
  5. デバイスを取り外し、白いノブを挿入し、骨軟骨プラグの下端が見えるまでねじ込みます。
  6. テスト中に骨軟骨シリンダーを配置するために、滅菌マーカーでサンプルの後部の向きをマークします。
    注:3次元コラーゲンネットワークとその複雑なアーキテクチャは、関節軟骨のユニークな機械的特性を容易にし、サンプルの向きに考慮する必要があります。
  7. リン酸緩衝生理食塩血(PBS)でサンプルを洗い流し、血液と脂肪組織を洗い流します。
  8. 上記の手順を繰り返して、所望の数の骨軟骨プラグ(直径8mm、長さ15mm)を収穫します。
    注:典型的には、9〜12個の骨軟骨シリンダーは、内側大腿骨顆の体重負荷領域から収穫することができる。
  9. サンプルは、10%の胎児ウシ血清を含むダルベッコの改変イーグル培地に入れ、抗生物質(ペニシリン200 U/mL;ストレプトマイシン0.2mg/mL)とアンホテリシンB 2.5 μg/mLを補い、生存率を維持するために4°Cで保存します。
  10. 収穫直後にコントロール骨軟骨プラグを分析し、ベースライン値を確立します(分析セクションを参照)。

3. トライボロジー試験

  1. シリンダーオンプレート構成で市販の往復トリボメータを用いて実験を行う。デバイスの要件は、垂直ローディングと調整可能な負荷とスライド速度です。さらに、液体電池は、潤滑液中の試験を行うことが可能である。
  2. 圧力測定フィルムを使用して、CoCrMo-オン・軟骨システムの接触圧力を決定します。圧力測定フィルムをインターフェースに置き、30sの静的負荷を加え、初期接触圧力、接触サイズ、形状を決定します。金属シリンダーと関節軟骨の凸度により、初期接触面積はこの構成で楕円形状を有する。
    注:圧力測定フィルムは、閾値圧力に達したか超えたゾーンの赤色の変色を示す加圧に反応します。1Nの負荷について、接触圧力は、定義された接触圧力との視覚的比較によって2MPaの周りを決定した。
  3. 下のサンプルホルダーの骨軟骨シリンダーをスライド方向に合わせたマーキングで固定し、CoCrMoシリンダーを上部のロードセルに取り付けます。
  4. 骨軟骨シリンダーを水没させ、金属軟骨スライディングインターフェースを覆う液体細胞にテスト溶液(3 g/Lヒアルロン酸を含むPBS)を加えます。
  5. テストパラメータ(通常の力、ストローク、スライド速度を規定)を設定し、テスト全体を通して適用および維持します。
    注: 往復モーションのストローク長は、移動する接触領域(MCA)を作成するために接触領域に応じて設定する必要があります。直径8mmのプラグの場合、2mmストロークで軟骨の十分な水分補給が可能です。
  6. 設定された負荷パラメータを使用して、潤滑液に浸した関節軟骨に対してCoCrMoシリンダーの逆スライディングを開始します。
  7. 実験中に摩擦係数(COF)を監視します。
    注: COF は自動的に評価されますが、式 μ=F/W (μ - 摩擦係数) を使用して計算できます。F - 摩擦力。W - システムによって適用される通常の負荷)。
  8. 目的のテスト期間の後に実験を終了します。
  9. サンプルホルダーから骨軟骨プラグを取り出し、PBSですすいで、さらなる生物学的分析まで培地に保存します(下記参照)。
  10. 試験中は常温で試験液に制御サンプルを沈め、機械的荷重にさらされたサンプルと一緒に分析します。

4. 分析

注:骨軟骨シリンダーは、生物学的活性を調査するために代謝活性と遺伝子発現について分析されます。軟骨表面の完全性と基礎行列を研究するために、神学が行われる。

  1. 組織
    1. 組織学的分析のために、骨軟骨プラグを4%緩衝されたホルムアルデヒド溶液に浸漬し、さらに処理するまで室温で。
    2. PBSでサンプルをすすいでプラスチック容器に入れます。
    3. すべてのサンプルがカバーされるように、すぐに使用できるデカルシファイアソリューションの過剰を追加します。
    4. 完全なデケイシングのために4週間一定の攪拌を適用します。
    5. 脱灰後、水溶性グリコールや樹脂にサンプルを埋め込み、−80°Cで保存します。
    6. 接触領域に対して横断的に切除することにより、6μmのセクションを得ます。
    7. その後、メーカーのプロトコルを使用して、サフラニンO染色とファストグリーンカウンターステインのサンプルを準備します。
    8. 顕微鏡を使用して組織学的画像をキャプチャし、イメージング処理ソフトウェアを使用して処理します。
  2. 代謝活性
    注:関節軟骨中の軟骨細胞の代謝活性は、XTTベースのエクスビボ毒物学アッセイで調べられます。
    1. PBSを使用して骨軟骨栓をすすいで、ペトリ皿にサンプルを入れます。
    2. 24ウェルプレートをスケールに配置し、スケールをゼロにします。
    3. 骨軟骨移植片から軟骨をメスで切り落とします。
    4. 接触領域が両方の軟骨片に均等に分配され、半分から1mm³の部分にミンチされるように、軟骨を2つの等しい部分に二分します。後半は遺伝子発現解析に使用されます。
    5. 細かく軟骨を調製した24ウェルプレートの1つのウェルに移し、組織重量を決定します。
    6. 各サンプルについて上記の手順を繰り返し、各プレートのウェルに1mLの成長培地を加えます。
    7. メーカーの指示に従ってXTT溶液(XTTラベリング試薬490μL、活性化試薬10μL)を追加します。
    8. プレートを37°Cで、5%CO2で4時間インキュベートします。
    9. インキュベーション後、上清を取り除き、5 mLチューブに移します。
    10. 24ウェルプレートの軟骨組織に0.5mLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えてテトラゾリウム製品を抽出し、室温で1時間連続撹拌します。
    11. DMSO ソリューションを削除し、以前に収集した XTT ソリューションとプールします。
    12. プレートリーダー上の96ウェルプレートにトリクリケートでサンプル100μLを転送し、波長492nmの吸光度と690nmの基準波長を測定します。
    13. 得られた吸光度値を各サンプルの湿重量に正規化し、ソフトウェアを使用して解析を実行します。
  3. 遺伝子発現解析
    1. RNA分離
      注:RNAの分離は、小さな修正で製造業者が提供する指示に従って、市販キット(材料表)を使用して行われます。
      1. 骨軟骨栓から得られた軟骨組織の後半を小片にミンチする。
      2. セラミックビーズと300 μLのライシスバッファー(1%β-メルカプトエタノールを含む)を含むチューブに移します。
        注:サンプルは、さらに処理されるまで液体窒素で凍結することができます。
      3. サンプルを2分間解凍し、組織の均質化のために市販のライザーを使用します。6500 rpmを20s(均質化ステップ)に対して、各実行後(市販のライザー冷却装置を使用して4°Cで)2分間の冷却段階で4回塗布し、組織を完全に破壊する。
      4. 各チューブに20μLのプロテイナーゼKと580μLのRNaseフリーウォーターを加え、55°Cで30分間インキュベートします。
      5. サンプルを10,000 x g で3分間遠心し、上清を1.5 mLチューブに移します。
      6. 各チューブに90%エタノールの0.5量を加え、混合します。
      7. サンプル700μLを、2mLのコレクションチューブに入れたRNA結合カラムに移し、遠心分離機を8,000 x g で15秒にします。
      8. フロースルーを破棄し、完全なライセートの遠心分離ステップを繰り返します。
      9. 350 μL のバッファー RW1 をカラムに加え、遠心分離機を 8,000 x g で 15 s に加え、フロースルーを破棄します。
      10. DNaseストックソリューションの10 μLと70 μLのバッファRDDを混合します。溶液をRNA精製膜に加え、室温で15分間インキュベートします。
      11. 350 μL のバッファー RW1 をカラムに加え、遠心分離機を 8,000 x g で 15 s に追加します。フロースルーを破棄します。
      12. バッファー RPE と遠心分離機を 500 μL 8,000 x g で 15 s に加えます。フロースルーを破棄します。
      13. 500 μL のバッファー RPE を RNA 精製カラムに加え、遠心分離機を 8,000 x g で 2 分間追加します。
      14. カラムを1.5mLの回収チューブに入れ、30μLのRNaseフリー水を加えます。遠心分離機は8,000 x g で1分間です。
      15. cDNA合成まで、単離したRNAを-80°Cで保存します。
    2. cDNA合成
      注:メッセンジャーRNA(mRNA)から相補DNA(cDNA)を合成するために、市販キット(材料表)を使用しました。細菌由来のRNA MS2を付加し、cDNA合成中に単離されたRNAを安定化させた。
      1. 試薬を解凍して混ぜます。単一反応の組成物を 表1に示す。
      2. 1回の反応(14 μL)の場合は、16 μL の RNA サンプルをボリュームに加えます。
      3. サーマルサイクラーでcDNA合成を行うパラメータは、25°Cで10分(プライマーアニーリング)、50°Cで60分(DNA合成)、85°C(変性)で5分、20°C(冷却段階)で5分。
      4. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)まで-20°CでcDNAを保存します。
    3. RT-qPCR
      注: ウシサンプルの RT-qPCR の場合、 プライマーおよびプローブは、GAPDH(グリセアルデヒド3-リン酸脱水素酵素)、COL2A1(コラーゲンタイプ2)、ACAN(アグレカン)、COL1A1(コラーゲンタイプ1)、MMP-1(マトリックスメタロプロテイナーゼ-1)、およびMMP-13(マトリックスメタロプロテインサーゼ-1)に対して市販のリアルタイムqPCRソフトウェア(例えば、IDT)を使用して設計された。ウシプライマーおよび二重急入プローブは、IDTによって提供された。効率と遺伝子発現を評価する単一反応に用いる試薬を表2に示す。
      1. 96ウェルPCRプレートの各ウェルに単一の反応(9 μL)のマスターミックスを分配し、各反応に1μLのcDNAを加えます。トリクリケートで各サンプルの検定を実行します。
      2. シーリングオイルと遠心分離機を使用してPCRプレートを閉じ、877 x g で4°Cで10分間閉じます。
      3. 10分間の95°C、増幅の45サイクル(10sの95°C、30 s、cDNA合成のためのアニーリング)、30 sのための37 °Cのプロトコルを用いて、精密サーマルサイクラーを使用してRT-qPCRを行う。
        注: プライマーごとに特定のアニーリング温度が必要です。
      4. 効率を確認するために、標的遺伝子と一緒にGAPDHを使用してください。
      5. 提供されたソフトウェアを使用して、各遺伝子の効率を計算します。
      6. サイクル閾値(CT)を参照遺伝子GAPDHの発現に正規化し、ΔΔCT法を用いて定量化する。

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結果

接触面積と接触圧力は、圧力測定フィルムを用いて確認する必要があります(図1)。生理学的負荷状態は、定義された接触圧力の基準インプリントと比較することによって確認することができる。試験中、摩擦係数は常に監視されます。移動接触領域を使用すると、低摩擦係数を少なくとも1時間維持できます(図2)。細胞外マトリックス組成および構造を染色するサフラニンOを用いて、決定することができる(図3)。サフラニンO染色の強度は、プロテオグリカン含有量に比例します。高速グリーンは、非コラーゲン部位を対抗し、サフラニンO染色と明確なコントラストを提供します。プロテオグリカンの含有量は関節面上で変化するが、ベースラインサンプルの組織セクション全体で均一であるべきである(図3A)。テストソリューションに沈んだ制御サンプルは、機械的負荷によって打ち消すことができるGAGsの抽出を示しています(図3B、3C)。

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ディスカッション

焦点金属インプラントは、骨軟骨欠損のサルベージ手順を表し、特に中年患者および一次治療に失敗した後である。臨床研究は有望な短期的な結果を示したが、1つの観察された合併症は、反対の、ネイティブ軟骨10への損傷である。死体および生物機械学的研究は、平坦またはわずかに凹んだ位置付けによる適切な移植が自然な接触圧力19を維持するという明確な証拠を示す。トライボロジー実験は、インビトロで様々な軟骨の組み合わせをテストする可能性を提供します。このような場合、荷重条件、潤滑、材料の組み合わせ、および持続時間が必要に応じて調整される場合があります。

牛の軟骨は、地元のアバトワールで大量に入手可能です。細胞性とゾーナル構造は、ヒト大腿骨顆20と非常によく似ている。しかしながら、プロテオグリカン含有量は部位特異的であり、一方、遺伝子発現レベルは関節面上で均一であることが示されている。このプロトコルでは、骨軟骨栓を体重負荷領域から収穫した。軟骨の厚さ、コラーゲンア...

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開示事項

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、NÖフォルシュングス-ウントビルドゥングスゲス.m.b.Hによって資金提供されました。ライフサイエンスコール(プロジェクトID:LSC15-019)とオーストリアのCOMETプログラム(プロジェクトK2 XTology、グラントNo.849109)による、下オーストリアの州政府。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アムホテリシンBシグマ?Aldrich Chemie GmbHA-2942-100ML
緩衝ホルムアルデヒド溶液 4%VWR97131000
細胞増殖キット II (XTT)Roche Diagnostics11465015001XTTベースのex vivo毒性アッセイ
CoCrMo 原料Acnis InternationalCoCrMo ロッド 直径 6mm
CryoStar NX70 CryostatThermo Fischer Scientific凍結切片装置
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sidma-Aldrich ChemieD 2438-10ML
ダルベッコ'修正されたイーグル」s ミディアムシグマ?Aldrich Chemie GmbH中
型ウシ胎児血清Gibco
ヒアルロン酸アニカ・セラピューティクス株式会社潤滑液の成分
iCyclerBioRadサーマルサイクラー
ライカ顕微鏡 DM?1000組織学用ライカ
LightCycler 480 シーリングホイルロシュ・ダイアグノスティック
LightCycler 96ロシュ・ダイアグノスティックPCR 用サーマルサイクラー
MagNA ライザー グリーンビーズロシュ・ダイアグノスティックス
骨軟骨自家移植システム(OATS)Arthrex Inc.骨軟骨シリンダーを収穫するためのカッティングチューブ
骨軟骨メルク1017279010脱灰剤溶液
ペニシリン/ストレプトマイシンシグマ?Aldrich Chemie GmbHP4333-100ML
リン酸緩衝生理食塩水シグマ?Aldrich Chemie GmbHPBS
プレスケール 低圧Fujifilm圧力表示フィルム
RNeasy 繊維組織キットQIAGEN74404
Synergy 2BioTek Instrumentsプレート リーダー
テトラ?Falex MUSTFalexトライボロジートライボメータ
ティッシュ?テックOCTSAKURA4583包埋製剤
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis KitRoche Diagnostics40897030001
&β;-mercaptoethanolSidma-Aldrich ChemieM3148
顕微鏡ス ス 3358941001

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