数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

サマリー

このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。

要約

本論文では、バイオAFM実験と力曲線の記録を自動化することを目的とした方法を紹介します。この方法を使用すると、1000個のセル上の力のカーブを4時間に自動的に記録することができます。4時間の解析時間を維持するために、セルあたりの力曲線の数は9または16に減少する。このメソッドは、Jython ベースのプログラムと定義されたパターンでセルを組み立てる方法を組み合わせたものです。商用Bio-AFMに実装されたこのプログラムは、配列の最初のセルに先端を中央に配置し、各セルに力曲線を記録しながら自動的にセルからセルに移動することができます。この方法論を用いて、それらの剛性、接着特性などの細胞の生物物理学的パラメータにアクセスすることが可能である。自動化と多数のセルが分析された場合、セルの母集団の動作にアクセスできます。これは、データがこれまでに数十個の細胞に記録されているBio-AFM分野のブレークスルーです。

概要

この研究は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて何百もの生きた細胞に対して自動力測定を行う方法を提供する。また、液体環境で行われたAFM実験と互換性のあるPDMSマイクロストラクチャードスタンプ上の微生物を固定化する方法も提供します。

バイオAFMは生物学の応用のために考案された高度に専門化された技術であり、その後、生きた細胞を研究するために使用されます。その時に1つの細胞を分析できる訓練を受けたエンジニアが必要です。これらの条件では、分析できる異なる細胞の数は、むしろ少なく、4〜5時間で典型的な5〜10個の細胞である。しかし、単一のセルに記録された力の量は通常非常に高く、簡単に1000に達することができます。したがって、現在の生細胞のAFM力測定のパラダイムは、数百の力曲線(FC)を記録するが、限られた数の細胞に記録する。

統計的には、このアプローチは疑わしく、サンプルの代表的な問題を提起します。実際、数百個の測定が数百個の細胞に記録されていても、例えば、数個の細胞のみを測定して細胞集団の不均一性を評価することは困難である。しかし、生物物理学、微生物学、ナノメディシン^1、2、3において大きな進歩がなされたのはこのパラダイムに基づいています。実際、単一細胞の規模でのナノメートル分析は、細胞ナノメカニクスに関する新しい情報を提供し、膜貫通タンパク質の組織、または抗菌薬または抗癌剤の作用機構^{4、5、6、7}を提供^している。しかし最近、細胞に対して行われたいくつかのハイスループットバイオメカニカル試験が⁸に出現し、このパラダイムを変え、細胞集団の不均一性にアクセスすることに対する科学界の関心を示している。これらのテストはすべて、マイクロ流体システムに依存して細胞を変形させ、応力下での変形を光学的に測定して、表面全体の弾性8の間接的な尺度を得^る。しかし、これらの方法の重要な問題は、それらがモノパラメトリックであるということです:唯一の細胞の弾力性をプローブすることができます。さらに、それらは、例えば非循環哺乳類細胞またはバイオフィルムの研究のために制限することができる接着細胞の機械的パラメータの測定を可能にしない。

AFMを含むアプローチは、S.シューリング⁹ とM.ファ^ーヴル10のチームによって開発されました。Scheuringら. フィブロネクチンパターン⁹上の固定化細胞は、個々の細胞がパターン⁹の形状を取ることを強制する。その後、このチームは、14〜18個のセルを代表する平均データを定義するために、いくつかのセルの機械的特性をマッピングしました。Farveららによって行われた開発は、AFM片持ち¹⁰を並列化して測定値を多重化することを目的とした。私たちの知る限りでは、多重化方向のこの研究は、生きている細胞の測定につながっていません。

Dujardinのチームが提案した興味深いアプローチは、細胞を識別し、カスタムメイドの井戸の底でそれらをイメージングすることができる自動化されたAFMを提示します。この方法では、細胞の大規模な集団の分析を可能にしませんが、それは各ウェル¹¹で異なる条件の自動テストを可能にします。

この研究における私たちの目的は、平均細胞ではなく、逆に細胞間の不均一性にアクセスするために少なくとも1000個の細胞を測定したかったので、より野心的です。ここで AFM を用いて細胞集団の不均一性にアクセスするために開発した戦略は、限られた数の力曲線が記録されている数百の細胞の分析に基づいています。限られた数のセルに多数の力曲線を記録する「古典的な」アプローチと比較して、このアプローチは同じ情報を提供しないので、補完的なものとして考慮されるべきです。実際、典型的な方法では個々の細胞表面の不均一性を探査することができますが、我々のアプローチを使用して、細胞集団全体の不均一性にアクセスすることができます。この目的を達成するために、微生物(ここでは酵母種 カンジダ・アルビカンス)をPDMSマイクロストラクチャースタンプ¹²の井戸に直接固定化する方法を組み合わせ、AFM先端を自動的に細胞から細胞¹³ に移動させ、各細胞の機械的特性を測定するオリジナルプログラムを開発しました。

プロトコル

1. 微生物細胞培養

1. グリセロールストックから細胞を再び再生します。
   注 :C.アルビカンは 、大理石の上に、グリセロールストックで-80°Cで保存されています。
   1. 80°Cストックの大理石を選び、酵母ペプトンデキストロース(YPD)寒天にこすります。液体培養前に30°Cで2日間細胞を増殖させます。
2. 液体培養を準備します。
   1. 培養管に5 mLの無菌YPDブロスを充填し、YPD寒天プレート上で増殖した C.アルビカンス 細胞の単一コロニーを追加する。
   2. 遠心分離(4000 x g、5分)で収穫する前に、30°Cで20時間静電気条件で培養を成長させます。上清を捨て、バイオハザード廃棄物として排除します。
   3. ペレットを10 mLの酢酸緩衝液(8 mM酢酸ナトリウム、1 mM CaCl_2、1mM MnCl_2、pH5.2)で2倍洗います。洗浄の合間に遠心分離機(4000 x g、5分)
   4. 2 mLの酢酸バッファーにペレットを再懸濁し、PDMS スタンプ上の細胞固定化にこのソリューションを使用します。
      注: このサスペンションは保管できず、セクション3に対して新たに準備する必要があります。

2. PDMS スタンプの準備

1. シリコンマスターモールド調製
   1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、所望の微細構造を描きます。
      注:設計された井戸は、トラップする微生物と同様の大きさでなければなりません。この設計では、リストに井戸100 x 100の大きな行列を提供する必要があります。微生物の平均サイズを中心に、サイズが若干異なる配列をいくつか作るのが最適です。
   2. クリーン ルームが利用可能な場合は、前に公開したプロトコル 12 の手順 2 から^{12 に}従います。それ以外の場合は、シリコンマスター金型は、商業クリーンルーム設備から取得することができます。
2. PDMS スタンプ成形
   1. 10~1の混合物を含むPDMSプレポリマー溶液の55gを調製し、質量比、PDMSオリゴマーおよび硬化剤(材料表)の。
   2. PDMS溶液からすべての閉じ込められた気泡が取り除かれるまで、真空下でこの溶液を混合して脱ガスします(10^-1-10-2バーの範囲)。
   3. シリコンマスターモールドと脱気体に20gの脱気液を注ぎ、再び(10^-1-10-2バーの範囲で)
      注: スタンプの厚さは 2~3 mm 前後にする必要があります。
   4. すべての気泡を除去したら、1時間の間に80°CでPDMSを網状にする。
   5. PDMSマイクロストラクチャースタンプをメス(0.5 x 1.5 cm²⁾で、可視の微細構造アレイに平行な方向に切ります。
   6. シリコンマスターモールドからスタンプを剥がします。
   7. スタンプを戻して上側の微細構造を示し、ガラススライドに貼り付けます。マイクロ構造をガラススライドから離して見て下ろしてください。スタンプに表示される微細構造を、後で AFM 自動化手順の基準となるガラススライドの側面に合わせます。
      注: この段階では、PDMS スタンプはセル固定化の準備ができています。PDMS スタンプは、シリコンマスターモールドに数か月間保管できます。すべてのPDMSがマスターモールドから取り外されると、新しいPDMSスタンプをマスターモールドに再び鋳造することができる(マスターモールドを安全に保つために、ポリウレタンで複製することが可能である^)14。

3. サンプル準備

1. 細胞固定化
   1. 遠心分離機(500 x g,5分)600 μLの再懸濁液溶液を細胞からバッファーを分離する。
   2. ステップ3.1.1からPDMSスタンプに上澄み出し200μLをピペットし、真空下で^(10-1-10-2バーの範囲で)約40分間の脱ガス。
      注:このステップは、ウェル内の細胞固定化を改善するために重要です。上清に存在する酵母細胞壁からの分子は、おそらくこの前湿潤工程中にPDMS表面に沈着する。これらの分子は、おそらく、細胞の接着を増強し、スタンプ充填率の増加に寄与する。
   3. 40分後、ピペットで、PDMS表面からバッファーを取り出し、堆積物、ピペット、ステップ1.2.4から200 μLの細胞溶液を室温で15分間行います。
   4. 対流/毛管アセンブリによってスタンプの微細構造に細胞を置きます。そのためには、30~50°の角度でガラススライドを使用してスタンプ全体に200μLのセルサスペンションを手動で広げます。高い充填率を達成するためにスタンプ上にガラススライドを数回通過させる必要があるかもしれません。
      注: この方法の完全な説明は¹³です。
   5. ピペットで細胞懸濁液を取り除きます。スタンプ3xを1mLの酢酸緩衝液で洗浄し、pH5.2をトラップされなかった細胞を除去する。
   6. スタンプが乾燥したペトリ皿に付着するように、窒素フローを使用してスタンプの背面を乾燥させます。
   7. 最後に、セルを充填したPDMSスタンプをペトリ皿(材料表)に堆積させ、2 mLの酢酸緩衝液を充填して細胞を液体培地に保持します。
2. AFM ステージでのスタンプの設定
   1. AFM 操作を開始する場合は、ステージを 0:0 に中央に配置します。
   2. アンセイら¹⁵の説明に従ってガラスおよび水中のカンチレバーの感度とばね定数を校正する
   3. スタンプとペトリ皿を取り、AFMペトリ皿ホルダーに置きます。
   4. ペトリ皿ホルダー Y 軸に垂直なスタンプエッジを揃えます。
      注: 許容される傾斜角度は 、図 1に示すように 5° 未満です。
   5. AFMヘッドをステージに置き、スタンプにチップが衝突するのを避けるためにステッパーモーターが十分に伸びるように注意してください。

4. AFM プログラムの実行

注: AFM プログラムは 補足資料 として提供されます (オートマチップSoftware2019.pdf)。これは、電動ステージとJPKデスクトップソフトウェアバージョン4.3を搭載したJPK-ブルカーAFMナノウィザードIIまたはIIIが必要です。プログラムはJythonの下で開発されました (Python 2.7に基づくバージョン)

1. データ取得
   1. AFM光学顕微鏡を使用して、4.5 x 4.5 μm² ウェル(セルサイズに対応)の左隅の上にAFMチップを中央に配置します。別のウェルサイズが必要な場合は、目的のウェルの左上隅を中央に配置します。
   2. 100 x 100 μm² の面積で、64 x 64 フォースマップ(Z 範囲 = 4 μm、先端速度 = 90 μm·s^-1、加えた力 3 ~ 5 nN)を実行します。[計測モード]ドロップダウン ボックスから[マッピング モードを強制]を選択します。強制制御マッピング・パネルで、次のパラメーターを入力します。z長さ4 μm;Z移動:一定の持続時間;延長時間: 0.01s;内線遅延:0;Retr遅延:0、遅延モード:一定力、サンプルレート2048 Hz。Z クローズド ループチェックを解除します。グリッド:チェックスクエア画像、高速100 μm、低速:100μm、Xオフセット:0 μm;Yオフセット:0 μm。グリッド角度:0度。ピクセル: 64x64;ピクセル比: 1:1
      注 : 一般的な結果を 図 2に示します。この画像は、2つの井戸間のピッチを測定し、検証するのに役立ちます。
   3. 左上ウェル(W1)と左下ウェルの中心の座標( 図2ではW2と呼ばれる)に注意してください。そのためには、井戸の周りに正方形の箱を作ります。ボックスの中央の座標は、AFM ソフトウェアの左パネルに X、Y 座標ボックスに表示されます。
   4. オートメーションソフトウェア(Automatip_scan.py)を開くには、JPKデスクトップソフトウェアでトップバーメニューのアドバンスをクリックし、スクリプトを開くを選択します。開いたウィンドウで、「 補足データ 」(Automatip_scan.py)で提供されているスクリプト ファイルのパスを選択します。
   5. Jython スクリプトの入力ボックスセクションに W1 座標と W2 座標値を実装します (図 3)。スクリプトのP1変数行239にW1座標を入力し、P2変数行241にW2座標を入力する。
      注: 初期座標(W1 と W2)として選択したウェルは、スキャン領域の端から近すぎないようにしてください。そうでなければ、ウェルの両側のPDMS表面の高さを測定する必要があるため、中央集中アルゴリズムは正しく実行されません。例については、図 4を参照してください。
   6. ピッチ値をスクリプトのピッチ変数行245に帰属する。
   7. Ws変数行 248 に井戸寸法を入力します。これは、ウェルパターンの設計から知られており、ピッチの検証に使用したものと同じ画像で確認することができます(図2)。
   8. データを希望の場所に保存するために、251行目に保存ディレクトリへのパスを書き込みます。
   9. totalArea可変ライン254を100μmの欲求倍数"n"に設定します(これは使用されるAFMの最大スキャン領域です)。プローブされるウェルの合計数は、この値とピッチ(最大スキャンエリア/ピッチ*n²⁾を使用して計算できます。
      注: 図 3の例では、100 x 100 μm² の 9 個の領域が解析されます。
   10. numScans変数行 257 に、ウェルごとに記録される力曲線行列、行および列 (3、3 または 4、4) を設定します。
       注: 図 3の例では、各ウェルに対して 3 x 3 = 9 個の FC のマトリックスが記録されます。
   11. プログラムを実行します。 [スタート ]ボタンをクリックします。
       注:プログラムは、最初に自動的に中央のアルゴリズムを実行して、W1とW2ウェルの中心をより適切に決定します(ステップ1)。次に、最初のスキャン領域の各ウェル上のフォースカーブ(FCs)行列を自動的に取得します(ステップ2)。その領域のすべてのウェルがプローブされると、スクリプトは自動的に AFM チップを次のスキャン領域の最初のウェルに移動します。先端が引き込まれ、顕微鏡の段階が次の領域に移動し、先端がスタンプに再び近づき、中央のアルゴリズムが再び実行され、その領域の最初のウェル(1')に自動的に再センタリングされます(ステップ3)。最初の領域はユーザによって定義され、2番目の領域は、nに達するまで右側等にある。n+1領域はnの下、n+1の左側のn+2、2nに達するまではn+2です。2n+1は2nの下にあり、2n+2は2n等の右側にあります。世界的に、先端は総面積を通って蛇行する。ステップ 2 と 3 は、スキャン領域の合計数 "n²" が調査されるまで自動的に繰り返されます。 図 5 は、プログラムのフローチャートを示しています。プログラムを完了するには約4時間かかります。
2. データ分析
   1. 「ファイルのコピー」python スクリプト(Copy_files_L.py、 補足データに記載) を実行して、FCs ファイルを 1 つのフォルダーに整理します。このスクリプトは、Python 2.7 と SciPy モジュールで開発されました。Python スクリプトを開くには、Visual Studio コード ソフトウェアを使用します。一般フォルダへの入力パス (補足データで提供されるスクリプトの 67 行目) と、それが格納される場所 (73 行目)。
   2. AFMメーカーのデータ処理ソフトウェアを開いて、力曲線を解析します。トップメニューの [ファイル]で、[分光法曲線のバッチを開く]を選択します。
   3. バッチ処理ウィンドウで、 補足データ (StiffnessProcess.jpk-proc-force) で提供されるプロセスを選択します。プロセスの最後のステップを選択し、[ 保存してすべてに適用] をクリックします。すべての力のカーブは同じ処理を受けます。
      注: このプロセスでは、FCs ファイルのキャリブレーションを使用して、偏向曲線をニュートンで調整されたフォース カーブに変換します。データ平滑化アルゴリズムが適用されます(平均3連続ポイント)。ベースラインは、ゼロ軸上の静止に変換されます。接触点が外挿され、FC がオフセットされて接触点が座標(0,0)に配置されます。片持ちの曲げがFCに差し引かれると、後退傾斜が取り付けられます。データ処理の最後に、ソフトウェアは各FCに与えるテーブルを含むファイルを生成します:その名前、ヤングモジュラス、接触点、接着力、斜面など。
   4. すべての実験について、手順 4.2.1 ~ 4.2.3 を繰り返します。データを別のフォルダに保存するように注意してください(つまり、"...\TREATED\"と"...\UNTREATED\")。
   5. 補足データに用意されている R スクリプトを使用して、ヒストグラムと箱ひげ図をプロットし、ANOVA 統計処理を実行します。
      1. R スクリプト (DataAnalisys.R) を開くには、R studio ソフトウェアを使用し、データ処理ソフトウェア (.tsv) で抽出された情報を含むファイルを読み込みます。
      2. 環境ウィンドウで[データセットの インポート] ボタンを使用し、表示されたリストから テキストから選択(readr) を選択し、新しいウィンドウで [ブラウザ ]ボタンを選択して.tsvファイルを見つけます。
      3. ファイルがロードされたら、解析に含める列(剛性と接着性)を選択します。すべてのコードを実行するには 、Ctrl + Alt + Rキーを押します。
         注: スクリプトは 4 つのデータセットで動作し、未処理のセルと処理されたセルの両方を持つ 2 つの実験を検討します。スクリプトのブロックを実行し、実行される関数に応じて変数がどのように変化するかを確認することができます。

結果

我々は、カスポフィンの効果を分析するために記載されたプロトコルを使用して、その酵母の形態における日和見ヒト病原体C.アルビカンの生物物理学的特性に及ぼす影響を分析した。カスポフィンは、細胞が抗真菌剤に対して開発する耐性メカニズムのために他の薬物が効果がないときに使用される最後のチャンスです。その作用機序は、ßグルカン合成を担う複雑なfks1/Fks2のサブユニットFks2の阻害に基づいている。ßグルカンは真菌細胞壁^16,17の主要成分であり^、細胞壁の生体物理特性の変形を期待した:剛性および接着性。

図6 は、上記のプロトコルがすべて適用されたときに得られる典型的なヒストグラムを示しています。赤いヒストグラムは、957個のネイティブ細胞に記録された剛性再パーティション化と574カスパポフィン処理細胞の青い細胞を表します。最初の興味深い観察は、両方のヒストグラムが値のバイモーダル分布を示してい...

ディスカッション

この方法論によって提供される主な改善は、一定の時間で測定された細胞の数の有意な増加である。対応する値は、セル当たりのポイント数の減少です。これは、この方法が単一のセルの詳細な分析を提供するように設計されていないことを意味します。この方法は、PDMS スタンプのウェルに収まるセルにのみ適用されます。スタンプは非常に汎用性が高く、1.5 x 1.5 μm² のウェルが 6 x 6 μm²まで含まれています。それでも、バチルスやはるかに大きな細胞を固定することは不可能です。スタンプと毛細管対流堆積は、はるかに大きい哺乳類細胞(長さ約100μm)を固定化するために使用することはできません。

この文脈において、Peric et al.¹⁹ は 、大腸菌 および枯草菌のようなバチルスを固定化するスマートマイクロ流体装置 を開発した。 この装置は、定義された位置および生理学的条件下でバチルスを固定化することを可能にする。このデバイスの特定のサイズにソフトウェアを適応させ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AFMカンチレバー	Bruker AFMプローブ	MLCT	使用されたカンチレバーは「C”共振周波数が7 〜 10 kHz および k: 0.01 N/m
AFM AFM データ分析	JPK-Bruker	JPK データ処理バージョン最小 5.1.8	JPK-Bruker ユーザーアカウント
AFM シャーレ	WPI	FluoroDish FD35-100	ヒーターは、実験中の温度変化を監視するために使用されました
原子間力顕微鏡 (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II または III	AFMは、電動ステージを備えた倒立光学顕微鏡に取り付ける必要があります
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofunginは、4 MIC(最小阻害剤濃度)の濃度で使用されましたコード
エディタ	Microsoft	Visual Studio Codeバージョン1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessicator/Degassingチャンバー	フィッシャーブランド	15594635	この装置は、真空ポンプと組み合わせた任意のデシケーターで約50分間PDMSスタンプを脱気するために使用されます。
ペトリ皿ヒーター	JPK-Bruker	PetriDishHeater	JPK/Bruker AFMのアドオンです。このヒーターは、実験中の温度変化を監視するために使用されました
酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899	溶液には、18 mM 酢酸ナトリウム、1 mM CaCl2、1 mM MnCl2 が含まれています。氷酢酸で pH を調整します。溶液は4°Cで保存できます。C for 2 months
統計分析言語	https://www.r-project.org	R バージョン 3.6.1	R は、統計計算とグラフィックスのための言語および環境です。これは、R
スタジオバージョン1.1.463	https://rstudio.com	統計分析ソフトウェア	。RStudioとShinyは、オープンアクセス統計財団の関連プロジェクトです
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydimethylsiloxane(PDMS)と硬化剤を1セットに
酵母 ペプトンDブロス	Difco	242820
YPD 寒天	Difco	DF0427-17-6