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方法論記事

ヤヌスベースナノチューブと幹細胞接着のためのフィブロネクチンによるバイオミメティックナノマトリックスの製造

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DOI:

10.3791/61317

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2020年5月10日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

この記事について

サマリー

このプロトコルの目的は、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)とフィブロネクチン(FN)を用いたバイオミメティックナノマトリックス(NM)の組み立てを示すものです。ヒト間葉系幹細胞(hMCs)と共培養すると、hMSCの接着を促す優れた生理活性を示します。

要約

バイオミメティックNMは、幹細胞の停泊を高めることができる組織工学的な生物学的足場として機能するように開発されました。バイオミメティックNMは、水溶液中の自己集合体を介してJBNTおよびFNから形成される。JBNTは、内部疎水性中空チャネルおよび外親水性表面で200〜300 μmの長さを測定します。JBNT は正に充電され、FN は負の電荷を受けます。したがって、中性水溶液に注入すると、非共価結合を介して結合してNMバンドルを形成する。自己組立プロセスは、化学イニシエーター、熱源、またはUV光なしで数秒以内に完了します。NM溶液のpHがFNの等電点(pI 5.5-6.0)より低い場合、正に帯電したFNが存在するため、NMバンドルは自己放出します。

NMは、形態学的に細胞外マトリックス(ECM)を模倣することが知られており、したがって、注入スキャフォールドとして使用することができ、これはhMSC接着を強化するための優れたプラットフォームを提供する。細胞密度解析および蛍光イメージング実験は、NMsが陰性対照と比較してhMSCのアンカレッジを有意に増加させたことを示した。

概要

ヒト間葉系幹細胞(hMCs)は、異なる間葉系に沿った自己再生および自己分化の可能性を示しており、組織の再生および維持に役立つ1。分化ポテンシャルに基づいて、hMCCは間葉組織損傷および造血障害療法2の候補と考えられている。hMSCは、組織修復、血管新生、および炎症を軽減することによって創傷治癒を促進する能力を示した3。しかし、生化学的またはバイオマテリアルの援助がなければ、hMSCが目的の場所で標的組織に到達し、機能する効率は低い4である。様々な設計された足場が病変に付着するhMSCを引き付けるために利用されてきたが、成長板骨折のようないくつかの部位は、長い骨の真ん中に、不規則な形をした傷ついた部位に完全に適合しない可能性がある従来のプレハブ足場によって容易にアクセスできない。

ここでは、その場で自己集合し、標的領域に到達しにくい場所に注入できるバイオミメティックナノ材料を開発しました。注射用バイオ足場NMは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)およびフィブロネクチン(FN)で構成されています。JBNTは、ロゼットナノチューブ(RNT)とも呼ばれ、DNA塩基対、具体的にはチミンとアデニン、ここでは5、6、7に由来する。図1に示すように、ナノチューブは、6分子の由来DNA塩基が水素結合を介して自己集合して平面6を形成する際に形成される。その後、6つの分子が、最大200〜300μmの強いパイスタッキング相互作用7を介して平面に積み重ねられます。JBNTsは、FNがコラーゲン繊維と反応するように形態学的にコラーゲン繊維を模倣するように設計されています。

FNは、高分子量粘着糖タンパク質であり、これは細胞外マトリックス(ECM)9に見られる。これらは、ECMの他の成分、特にコラーゲン10への幹細胞の付着を媒介することができる。我々は、FNが非共有結合を介して数秒でNMを形成するためにそれらに反応できるように、形態学的にコラーゲン繊維を模倣するようにJBNTを設計しました。したがって、NMは、従来製造された足場ではアクセスできなかった骨折部位に注入される有望なバイオ足場である。ここで、注射可能なNMは、生体外でhMSCのアンカレッジを増強する優れた能力を提示し、組織再生のための足場として役立つ可能性を発揮する。

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プロトコル

1. JBNTの合成

注:JBNTモノマーは、以前に公開された11として準備されました。

  1. 化合物A1の合成
    1. 2-シアノー酢酸8.50g、エチルカルバミン酸9.80gを25mLのトルエンと2.5mLのN、N-ジメチルホルムアミドで調製する。4.90 mLの塩化ホスホリルを滴下する。その後、混合物を70°Cに加熱し、1.5時間攪拌し続けます。
    2. 反応混合物を室温まで冷却し、100gの氷水を注ぎます。酢酸エチル(3 x 250 mL)で水層を抽出し、100 mLのブラインで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発性物質を濾過し、蒸発させて淡黄色の固体を得る。
    3. 黄色の固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(3%メタノール/ジクロロメタン)に供し、白色粉末として化合物A1の15.61gを得た。
  2. 化合物A2の合成
    1. 化合物A1の3.12gと2.75gの炭酸カリウムを50mLのN、N-ジメチルホルムアミドに混ぜます。室温で2時間かき混ぜます。
    2. 2.6 mLの炭素二硫化物を反応懸濁液に加えます。4時間かき混ぜ続けます。
    3. 0°Cの反応混合物に絶対エタノールを加える。 黄色の沈殿物をろ過し、ジエチルエーテルで洗います。真空下で一晩乾燥し、淡黄色の固体として化合物A2の6.18gを得る。
  3. 化合物A3の合成
    1. 15 mLのアセトニトリルにヨウ化メチル2.7 mLを加えます。また、6.18gのA2を80mLの水/アセトニトリル(7:3比)を加えて化合物A2の溶液を別途調製する。両方の溶液を混合し、室温で30分間攪拌します。
    2. 反応混合物を95°Cに加熱し、3時間撹拌し続けます。
    3. 反応混合物を室温まで冷却し、次に真空下で揮発液を蒸発させます。
    4. 残渣3xを酢酸エチル100mLで抽出し、ブラインで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発物を濾過し、蒸発させて黄色の固体を得る。
    5. 黄色の固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(30%酢酸エチル/ヘキサン)に供し、化合物A3の4.52gをライトイエロー固体として得る。
  4. 化合物A4の合成
    1. 20 mLのエタノールに925 μLのアライラミンを加えて、アライラミン溶液を調製します。この溶液を化合物A3の溶液に滴下して添加し、30min以上の無水エタノールの75mLに3.14gのA3を加えて調製した。その後、反応混合物を16時間加熱還流する。
    2. 反応混合物を室温まで冷却し、揮発性物質を蒸発させて黄色の固体を与えます。
    3. 黄色の固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(50%酢酸エチル/ヘキサン〜2%メタノール/ジクロロメタン)に供し、白色結晶として化合物A4の1.80gを得た。
  5. 化合物A5の合成
    1. 14 mLの絶対エタノールに2.05gの塩酸グアニジニウムと7.8mLのナトリウムエトキシド(エタノール中21重量%)を加える。混合物を45°Cに加熱し、15分間加熱します。
    2. 不溶性物質を濾取し、40 mL絶対エタノールに2.70gのA4を加えて調製した化合物A4の溶液に直接濾液を加える。反応混合物を16時間加熱還流する。
    3. 沈殿をろ過し、オフホワイト固体として化合物A5の2.65gを得る。
  6. 化合物A6の合成
    1. 24.9 mLのトリエチルアミンを、1分以上のテトラヒドロフランの120 mLに化合物A5の2.11gと4-ジメチルアミノピリジン1.10 gを加えたスラリー混合物にゆっくりと加える。室温で2分間かき混ぜます。
    2. 20.7 mLのジテルブチルジカーボネートを反応混合物に滴下し、室温で40時間撹拌し続けます。
    3. 20mLの水を加える。真空下で揮発性を蒸発させる。
    4. 500mLの酢酸エチルで赤粘性残基を抽出する。その後、250mLの水、10%のクエン酸75mL、200mLの水で2倍、飽和炭酸ナトリウム200mL、ブライン200mLで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、フィルターをかけ、真空下で揮発を蒸発させて、赤/オレンジの固体を与えます。
    5. 固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(0-20%酢酸エチル/ヘキサン)に供し、白い泡として化合物A6の3.87gを得た。
  7. 化合物A7の合成
    1. 化合物A6(2.93g)の溶液にN-メチルモルフォリンN酸化物(水中50重量%、1.64mL)を加え、室温で5分間攪拌します。
    2. 3分間にわたって混合物に4%水溶液のオスミウム(4%水溶液)を加え、室温で24時間撹拌し続けます。
    3. 溶液が無色になるまで1.0M水性亜硫酸ナトリウムで反応を焼き付けます。真空下で揮発性物質を取り除き、水中に白いスラリーを生じさせます。350mLのジクロロメタンで残留物を抽出し、150mLの水で洗浄し、150mLのブラインで洗浄します。
    4. 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で揮発性物質を濾過し、蒸発させて、白色固体として化合物A7の2.45gを得る。
  8. 化合物A8の合成
    1. ニクロロメタン/水(6:1、35mL)の化合物A7の1.36gの混合物に760gの歯ごめきナトリウムを加え、室温で42時間攪拌します。
    2. 不溶性物質をろ過し、真空下で濾液を濃縮します。得られた残渣を250mLのジクロロメタンで抽出し、100mLの水と100mLのブラインで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発物をろ過し、蒸発させて粗生成物を与えます。
    3. 粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(5-40%酢酸エチル/ヘキサン、5%メタノール/ジクロロメタン)に供し、化合物A8の1.08gを得る。
  9. 化合物A9の合成
    1. 1,2-ジクロロエタンの15 mLに830mgの化合物A8の溶液を調製する。6-ベンジルオキシカルボニルアミノミノ-2-L-アミノ-ヘキサノ酸トリメチルシリルエチルエステル(649.5 mg)とN,N-ジイソプロピレチルアミン(591 μL)の混合物に滴下の溶液を1,2-ジクロロエタンの24 mLで加え、15分間室温で攪拌します。
    2. 360.3 mgのトリアセトキシ水素化ナトリウムを溶液に加え、室温で24時間撹拌し続けます。
    3. 反応混合物を6mLの水で焼き付けます。200mLのジクロロメタンで反応混合物3倍を抽出し、水に200mLのクエン酸を200mL、200mLの水で2倍、飽和炭酸ナトリウム200mL、そして200mLのブラインをその順に洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発物をろ過し、蒸発させて粗生成物を得る。
    4. 粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(5-30%酢酸エチル/ヘキサン)に供し、885mg化合物A9を生成する。
  10. JBNTモノマーの合成
    1. 化合物A9(0.54g)の0.54gを94%トリフルオロ酢酸/チオアニソール溶液の10 mLに溶解し、室温で72時間攪拌します。
    2. 反応混合物にジエチルエーテル(80 mL)を加え、遠心分離機を沈殿に加えます。上清を含む透明なトリフルオロ酢酸を注ぎ出し、ジエチルエーテルとメタノールで白色沈殿物を洗浄し、168.6 mgの粗JBNTモノマーを得る(補足ファイル1)。
    3. 逆相カラムを用いて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により粗JBNTモノマーを精製します。分離プログラムは以下にリストされています: 溶媒A:100%水;溶媒B:100%アセトニトリル;溶媒C:pH=1 HCl水溶液;流量:3 mL/分( 表1を参照)。
    4. 約7.2分で最大のピークを収集します。

2. JBNT/FNの製造

  1. 80 μLの1 mg/mL JBNT水溶液を40 μLの1 mg/mL FN水溶液とピペットに数回加えます。
  2. 約10sのピペット処理後の白色固体懸濁液の有無を確認してください。
    メモ:NM(補足ファイル2)の自己組み立てプロセスをキャプチャするためのビデオが撮影されました。

3. 凍結乾燥した標本の観察

注: このステップは JBNT および FN から作られた NM の足場構造を示すために実行されます。

  1. 凍結乾燥材料観察のためにFN、JBNTおよびFN/JBNT NMの解決を準備しなさい。100 μg/mL の FN を 40 μL の蒸留水で希釈し、FN の 20 μg/mL 溶液を作ります。
  2. 1 mg/mL の JBNT の溶液を 1 mg/mL の 5 μL の DI 水 45 μL に希釈して調製します。
  3. 100 μg/mL FN の 10 μL と 1 mg/mL の JBNT の 5 μL を 35 μL の DI 水に混ぜて NM 溶液を形成します。
  4. FN、JBNT溶液、NM溶液をそれぞれ備えた96ウェルクリアラウンドボトムマイクロプレートの3つのウェルをコーティングします。各ウェルは、50 μLの溶液を受け取ります。
  5. 凍結乾燥を行い、後述するように、NMの足場構造を可視化する。
    1. プレートを-80°Cで一晩凍らせます。
    2. 凍結乾燥した器具と真空ポンプをオンにします。
    3. クールダウンボタンを押して、システムの温度を-50°Cに下げます。
    4. 凍結したプレートを凍結した器具に入れ、器具の開口部をすべて閉じます。
    5. 開始ボタンをクリックして、システムの圧力を 0.9 mbar に減らします。
    6. 4時間後、 気管内 ボタンを押してバルブを開き、大気圧に対するシステム圧力を高めます。
    7. 凍結乾燥した器具からプレートを取り出します。
    8. 顕微鏡を使用して、FN、JBNTおよび得られた自己組み立てNMを観察する。材料のためのカメラでいくつかの写真を撮ります。

4. 吸収スペクトル測定

メモ: FN および JBNT のスペクトルの変更を使用して、自己組み立て型 JBNT/FN NM12を提示します。

  1. 30 μL の 100 μg/mL FN と 15 μL の蒸留水と 5 μL の 1 mg/mL JBNT を混合して、JBNT/FN NM 溶液を調製します。白色固体懸濁液は、溶液を数回ピペットした後に見ることができる。
    注:溶液中のJBNTとFNの最終濃度はそれぞれ100 μg/mLおよび60 μg/mLです。NM溶液に使用されたものと同じ濃度のJBNTおよびFN溶液も、制御溶液として調製した。
  2. JBNTコントロール溶液を調製するために、45μLの蒸留水でJBNTの1mg/mLの5μLを希釈します。
  3. 30 μLの100 μg/mL FNを20 μLの蒸留水で希釈し、FN制御溶液を調製します。
  4. 分光光度計( 材料表を参照)を用いて、FN、JBNT、JBNT/FN NM溶液のUV-Vis吸収スペクトルを測定し、NMの組立を特徴付けます。
    1. [UV-Vis]ボタンをクリックします。分光光度計の試験面を洗浄し、2μLの蒸留水を滴下します。190-850 nm からブランクとして測定します。
    2. 分光光度計の試験面を洗浄し、その上にFN溶液の2μLを落とします。190 nm から 850 nm までの FN 溶液の UV-Vis 吸収スペクトルを測定します。
    3. 分光光度計の試験面を洗浄し、JBNT溶液の2μLを落とします。JBNT溶液の吸収スペクトルを190 nmから850 nmまで測定します。
    4. 分光光度計の試験面を洗浄し、JBNT/FN NM溶液の2μLを落とします。JBNT/FN NM溶液の吸収スペクトルを190 nmから850 nmまで測定します。

5. 透過電子顕微鏡(TEM)用JBNT/FN NMの調製

  1. 基本的なプラズマクリーナーで負の染色の前にいくつかのグリッドを洗浄します( 材料表を参照)。
  2. 2つの異なるプロセスに従って標本の陰性染色を行う。
    1. JBNTs水溶液の3mg/mLの3μLを、JBNT/FN NM溶液を3μLの分離されたグリッドに落とし、2分間放置します。その後、0.5%のウラニル酢酸(UA)溶液の100 μLで各グリッドをすすいでください。余分な溶液を濾紙で排出し、空気乾燥グリッド。
    2. JBNT/FN NM溶液の9 μLを3 μLの2.0%UA溶液と混合し、ピペットを数回混合します。グリッド上の混合溶液をピペットし、2分間グリッド上に保管します。フィルターペーパーを使用して、混合溶液をグリッドから取り除き、常温でグリッドを乾燥させます。
  3. 最後に、ステップ5.2.1で染色されたJBNT/FN NM、およびTEMでステップ5.2.2で染色されたJBNT/FN NMの試料を特徴付ける。

6. インビトロ生物学的機能アッセイ

  1. 200 μL の陰性制御(NC、PBS)、JBNT、FN、および JBNT/FN NM ソリューションを、それぞれ 8 ウェルチャンバー スライドの 1 つのウェルに追加します。
  2. 凍結乾燥した8ウェルチャンバーカバーグラスを凍結乾燥させ、ウェルの底に材料をコーティングします。凍結乾燥のプロトコルは、ステップ 3.5 と同じです。
  3. その後、ウェル10,000個(パッセージ3)をウェルに加え、5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。
  4. インキュベーション後、培養液をウェルからピペットアウトし、1xPBS溶液で培養液をリンスする。
  5. 細胞を持つウェルに100 μLの固定液を加え、5分間放置します。細胞を1倍PBSで穏やかにリンスします。
  6. 1%トリトン-X 100〜0.1%を希釈。0.1%トリトンX 100の100 μLを細胞と共に各ウェルに加え、10分間放置します。細胞を1倍PBSで穏やかにリンスします。
  7. ローダミンファロイジンを1.65μMに希釈し、ローダミンファロイジン100μLを細胞と共に各ウェルに加え、室温で光から30分間保つチャンバーカバーグラスをインキュベートします。細胞を1倍PBSで穏やかにリンスします。
  8. 蛍光顕微鏡で細胞画像をキャプチャします。
  9. 各グループの蛍光画像のセル数をカウントします。各ウェルの3つのランダムな領域を平均化することによって、細胞の接着密度を計算します。
  10. すべてのデータを平均±標準偏差(SD)として表示します。片裾t検定を使用して統計分析を実行し、続いてp<0.05を伴う分散分析(ANOVA)を実行します。

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結果

我々の研究は、JBNTsとFNのNMの形成が速く、10秒で起こったことを発見した。 図2に示すように、JBNT溶液をFN溶液と混合し、数回配管した際に白い凝集が得られた。NMの形成プロセスは完全にバイオミメティックである。外部刺激は必要ありません。製造のプロセスは、13を架橋するための紫外線または化学開始剤に基づいているいくつかの新興バイオマテリアルのそれよりもはるかに簡単です。

FN、JBNT、NMのカメラ画像を撮影・解析しました(図3)。FN群については、短い白色の斑点を除いて、長繊維は認められなかった。短いクラスターはFNからなるタンパク質凝集であり、これはJBNTなしでは足場構造がFN単独では形成できないことを示している(図3A)。図3Bに示すように、長い繊維と細い繊維はJBNTsの存在を示...

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ディスカッション

本研究では、DNAに触発されたJBNTおよびFNで形成された自己組み立てバイオミメティックNMを開発した。JBNT溶液を調製する際には、JBNT凍結乾燥粉末は、PBSの代わりに水に溶解する必要があります。また、PBSの塩はNM繊維に束ね、画像の解像度を大幅に低下させることができるので、NMのナノフィブリル構造を観察したい場合は、NMも水中に組み立てる必要があります。

NMは、hMSCの接着と分化を促進するために使用された組織再生足場を作製するために多くの努力がなされているが、新しい組織工学足場として役立つ大きな可能性を示している。しかし、これらの材料のほとんどは、3Dプリント足場18、19などの特定の形状で事前に作られています。したがって、関節の奥深くにある負傷した部位に移植することは容易ではありません。しかし、ここでのNM溶液は液体として注入され、次いで細胞接着のための足場として役立つことができる。

1つの制...

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開示事項

ユペン・チェン博士は、NanoDeセラピューティクス社の共同創設者です。

謝辞

この作業は、NIH(グランツ1R01AR072027-01、1R03AR069383-01)、NSFキャリアアワード(1653702)、コネチカット大学によって財政的にサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジクロロエタンアルファ Aesar39121
2-シアノ酢酸Sigma-AldrichC88505
4-ジメチルアミノピリジンTCI アメリカD1450
8 ウェル チャンバー カバーグラスサーモフィッシャー155409
96 ウェル プレートコーニング353072
無水エタノールサーモフィッシャーBP2818500
アセトンSigma-Aldrich179124
アセトニトリルSigma-Aldrich34851
アリルアミンSigma-Aldrich145831
ベーシック プラズマクリーナーハリック プラズマPDC32G
クエン酸Sigma-Aldrich251275
濃縮塩酸Sigma-AldrichH1758
脱イオン水サーモフィッシャー15230147
ジクロロメタンSigma-Aldrich270997
ジエチルエーテルSigma-Aldrich296082
ジ-tert-ブチルジカーボネートSigma-Aldrich361941
エチルアセテートSigma-Aldrich319902
エチルカルバメートSigma-AldrichU2500
フィブロネクチンサーモフィッシャーPHE0023
固定液 (PBS で調製した 4 % ホルムアルデヒド)サーモフィッシャーR37814
グアニジン塩酸塩Alfa AesarA13543
ヘキサンSigma-Aldrich227064
ヒト間葉系幹細胞ロンザPT-2501
メタノールSigma-Aldrich34860
ヨウ化メチルSigma-Aldrich289566
N,N-ジイソプロピルエチルアミンAlfa AesarA17114
N,N-ジメチルホルムアミドSigma-Aldrich227056
N-メチルモルホリン N-オキシドAlfa AesarA19802
四酸化オスミウムアルファ Aesar45385
ペニシリン - ストレプトマイシンサーモフィッシャー15140163
リン酸緩衝液サーモフィッシャー20012050
塩化ホスホリルSigma-Aldrich201170
炭酸カリウムSigma-Aldrich347825
逆相カラムサーモフィッシャー25305-154630
ローダミン ファロイディンサーモフィッシャーR415
シリカゲルTCI アメリカS0821
重炭酸ナトリウムシグマ・アルドリッチS6014
エトキシドナトリウムアルファ・エーザーL13083
パラダイドシグマ・アルドリッチ71859
硫酸ナトリウムSigma-Aldrich239313
亜硫酸ナトリウムSigma-AldrichS0505
三アセトキシ水素化ホウ素ナトリウムAlfa AesarB22060
分光光度計(NanoDrop One/Onec UV-Vis)サーモフィッシャーND-ONE-W
幹細胞増殖培地 BulletKitロンザPT-3001
テトラヒドロフランシグマ・アルドリッチ401757
チオアニソールシグマ・アルドリッチT28002
トルエンシグマ・アルドリッチ179418
トリエチルアミンアルファ・エーザーA12646
トリフルオロ酢酸アルファ・エーザーA12198
トリトン X-100サーモフィッシャーHFH10
トリプシン-EDTA溶液Thermo Fisher25200056
ソジウム・ ナトリウム

参考文献

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