単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

サマリー

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。

要約

自然免疫系は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症を含む眼部病態生理学において重要な役割を果たしている。自然免疫細胞、特に単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現し、これらの集団を同定することが課題となる。マルチパラメータフローサイトメトリーは、マウス目の単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞を区別するために、複数の細胞表面マーカーの同時定量分析を可能にします。このプロトコルは、マウスの目全体の核分裂、眼圧解剖、単一細胞懸濁液への消化、および骨髄細胞マーカーに対する単一細胞懸濁液の染色について説明する。また、単色制御を用いて電圧を決定する方法や、蛍光から1つの制御を使用して正のゲートを引いた正のゲートを引いたものを解法するための適切な方法を説明します。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な制限は、組織アーキテクチャの欠如です。この制限は、個々の眼区画のマルチパラメータフローサイトメトリーまたは無料の免疫蛍光染色によって克服することができる。しかし、免疫蛍光は、定量分析の欠如とほとんどの顕微鏡の蛍光体の数の減少によって制限されます。レーザー誘導脈絡膜新血管化における単核食細胞の定量的分析を提供するマルチパラメトリックフローサイトメトリーの使用について述べた。さらに、マルチパラメータフローサイトメトリーは、マクロファージサブセットの同定、運命マッピング、およびトランスクリプトームまたはプロテオミクス研究のための細胞分類に使用することができる。

概要

自然免疫系には、補体の活性化および炎症を刺激する複数の細胞タイプが含まれる。自然免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球、および単核食細胞が含まれる。単球、マクロファージ、樹状細胞からなる単核食細胞は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)1を含む複数の眼科病態の病態生理に関与している。このプロトコルでは、新血管^AMD2のマウスモデルにおける多パラメータフローサイトメトリック解析を用いた単核食細胞の同定に焦点を当てる。このプロトコルは、糖尿病性網膜症および/またはuveitisのマウスモデルに適応可能であるが、これらの疾患の全身的な性質のために、より広範な眼解剖が推奨される。

単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現する。長期にわたる組織居住マクロファージおよびミクログリアは、黄身嚢由来のエリスロメロイド前駆体³に由来し、一方、マクロファージおよび樹状細胞を骨髄由来のマクロファージ樹状細胞前駆細胞⁴から分化した。単球に共通するマウス細胞表面マーカーは、マクロファージ、および樹状細胞、CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr1^7、および細胞内マーカーIba1 8を含^む。この課題を克服するために、複数の組織からマクロファージ、単球、および樹状細胞のトランスクリプトーム解析は、CD64をマクロファージ特異的細胞表面マーカー⁶と定義する。マクロファージは、虹彩、脈絡膜、毛様体、及び健康眼における視神経³に記載されている。あるいは、樹状細胞の識別がより困難である。樹状細胞同定の最も具体的な方法は、Zbtb46-GFPレポーターマウス⁹を使用して運命マッピングを必要とします。このレポーターラインとは無関係に、CD64の存在と併せてCD11cおよびMHCIIの発現は、潜在的な樹状細胞^6,10を同定することができる。樹状細胞は正常眼¹¹において角膜、結膜、虹彩、および脈絡膜で同定されている。ミクログリアは、そのレチナに位置する特殊なマクロファージであり、血液-腎障害によって保護され、黄身嚢前駆細胞¹²に由来する。その結果、レチナルミクログリアは、CD45発現¹³のそれらの薄暗いレベルと高レベルのTmem119によって単球由来マクロファージと区別することができ、これはフローサイトメトリー抗体¹⁴として利用可能である。しかし、ミクログリアの活性化時には、CD45はアップレギュレーション15、Tmem119はダウンレギュレート3となり、ミクログリア生物学の複雑さを示し、AMDとそのマウスモデルの両方に関連する可能性があります。最後に、単球は、古典と非古典的を含む少なくとも2つのサブタイプに分けることができます。古典的な単球ディスプレイCCR2^{+Ly6C高CX3CR1低}発現、および非古典的単球はCCR2-Ly6C^{低CX3CR1ハイ}マーカー⁵を実証する。

マーカー発現の定量的分析、すなわち、高いレベルと低/薄暗いレベルの必要性により、多パラメータフローサイトメトリーは、眼および他の組織における単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞間の識別に理想的な方法である。その他の利点としては、サブ集団の同定、蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、転写またはプロテオミクス解析のために細胞集団を分類する能力、および運命マッピングが含まれる。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な欠点は、組織アーキテクチャの欠如です。これは、角膜、結膜、虹彩、レンズ、失膜、および脈絡膜-スクレラ複合体:様々な眼部区画への眼圧解剖によって克服することができる。さらに、確認免疫蛍光イメージングを行うことができますが、マーカーの数と堅牢な定量の欠如によって制限されます。

ゲノムワイド関連研究は、複数の補体遺伝子をAMD¹⁶と結合している。補体活性化はアナフィラトキシン産生、白血球のリクルート、および結果として生じる炎症をもたらす。補体受容体欠損マウスにおいて、レーザー傷害は、単核食細胞の動員およびレーザー誘導脈絡膜新血管化(CNV)領域¹⁷を減少させる。同様に、C-Cモチーフケモカイン受容体2(CCR2)ノックアウトマウスは、組織への単球募集に欠損しており、単核食細胞のリクルートとレーザー誘導CNV領域¹⁸の両方を示す。これらのデータは、実験的CNVおよびおそらく新血管AMDを有する単核食細胞を補完する。この関連を支持して、補体受容体は、新血管AMD^19,20の患者において末梢血単球に対して調節不全である。これらのデータは、AMDと単核食細胞との間の強い関連を示す。

本稿では、実験レーザー誘導CNVモデルを用いて、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いてマウスアイ中の単核食細胞集団を特徴付ける。レーザー誘導CNVは、新血管AMDの標準的なマウスモデルであり、現在の第1線新幹線AMD療法²¹の有効性を実証した。このプロトコルは、マウスの目の核形成、眼解剖、単一細胞懸濁液への消化、抗体染色、単色制御を用いたレーザー電圧の決定、および蛍光マイナス1(FMO)制御を用いた測定戦略について説明する。レーザー誘発CNVモデルの詳細な説明については、前の出版物²²を参照してください。このプロトコルを用いて、ミクログリア、単球、樹状細胞、マクロファージ集団を定義する。さらに、MHCIIとCD11cを用いて、レーザー誘導CNVモデル内のマクロファージサブセットをさらに定義します。

プロトコル

すべての手続きは、ノースウェスタン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6マウスは、ノースウェスタン大学比較医学センター(イリノイ州シカゴ)のバリア施設に収容された。すべての動物は、食料と水への無料アクセスで12/12時間の明暗サイクルに収容されました。

1. 眼組織の採取

1. マウスが反応せず、もはや吸入しなくなるまで、二酸化炭素の調節された投与を使用して、いずれかの性別の10-12週齢のC57BL/ 6Jマウスを犠牲にする。頸部脱臼または他の承認された二次的方法を行い、安楽死を確実にする。
   注:経心筋灌流は、眼組織にない循環性白血球を除去するために行うことができる。この実験では、全身灌流は、ミクログリア、単球、マクロファージ、またはレーザー処理された全眼で検出された樹状細胞の数を減らさない。したがって、これらの細胞タイプの大部分は眼組織に位置しており、このステップは任意である。
2. 目を引き起動させるには、ソケットの外に出ると、湾曲した鉗子を目の下にそっと置きながら、目のソケットの近くを押し下げます。実際の目を絞らずに目の下に閉じたピンチ鉗子。周囲の結膜から眼を取り除く(事前の出版物を参照してください)²³.
3. 視神経が目を切り離す唯一の残りの接続になるまで、横に目を引きます。視神経はしばしば緊張で切断するが、視神経を切るために小さいはさみが必要な場合もある。1.7 mLマイクロ遠心分離チューブにカルシウムとマグネシウムを入れたコールド1xハンクの緩衝生理液(HBSS)に目を入れます。

2. 眼組織の消化

1. 0.1 mg/mL消化酵素と0.2 mg/mL DNaseを含む消化バッファーを冷たいHBSSで調製します。最初は滅菌水の2 mLで5mgの消化酵素を再構成する。HBSSで10mg/mL DNaseの初期希釈を準備します。消化バッファーの10 mL(3匹分の十分)ごとに、9.4mLの冷たいHBSSを0.4 mLの再構成消化酵素と希釈DNase Iを混ぜます。
   注:これらの濃度は、細胞死を減らしながら、単一細胞の抗体染色の最適なレベルを提供するために、複数の実験で経験的に決定されました。コラゲナーゼDは、細胞生存率を低下させ、CD45+細胞を減少させた消化酵素の代替として試みた。消化を最適化するための反復プロセスの詳細については、議論を参照してください。
2. 全拡大率10倍の解剖顕微鏡の下で、冷たいHBSSで微細な鉗子とスプリングハサミを使用して残りの結膜と視神経を取り除きます。
3. きれいな目を乾燥した解剖皿または小さな重量を量るボートに移しなさい。視覚軸を通して目に2つの穿ファリング創傷が作られ、消化バッファー出口のためのこの最初の創傷から90°離れた後、30 G針を取り付けた注射器を介して0.15-0.20 mL/目の消化バッファーを眼窩腔に注入します。
4. 0.5 mm x 0.5 mm 未満のすべての部分を持つスプリングハサミと細かい鉗子を使用して目全体をミンチ。後のステップでピペットの先端を詰まらせないように鉗子を介して鈍い機械的破壊とレンズティッシュを解体する。各サンプルに対して、0.75 mLの消化バッファーを小皿に洗い換えます。サンプルごとに新しい料理を使用します。
5. ピペット移動で材料を失わないように注意してP1000ピペットを使用して氷上の解離チューブに皿の内容物を移します。さらに1.5 mLの消化バッファーで皿をリンスし、解離管の総容積を3.25〜3.50 mLにします。
6. 解離管を電子解離器に反転させ、サイクル「m_brain_03_01」を実行し、200rpmで1minの単方向回転を室温で構成し、プリロードプログラムです。すべての組織が消化バッファーとこれおよびすべての残りのステップのためのローターと接触している解離管の底にあることを確認してください。
7. 37°Cで200rpmで30分間揺れるインキュベーターに解離管を置きます。
8. ステップ 2.6 と 2.7 を 1 回繰り返します。2回目の30分インキュベーションに続いて、ステップ2.6のように電子解離器を使用して1つの最終的な機械的消化を行う。
9. 10 mLのコールドフローバッファーを加えて反応を停止し、チューブを氷の上に置きます。

3. 細胞懸濁液の調製

1. 単一細胞懸濁液を作成するには、50 mL円錐形遠心分離管の上部に配置された40 μmフィルターを介して停止した眼の消化反応を注ぎます。2.5 mLの注射器からプランジャーを使用して、残りの未消化眼組織をフィルターに押し込みます。
2. 同じプランジャーを使用して再び未消化の眼組織片をフィルターに通す前に、フローバッファーとリンスフィルターの10 mLで解離チューブを洗浄します。
3. 5 mL のフローバッファを使用して、ステップ 3.2 を繰り返します。
4. 解離管を洗浄し、フローバッファーの最後の 10 mL でフィルターします。
   注:消化およびフローバッファの総量は、各サンプルで約38〜40 mLです。
5. 円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。
6. 滅菌水に10倍溶解溶液を加えて1x溶解液を調製します。別のチューブにチューブをフリックしてペレットを分割します。赤血球を溶解するには、室温(RT)で渦巻く30 sの1x溶解溶液の1mLを加える。
7. 20 mLのフローバッファで反応を停止します。
8. 円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。
9. 別のチューブにチューブをフリックしてペレットを解化します。チューブあたり5 mLのコールド1x HBSSを追加します。
10. 遠心管 400xg で4°Cで10分間。吸気上清。

4. 単核食細胞の細胞懸濁液の染色

1. 冷たいHBSSでライブ/デッド染料1:500を希釈することにより、サンプルごとに0.5 mLのライブ/デッド染色を準備してください。
2. P1000ピペットを使用して各サンプルにライブ/デッド染色を加え、ペレットを完全に解約してください。サンプルを1.2 mLマイクロ価器チューブに移します。
3. 小さなアリコート(10 μL)を取り、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンター(4.4参照)を使用して細胞を数えます。暗闇の中で室温で15分間、ライブ/デッド染色でサンプルをインキュベートします。
4. Trypan ブルーを使用してセル数をカウントし、サンプルあたりのライブ セル数を決定します。
   注:通常、10-12週齢のC57BL/6Jマウスの2つの目は、2 x 10^6個 の生細胞未満を含んでいます。
5. 400 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。
6. 500 μL のコールド フロー バッファで細胞を完全に再懸濁します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。
7. F_cブロックの50 μL(精製ラット抗マウスCD16/CD32のコールドフローバッファーでの1:50希釈)で最大5 x 10⁶の生細胞をブロックします。5 x 10^6個以上の細胞の場合は、ボリュームを適宜増やしてください。
8. サンプルを完全に解体するようにペレットにF_c ブロックを加えます。4°Cで20分間インキュベートします。
9. 50 μLの抗体染色溶液(溶液に含まれる各抗体の選択量については表1を参照)を、生細胞あたり5 x 106の細胞を直接_Fcブロック内の細胞に加え、完全に混合します。4°Cで30分間インキュベートします。
   注:抗体量はフローサイトメーターの構成に依存し、各ラボと機器に対して個別に滴定する必要があります。フィルターとミラーのインストゥルメント構成については、 表 2 を参照してください。抗体を評価するには、メーカーの推奨から始め、染色指数を計算します。様々な抗体濃度(メーカーの推奨値の上下)の試験実行を行い、染色指数が維持される抗体の最低濃度を選択します。また、単色コントロールよりも明るい正の染色を確認してください。負の染色されたセルがスケールで、1 x 10²未満のピークを持つことを確認するために、染色されていないセルを使用します。正に染色された細胞を定義するには、蛍光から 1 つのコントロールを引いたものを使用します。
10. 700 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。
11. 場合によっては、抗体染色後、フローバッファー内のパラホルムアルデヒドを500 μLの2%で固定できます。室温で15分間サンプルを固定します。次に、4.10に記載のとおり1回の洗浄を行う。4 °Cで固定サンプルを保管してください。カウントビードは、フローサイトメトリーデータ収集の日に追加する必要があります。固定サンプルは、1〜2日でフローサイトメーターで実行する必要があります。
    注意:パラホルムアルデヒドは腐食性および健康上の危険である。
12. 500 μL のコールド フロー バッファを使用して、サンプルを再度洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱すことなく上清の半分を吸引する。
13. ペレットを再懸濁し、96ウェルのUボトムアッセイプレートに移します。遠心板 400xg で5分4°Cで。上清をデカントするには、プレートをひっくり返し、1つの強いシェイクでペレットを乱すことなく、液体をシンク盆地に取り除きます。
14. 新しい1.2 mLマイクロ・トイターチューブに、50 μLのウェルボルテックス・カウントビーズを配置します。
15. 200 μL のコールド フロー バッファで 96 ウェル プレートにペレットを再懸濁します。前のステップからビーズの上に細胞混合物を追加します。250 μL/マイクロ力さチューブの総容積でフローサイトメーターで実行します。

5. フローサイトメトリーデータの収集

1. オンにして、フローサイトメーターを準備します。ここに記載されている指示は、修正された4つのレーザーサイトメーターのためのものです(表2)。
2. 各サンプルの小さなアリコートを含むテストサンプルを実行し、各検出器のすべてのセルがスケールであることを確認します。すべてのセルがスケールになるように電圧を調整します。
3. 染色カクテルに使用されるフルオロフォアごとに単一のカラーコントロール(SCC)を実行する(表3)。マイクロ力価チューブを大きな5 mLポリスチレンチューブに入れ、フローサイトメーターステージに配置します。
   注:BV421(パシフィックブルー)、FITC、PE、Alexa647(APC)、Alexa700などの根管内フルオロフォアは、カクテルと同じ抗体を必要としません(CD64 PEのCD19 PE)。しかし、PE-CF594、PE-Cy7、またはAPC-Cy7のようなタンデムフルオロフォアは、コンジュゲートフルオロフォアの解離の可能性があるため、カクテルと同じSCC抗体を必要とします。
   1. 1.2 mLのタイターチューブに2滴の補償ビーズを加え、ハムスターアンチマウスCD11c BV421を1μLと一緒に追加して、BV421用のSCCを作成します。補正ビーズは、CD11c BV421が5.3.3で説明したようにカッパではなくIgGラムダサブタイプであるため使用されます。4°Cで15分間インキュベートします。0.2 mL のフロー バッファを追加します。
   2. アミン反応性ビーズから正の染色ビーズ(グリーンキャップ)を1滴加え、その後1 μLのライブ/デッド染料を追加して、ライブ/デッド染料用のSCCを作成します。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。アミン反応性ビーズからマイナスビーズ(白キャップ)を1滴追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。
   3. 抗ラットおよび抗ハムスターIgカッパビーズセットから正の染色ビーズ(緑色のキャップ)を1滴加え、続いて1.2 mLの塊茎チューブに記載されている抗体量(表3)を加えて、残りのSCCを作成します。4°Cで15分間インキュベートします。アンチラットとアンチハムスターIgカッパビーズセットからマイナスビーズ(白キャップ)の1滴を追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。
   4. 渦は完全にすべてのビーズ混合物。SCCは4°Cで3日間保存します。
      注:蛍光レポーターマウスのSCCは、染色されていない細胞です。
   5. SCCを実行する場合、SCCサンプルが同じ検出器チャネル内の細胞のサンプルに対してどの蛍光よりも大きいピークを有するような電圧を設定する。さらに、任意のSCCが、対象チャネルのヒストグラムピークと他のチャンネルとの間に少なくとも0.5のログ差を持たるように電圧を設定する必要があります(図1)。
4. 「低」でサンプルを実行し、イベント/秒を4000以下に抑えます。流量を適切に下げることができない場合は、追加のコールドフローバッファでサンプルを希釈します。カウント計算に必要となるように、追加されたボリュームを記録します (代表結果を参照)。
5. サンプルごとに少なくとも 3 x 10⁶ のイベントを収集します。これは、あなたのサイトメーター上のイベントとしてカウントされる顔料顆粒や破片のために細胞数よりも高い可能性があります。
6. セクション6.4の適切な格言戦略のために、ライブ/デッド以外の蛍光性マイナス1(FMO)を記録します。FMOは、1つを除くすべてのフルオロフォアで染色されたサンプルです。
7. 製造元または施設の指示に従ってフローサイトメーターを清掃し、シャットダウンします。

6. フローサイトメトリーデータのアノテーション

1. 分析ソフトウェアを使用して新しいワークシートを開きます。すべてのサンプルと単色コントロールのサイトメーターからFCSファイルをインポートします。
2. SCC を使用して、報酬マトリックスを作成します。
3. 補正マトリックスを染色したサンプルと MMO に適用します。
4. FMOを使用して、ゲートを描画するための正の染色を決定します。

結果

図1 は、赤レーザーのSCCとセルの無補償周波数ヒストグラムを示しました:Alexa647、Alexa700、およびAPC-Cy7。 図1Aでは、マゼンタ線はAlexa647のSCCのピークを表し、シアンラインは意図された0.5ログの違いを示しました。Alexa700とAPC-Cy7のピークはシアンラインの左(明るさが低い)であることに注意してください。また、セルはすべてマゼンタラインの左側にあったことに注意してください。SCCピークの右側にあるいずれの細胞も補償されなかった。特定のチャネルは、フッ素色素の化学(すなわち.e.e.)の化学に基づいて他のチャネルに流出することが知られていた。 バイオレットレーザー: BV421 -> V500, 黄緑色レーザー: PE -> PE-CF594, 赤レーザー: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, クロスレーザー: PE-Cy7 -> APC-Cy7)。上記の条件のいずれかが満たされない場合、1つ...

ディスカッション

マルチパラメータフローサイトメトリーは、複雑な組織における複数の細胞タイプの定量分析を可能にします。本報告では、マウス眼でのレーザー損傷後の単球、樹状細胞、マクロファージサブセットを含む単核食細胞集団のフローサイトメトリック検出について述べた。Liyanageらは最近、好中球、好酸球、リンパ球、DC、マクロファージ、マクロファージ、および単球²⁷を検出するための同様の格子戦略を報告した。当社の格言戦略は、主にCD64の追加によって異なります。Liyanageらは、DCをCD4^-CD8^-B220^-CD11b + CD11c+細胞、マクロファージをCD4^-CD8^-B220^-CD11b⁺CD11c^-NK1.1 -Ly6G-細胞として識別する。 我々は、DCをCD4^-CD8^-B220^-...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.6 ml 微量遠心チューブ	Fisher Scientific	05-408-120
1.7 ml 微量遠心チューブ	Costar	3620
10 ml ピペット	Fisher Scientific	431031
15 ml 円錐	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500 ml	Gibco	14025-092
2.5 ml syringe	HenkeSass Wolf	7886-1
20% パラホルムアルデヒド溶液	電子顕微鏡 Sciences	15713-S
25 ml ピペット	フィッシャー サイエンティフィック	431032
30 G ニードル	エクセル	26437
3ml ルアー ロック シリンジ	フィッシャー サイエンティフィ	14955457
41 x 41 x 8 mm ポリスチレン 計量皿	フィッシャー サイエンティフィック	08-732-112
50 ml円錐	Falcon	352070
96ウェル、U底アッセイプレート、蓋なし	Falcon	353910
アミン反応性ビーズ	ThermoFisher	A10628
分析ソフトウェア	FlowJo	v 10
抗ラットおよび抗ハムスター Ig κビーズセット	BD Biosciences	552845
C57BL/6J マウス	Jackson Laboratory	664
Cell counter	Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides	Invitrogen	C10283
Compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42
Count beads	ThermoFisher	01-1234-42
湾曲鉗子	Fisher Scientific	16-100-123
消化酵素	Sigma Aldrich	5401020001
解剖顕微鏡	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T
解離チューブ	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
電子解離器	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva ソフトウェア	BD Biosciences
Fc ブロック、ラット抗マウス CD16/CD32	BD Biosciences 553142
ファイン鉗子	インテグラ ミルテックス	17035X
フローバッファー	ミルテニー バイオテック	130-091-221
フローサイトメーター	BD バイオサイエンス
フローチューブ	ファルコン	352008
ハムスター アンチマウス CD11c BV421	BD バイオサイエンス	562782
アイスバケツ	フィッシャーサイエンティフィック	07-210-123
生/死用色素	ThermoFisher	65-0866-14
溶解液、10倍溶液	BD Biosciences 555899
マイクロ力価チューブとラック	Fisher Scientific	02-681-380
マウス抗マウス CD64 PE	BioLegend	139304
マウス抗マウス NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
P1000ピペットチップ	デンビルサイエンティフィック	P2404
P1000ピペッター	ギルソンFA10006M
P2ピペットチップ	エッペンドルフ	22491806
P2ピペッター	ギルソン	FA10001M
P20ピペッター	ギルソン	FA10003M
P200ピペットチップ	デンビルサイエンティフィック	P2401
P200ピペッター	ギルソン	FA10005M
ピペットマン	フィッシャーサイエンティフィック	FB14955202
ラット抗マウス B220 PECF594	BDバイオサイエンス	562313
ラット抗マウスCD11b APC-Cy7	BDバイオサイエンス	557657
ラット抗マウスCD19 AlexaFluor 700	BDバイオサイエンス	557958
ラット抗マウスCD19 PE	BD Biosciences	553786
ラット抗マウス CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
ラット抗マウス CD45 FITC	ThermoFisher	11-0451-82
ラット抗マウス CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
ラット抗マウス CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
ラット抗マウス Ly6C	BD Biosciences
ラット抗マウス Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
ラット抗マウス MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
ラット抗マウス Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
ラット抗マウス Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
振盪インキュベーター	Labnet	311DS
スプリングハサミ	ファインサイエンスツール	15024-10
滅菌細胞ストレーナー、40 mm ナイロンメッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	22363547
滅菌水、500 ml	Gibco	A12873-01
スイングバケット遠心分離機	eppendorf	5910 R
トリパンブルー、0.4% 溶液	Gibco	15250061