シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

サマリー

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

要約

運動性は、多くの細菌種の生存と成功に不可欠です。運動性を利用して信号経路を理解し、フラネラ部の機能と組み立てを解明し、運動パターンを調べ、理解するために多くの方法論が存在する。ここでは、これらの方法の3つの組み合わせを示します。柔らかい寒天の運動性は最も古く、運動性障害のある株の機能利得抑制性突然変異を分離するための強力な選択を提供し、運動性は第2の突然変異によって回復する。細胞テザリング技術は、最初に、フラグラーモータの回転性を実証するために使用され、モータ速度および回転方向を切り替える能力に対するシグナルエフェクタの影響を評価するために使用することができる。「国境を越える」アッセイは、水泳細菌が群れとして集団的に移動する準備ができる、より最近のものです。これらのプロトコルは、運動機械の構成要素を特定し、水泳や群れの異なる側面におけるその役割を特徴付けるための体系的かつ強力なアプローチを表しています。それらは他の細菌種の運動性を研究するために容易に合わせることができる。

概要

細菌は、その生態学的ニッチに移動と分散のための多くの付属物を採用しています¹.これらの中で最も速いのが、環境信号に応答して好ましいロケールの植民地化を促進し、いくつかの種^2,3の病原性能力に大きく寄与する。バネラ菌は、バルク液体で個別に泳ぐか、半固体表面⁴の上に集団として群がることができます。細胞外のフラグラは膜に埋め込まれた回転モーターによって取り付けられて駆動され、イオン勾配の力を利用して回転1、2、4、5、6、7、8を引き起こすトルクを発生^させる。モーターが一定のトルク⁹で動く大腸菌では、モーター出力は回転速度と回転子の反時計回り(CCW)方向と時計回り(CW)方向の切り替えの観点から分類す....

プロトコル

1. 運動不足株におけるサプレッサー変異体の分離

注: この方法を広範な「キャッチオール」として使用して、運動性欠陥の一般的な性質を特定してください。

1. ソフト寒天プレートの準備
   注:軟寒天は、運動性または水泳寒天とも呼ばれ、低パーセンテージ寒天(〜0.2-0.35%w/v)であり、長い間気胸^31,32をアッセイするために使用される。
   1. 2 Lラウンドボトムフラスコにバクト寒天(0.3%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH_2O(二重蒸留水)を加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。
   2. 121 °Cで20分間オートクレーブ。
   3. 上記のようにロッド/プレートを使用して穏やかな攪拌で冷却することができます。温度が約50°Cに達したら、滅菌ペトリ皿(100mm x 15mm)に25mLを注ぎ、溶融寒天を16時間以内に蓋を少なくとも1時間所定の位置にセットします。
2. 培養製剤、接種、およびサプレッサー変異体の単離
   注:柔らかい寒天で固まった栄養豊富な培地の中心に接種された 大腸菌 は、栄養素を局所的に消....

結果

高レベルのシグナル伝達分子c-di-GMPによって運動性が損なわれる大腸菌株における擬似復帰物質の単離は、我々の研究室³⁴からの最近の研究で詳述された。この株(JP1442)は、ΔyhjHとΔycgRの2つの突然変異を抱えた。YhjHは、大腸菌のc-di-GMPを分解する最も活性なホスホジエステラーゼである。YhjHの不在は、上昇したc-di-GMPレベルと運動性の阻害につながります.YcgRはc-di-GMPエフェクターです。C-di-GMPとの複合体では、YcgRは最初にCCWモータ回転を誘導し、その後モータ速度を低下させるために、フラゲラローターに結合する。細胞テザリングおよびビーズアッセイは、二重変異体において運動行動が正常に戻ることを示したが、軟寒天では運動性は³⁴ではなかった。そこで、プロトコルのステップ1を展開して、二重変異体内の疑似復帰フレアを分離しました(図1C)。WGS(HiSeq 4000プ.......

ディスカッション

サプレッサー突然変異の分離と特徴付けは、気化システム^{35、36、37、}ならびにモータ機器自体^38、39、40の主要成分の同定に成功した。プロトコル1を使用している間、運動性の喪失を補うことができる突然変異の大きなスペクトルの分離を確実にするために、複数の独立した複製を含める必要があります。スポットではなくラインで培養物をストリークさせることにより菌の数を増やすことで、サプレッサ⁴¹を生成する確率を向上させることができる。同じ突然変異の単離(DNAシーケンシングによって決定される)を複数回、その真正性に対する信頼度を高めます。WGSは、常にゲノム内の他の突然変異の存在を明らかにする。したがって、同定された突然変異を元の運動.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagents
Bacto Dehydrate	Agar Fisher Scientific	DF0140-15-4
EDTA 二ナトリウム塩・二水和	Fisher Scientific	02-002-786
栄研寒天	栄研化学工業株式会社	E-MJ00	大腸菌群れに必須
グルコースD (+)	Fisher Scientific
LB (レノックス) ブロス	フィッシャー サイエンティフィ	BP1427-500
ポリ-L-リジン溶液 (0.1%)	シグマ-アルドリッチ	P8920
塩化カリウム (KCl)	フィッシャー サイエンティフィ	18-605-496
リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)	フィッシャー サイエンティフィ	BP362-500
リン酸二塩基性カリウム (K2HPO4)	フィッシャー・サイエンティフィ	BP363-500
塩化ナトリウム (NaCl)	フィッシャー・サイエンティフィック	S271-500
Materials and Equipment
CellSense 顕微鏡イメージングソフトウェア (V. 1.6)	オリンパス		または同等の顕微鏡用ソフトウェア
電子顕微鏡 Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape	Fisher	50-285-28
つや消し顕微鏡スライド 3x1x1mm	フィッシャー	12-550-343
オリンパス BX53 顕微鏡	オリンパス	BX53	直立または逆位相の顕微鏡は、
ペトリ皿 (直径 100 mm ) を使用できます フィ	ッシャー サイエンティフィ	FB0875712	軟寒天アッセイ用
ポリエチレン ネブライザー キャピラリー チューブ (0.58mm x 99mm 3.0m)	パーキン・エルマー
9908265 ラウンドペトリ皿、2コンパートメント付き	VWR	89200-944	国境を越えるアッセイ用
安全性 皮下注射針 (23G)	フィッシャーサイエンティフィ	14-826A
滅菌シリンジ - 1mL	フィッシャーサイエンティフィ	14-955-450
タスク/ティッシュワイプ	フィッシャーサイエンティフィ	06-666	または同等の使い捨てティッシュワイプ
VWRマイクロカバーガラス18x18mm	VWR	48366205
XM10カメラ	オリンパス	XM10	または同等の顕微鏡カメラ

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