虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

サマリー

この記事では、定量的なリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、急性腎障害マウスモデルの腎臓におけるマイクロRNA発現を検出するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、虚血性腎障害マウスモデルとマイクロRNAサンプルの慎重な抽出に重点を置いています。

要約

マイクロRNA(miRNA)は様々な疾患状態に関与しており、マウスの疾患の早期診断や治療に有効なバイオマーカーです。しかし、急性腎障害(AKI)マウスのmiRNAの精製および腎臓での発現検出のための標準的なプロトコルは十分に確立されていません。この研究では、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を使用して、腎虚血再灌流によって誘導されたAKIマウスモデルの腎臓のmiRNAを精製および定量するための効果的で簡単なプロトコルを開発しました。このプロトコルは、1)腎虚血再灌流によるAKIの誘導、2)腎臓の採取、3)腎臓からのmiRNAを含む全RNAの精製、4)miRNAの逆転写によるcDNA合成、および5)miRNA発現を検出するためのqRT-PCRの5つのステップで構成されています。このプロトコルを使用すると、腎虚血再灌流障害モデルを軽度から重度のAKIで生成できます。さらに、手順を適切に実行すれば、個人差の少ない一貫したAKIモデルを得ることができます。このqRT-PCRアッセイは、非常に広いダイナミックレンジを示し、成熟したmiRNAの識別を可能にし、高い特異性で正確に定量することができます。このプロトコルは、AKI腎臓におけるmiRNA発現プロファイルの研究に使用できます。

概要

腎臓の虚血再灌流障害(IRI)は、急性腎障害(AKI^{)発症の主要な}危険因子の1つです1。AKIは患者の予後において重要な役割を果たしていますが、特定の治療法や早期診断バイオマーカーは確立されていません。

マイクロRNA(miRNA)は、約18〜25塩基の短いノンコーディングRNAです。miRNAは体液中で安定しており、その配列は動物間で高度に保存されています²。MiRNAは、数千の標的を通じて複数のタンパク質の発現を調節し、それによって多様なシグナル伝達経路2,3,4,5,6,7,8に影響を与えます。近年、miRNAは様々な疾患状態に関与しており、様々な疾患の早期診断に有効なバイオマーカーであることが報告されています。

このプロトコルの全体的な目標は、IRIによって誘導されたAKIマウスモデルの腎臓におけるmiRNAの精製と検出を成功させることです。このIRIモデルは、AKIと腎線維症の広く使用されているモデルです。IRIモデルの利点には、虚血再灌流が達成されたかどうかを視覚的に確認し、AKI発症の正確な時間を特定できることが含まれます。ただし、クランプ期間が広範囲にわたる管状損傷を引き起こすのに十分な長さの場合、死亡率は高くなりますが、クランプ持続時間が短い場合は管状損傷を引き起こさないため、この実験モデルでは管状損傷の進行に大きなばらつきが生じます。両側クランプモデルと比較して、片側腎IRIモデルで採取された右腎摘出術組織はコントロールとして機能し、腎不全を保証します。

腎臓サンプルは、ガラスホモジナイザーを使用してマッシュされ、タンパク質と核酸が分離され、DNAとRNAが分離されます⁹。miRNAを含む全RNAは、シリカ膜ベースのスピンカラム⁹を使用して腎臓サンプルから精製されます。続いて、ポリ(A)ポリメラーゼおよびオリゴ-dTプライ^マー10を用いて、全RNAからcDNA合成(逆転写)を行う。最後に、miRNAの発現は、インターカレート色素¹⁰を用いたqRT−PCRによって決定される。qRT-PCRは、エンドポイントでの増幅量のPCRと比較して、より正確に遺伝子発現を定量できます。qRT-PCRは高濃度を測定し、ダイナミックレンジが広いため、サイクル数に応じた正確な定量が可能です。以前の研究では、単純なプロセスを使用して、組織内のmiRNAを効果的に精製および検出できることが報告されています^8,9,10。このプロトコルに記載されているcDNA合成(逆転写)の方法、およびインターカレーティング色素を用いたqRT−PCRによるmiRNA発現の検出は、高い精度と感度を示すことが報告されています¹⁰。

さらに、このプロトコールはシンプルで、ラボ間で一貫した結果が得られます。したがって、このプロトコールは、マウスAKI腎臓における高精度で高感度なmiRNA検出を必要とする研究に有用です。

プロトコル

すべての動物実験プロトコルは、自治医科大学の動物倫理委員会によって承認され、自治医科大学実験動物ガイドの実験動物の使用と手入れのガイドラインに従って実施されました。

1. IRIモデル

注:手順全体を通して、低体温症、腸の保湿、および麻酔の深さを注意深く監視します。

1. 次のアイテムを準備します:イソフルランに浸した綿の入った50mLの遠心分離チューブ、加熱された手術用パッド、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入ったペトリ皿、手術用ハサミ、および鉗子。PBSを37°Cに保ちます。
   注:このIRIモデルは、制御された温度、湿度、および12時間の明暗サイクルを備えた部屋に収容された雄のC57BL / 6マウス(9週間、20〜25 g)を使用して生成されました。
2. イソフルランを使用して動物に麻酔をかけます:誘導濃度3%〜5%、維持濃度2%〜3%、およびクランプ中の濃度1%〜1.5%。反射神経の喪失により麻酔の深さを確認します。吸入麻酔は、時間を調整できるという利点があります。腎臓の周囲の組織の剥離のために、この手順にはかなりの時間がかかる場合があります。しかし、吸入麻酔のデメリットは、体温が下がりやすいことです。手順全体を通して、不必要な麻酔を避けてください。
3. 麻酔をかけたマウスを背中の加熱された手術用パッドに取り付け、切開部の周囲の毛を取り除き、マウスの腹部皮膚に70%エタノールをスプレーします。
4. ハサミと鉗子を使用して、腹部の皮膚、筋肉、腹膜に正中線を切開します。
5. PBSで湿らせた綿棒を使用して、腸を腹腔外腔の左側に向かってそっと押し、右の腎臓と尿管を露出させます。施術時間が長いと、術後の腸の損傷を引き起こす可能性があります。したがって、視野が得られる場合は、腹腔から腸を除去せずに手術する方が良いです。腸の乾燥を避けてください。乾いた綿棒やガーゼは腸の損傷を引き起こす可能性があります。
6. 角度のある鉗子で右尿管を持ち上げます。4/0シルク編み縫合糸を使用して右尿管を2回結紮します。縫合糸の間を切断し、腎臓に近い縫合糸をより長く残します。
7. 残りの縫合糸を引っ張りすぎないように慎重に保持し、腎臓に沿って結合組織と脂肪を鈍く解剖します。後ろから手術を行うことで、肝臓の損傷のリスクを減らすことができます。
   1. 腎動脈と静脈以外の血管を特定し、右腎臓に血液を供給し、それを結紮またはクリップします。右腎臓が十分に剥離したら、4/0シルク編組縫合糸を使用して右腎動脈と静脈を結紮します。縫合する代わりに、止血クリップを使用してください。
   2. PBSで湿らせた綿棒を使って、腸を腹腔外右側に向かってそっと押して左腎臓を露出させた後、湿らせたドレープで腸を覆って乾燥を防ぎます。左腎臓の周りの結合組織と脂肪を解剖します。
8. 腎動脈と静脈以外の血管を特定し、左腎臓に血液を供給し、それを結紮またはクリップします。腎動脈と腎静脈をクランプして、左腎虚血を誘発します。止血クリップを腎臓から約1cm離して配置し、腎実質への損傷を防ぎます。虚血の成功は、腎臓の段階的な均一な黒ずみによって視覚的に確認できます。
9. 腸を腹腔に戻し、腸のねじれを避けるように注意します。腹部の皮膚を一時的に閉じてドレープし、しっとりとした環境を保ちます。吸入麻酔の濃度をできるだけ下げ、動物を暖かく保つようにしてください。クランプ時間は25〜45分です。クランプ時間が長くなると、より深刻な腎障害が誘発されますが、長期的な死亡率も増加します。病理結果を分析して調整します。
10. 虚血の期間が終了したら、クランプを取り外します。血流の再灌流と腎臓の色が改善されることを確認します。腹部の皮膚を閉じる前に、腸がねじれていないことを確認してください。腹部が2層に閉じられる前に、ボリュームサプリメントとしてPBSを腹腔内に注入します。4-0ナイロン縫合糸を使用して腹部の皮膚を閉じます。腎臓の除去期間が長い場合は、腹壁と腹膜を別々に閉じることにより、腸の癒着の可能性を減らすことができます。.
11. 術後感染のリスクを最小限に抑えるために、消毒剤(例:.、ヨウ素/アルコール溶液)を手術領域に適用します。.

2.腎臓サンプルの収集

注:このビデオのクランプ時間は45分で、24時間後に腎臓を採取します。

1. 5%イソフルランで動物に麻酔をかけ、反射神経の喪失によって麻酔の深さを確認します。
2. ハサミと鉗子を使用して、腹部の皮膚、筋肉、腹膜に正中線を切開します。27Gの針で穴を開けた下大静脈から血液を採取します。
3. 胸壁に正中線切開を行い、左心室に23Gの針を挿入します。逆流を確認します。肝臓を切開し、PBSを20mL注入します。血液が排出されると、肝臓の色が赤からピンクに変わり、十分な血液が排出されたことが確認されます。
4. 鉗子とはさみを使用して左腎臓を取り出し、ペトリ皿でPBSで洗います。腎臓を乾燥させないように注意しながら、鉗子を使用して腎筋膜を切除します。
5. 腎臓を半分に切り、半分を組織病理学に、残りの半分を次のステップに使用します。腎盂を避け、腎臓を30mg採取します。使用前に-80°Cで保存してください。

3. 腎臓サンプルからのmiRNAの精製

注:ここでは、30 mgの腎臓サンプルを、ガラスホモジナイザーとマイクロ遠心スピンカラム内の生体高分子シュレッダーシステムを使用してホモジナイズします。その後、腎臓サンプルからmiRNAをシリカ膜ベースのスピンカラムを使用して単離します。

1. 1.5 mLまたは2.0 mLの微量遠心チューブ、100%エタノール、クロロホルム、ガラスホモジナイザー、氷、微量遠心スピンカラム⁹の生体高分子シュレッダーシステム9、シリカ膜ベースのスピンカラム⁹、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、グアニジンとエタノールを含む洗浄バッファー(洗浄バッファー1)、エタノールを含む洗浄バッファー(洗浄バッファー2)を準備します。
2. 30 mgの腎臓サンプルをガラス製ホモジナイザーに入れ、700 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。この手順は、組織が熱によって変性するため、氷の上で実行します。
3. 乳棒をねじってサンプルにゆっくりと押し付けて、腎臓サンプルを均質化します。このプロセスを氷上で数十回繰り返し、腎臓サンプルがフェノール/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで繰り返します。その後の測定でmiRNAが得られない場合、これは溶解が不十分であることが原因である可能性があります。
4. さらに均質化するには、均質化したライセートを2.0 mLコレクションチューブにセットした微量遠心分離機スピンカラム内の生体高分子シュレッダーシステムに移します。これを14,000 × g で室温で3分間遠心分離します。
5. ホモジナイズしたライセートを新しい微量遠心チューブに移します。
6. ホモジナイズしたライセートに140 μLのクロロホルムを加え、チューブにしっかりとキャップをします。チューブを反転して15秒間混合します。
7. サンプルを室温で2〜3分間インキュベートします。次に、12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
8. 沈殿物を乱さずに上清(通常300μL)を新しい微量遠心チューブに移し、100%エタノールを1.5容量(通常は450μL)加えます。サンプルを5秒間ボルテックスして混合します。
9. 最大700 μLのサンプルを、2.0 mLのコレクションチューブに入れたシリカ膜ベースのスピンカラムにピペットで移します。カラムキャップを閉じ、15,000 × g で15秒間遠心分離します。遠心分離後、フロースルーをコレクションチューブに捨てます。
10. 700 μLの洗浄バッファー1をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、サンプルを十分に洗浄します。カラムのキャップを閉じ、15,000 × g で15秒間遠心分離します。遠心分離後、フロースルーをコレクションチューブに捨てます。
11. 500 μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、微量の塩分を除去します。カラムのキャップを閉じ、15,000 × g で15秒間遠心分離します。遠心分離後、フロースルーをコレクションチューブに捨てます。
    1. 手順3.11を繰り返します。
12. シリカ膜ベースのスピンカラムを再び15,000 × g で1分間遠心分離します。遠心分離後、フロースルーをコレクションチューブに捨てます。
13. シリカメンブレンベースのスピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れます。25 μL の RNase フリー水をカラムに移し、カラムキャップを閉じます。サンプルを室温で5分間放置した後、15,000 × g で1分間遠心分離します。
14. miRNAを含む25 μLの溶出液を新しい微量遠心チューブに移します。miRNAは溶解を繰り返すと分解されるため、サンプルを2本または3本のチューブに分注することをお勧めします。これらを-80°Cで保存してから使用してください。

4. miRNAの逆転写

注:ここでは、単離されたRNA1.0 μgを、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびオリゴ-dTプライマーを使用して逆転写します。

1. 次のアイテムを準備します:1.5mLの微量遠心チューブ。8ウェルストリップチューブ。RNaseフリー水;氷;デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド三リン酸、およびオリゴ-dTプライマーを含む10x核酸ミックス。ポリ(A)ポリメラーゼおよび逆転写酵素混合物;Mg²⁺、デオキシリボヌクレオチド、オリゴ-dTプライマー、およびランダムプライ^マー10を含む活性化バッファー。
2. 2.0 μL の 10x Nucleic Acid Mix、2.0 μL のポリ(A)ポリメラーゼおよび逆転写酵素ミックス、4.0 μL の 5x 活性化バッファー (Mg²⁺、デオキシリボヌクレオチド、オリゴ dT プライマー、ランダムプライマーを含む) をチューブあたり合計 8.0 μL のマスターミックス溶液を調製します。
3. 8.0 μLのマスターミックス溶液を各チューブに分注します。
4. 腎臓サンプルから精製した単離されたmiRNA1.0 μgを各チューブに加えます。
5. 各チューブにRNaseフリーの水を合計20 μL加え、ピペッティングで十分に混合し、1,500 x g で15秒間遠心分離します。
6. サンプルを37°Cで60分間インキュベートし、その後すぐに95°Cで5分間インキュベートします。 この手順は、サーマルサイクラーで実行できます。
7. cDNAを新しい微量遠心チューブに移し、RNaseフリー水で10倍(1:10)に希釈します。
8. 希釈したcDNAは氷上で短期保存し、使用前には-80°Cで長期保存してください。

5. miRNAのqRT-PCR

注:miRNAのqRT-PCRは、インターカレート色素を使用して行われます。ここでは、U6 small nuclear 2 (RNA-2)、miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-3p、miRNA-212-3p、miRNA-223-3p、miRNA-574-5pのプライマーを使用しました。

1. 1.5 mLの微量遠心チューブ、qRT-PCR用の96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用の接着フィルム、miRNA特異的プライマー、Taq DNAポリメラーゼを含むPCR Master Mix、PCRバッファー、デオキシヌクレオチド、ユニバーサルプライ^マー10、およびリアルタイムPCR装置を準備します。
2. 12.5 μL の 2x PCR Master Mix、ヌクレアーゼフリー水に溶解した各 miRNA プライマー (5 μM) 2.5 μL、および各ウェルに 1.25 μL の 10x ユニバーサルプライマーを含む Master Mix を調製します。
3. 22.5 μLのマスターミックスを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。
4. 各ウェルに2.5 μLのテンプレートcDNAを添加します。
5. プレートを96ウェル反応プレートの接着フィルムでシールします。次に、プレートを1,000 × g で30秒間遠心分離します。
6. リアルタイムPCR装置とソフトウェアを使用して、次のようにPCRサイクリングプログラムを実行します。
   1. プレートをリアルタイムPCR装置に入れます。Real-Time PCRソフトウェアを使用して、各ウェルのサンプルとターゲットmiRNAに名前を割り当てます。
   2. 指示に従って、リアルタイムPCRソフトウェアに次のPCRサイクリング条件を入力します:95°Cで15分間のプレインキュベーション、続いて94°Cで15秒間の変性40サイクル、55°Cで30秒間のアニーリング、および70°Cで30秒間の伸長。
7. リアルタイムPCR装置のソフトウェアを使用してqRT-PCRデータを解析します。非特異的な反応がないか確認してください。解離曲線またはメルト曲線を解析して、意図した増幅以外の増幅が発生していないことを確認します。
   1. 内在性コントロールとして、標的miRNAの発現レベルをRNU-6に標準化します。2^−ΔΔCT 法¹¹を用いて標的miRNAの相対発現量を計算する。

結果

ここでは、AKIマウスにおけるmiRNA発現プロファイルを調査しました。miRNAの発現プロファイルは、マウスのさまざまな臓器や組織で研究されています。MiRNAは重要な転写後調節因子であり、現在、AKIを含むさまざまな疾患の特性評価において広く研究されています。MiRNAは、病態の解明や^AKI12の治療への応用に役立つ可能性を秘めています。AKIの主な原因は、IRI、腎毒性の傷害、および敗血症です。腎臓のIRIは、AKIの発症の主要な危険因子の1つです。AKI¹³には多数のmiRNAが関与していることが報告されています。

この研究では、敗血症モデルとIRIモデルで一般的に変更されるmiRNAを、ここで説明するプロトコルを使用して調査しました。マイクロアレイ解析によりAKIマウスの腎臓でアップレギュレーションされることが示された17種類のmiRNAを選抜し、ヒトで発現することが報告されたmiRNAのうち7種類を調べました。6 種類の miRNA(miRNA-17-5p、miRNA-18a...

ディスカッション

この原稿で提示されたプロトコルを使用して、IRIマウスの腎臓由来のmiRNAを精製し、qRT-PCRを使用して検出することに成功しました。プロトコルにおけるIRI誘導手順の重要なポイントには、AKI²⁰に影響を与えることが知られている体温と麻酔濃度の慎重なモニタリングが含まれます。このプロトコルの強みは、虚血再灌流が達成されたかどうかを視覚的に確認できることです。ただし、この IRI モデルにはいくつかの制限があります。クランプ時間を長くして重度の虚血を誘発すると、死亡率が増加します。さらに、左腎動脈クランプを使用して腎虚血が達成されない場合は、腎動脈と静脈以外の腎臓への血管が結紮/クリップされていないためです。AKIを誘発する別の方法として、薬物注射(葉酸、アリストロキア酸、シスプラチン、ゲンタマイシン、グリセロール、L-ミモシン、CoCL₂、カナマイシン、フロセミド)などがあります。薬物誘発性AKIモデルとは対照的に、本モデルではAKIが誘導される時間を正確に決定し、AKIステージの個人差は最小限...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベントチップテーパーピンセットフックなし	夏目製作所	MA-47
バッファー RLT	Qiagen	79216	洗浄バッファー 1
バッファー RWT	Qiagen	1067933	洗浄バッファー 2
C57B6 マウス	SLC	を割り当て
	夏目製作所	MA-49
歯なし鉗子	夏目製作所	MA-48-1
止血クリップ	夏目製作所	KN−353
MicroAmp Optical qRT-PCR用96ウェル反応プレート	モフィッシャーサイエンティフィ	4316813	96ウェル反応プレート
MicroAmp 光学粘着フィルム	モフィッシャーサイエンティフィ	96ウェル反応プレート用4311971粘着フィルム
miRNA-132-3pプライマー	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5pプライマー	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p プライマー	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p プライマー	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p プライマー	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p プライマー	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5pプライマー	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	シリカ膜ベースのスピンカラム
miScript II RTキット	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCRキット	Qiagen	218073
QIAシュレッダー	Qiagen	79654	マイクロ遠心分離機スピンカラムでのバイオポリマーシュレッダーシステム
QIAzol 溶解試薬	Qiagen	79306	フェノール/グアニジンベースの溶解試薬
QuantStudio 12K Flex Flex リアルタイム PCR システム	Thermo Fisher Scientific	4472380	リアルタイム PCR 装置
QuantStudio 12K Flex ソフトウェアバージョン 1.2.1。	サーモフィッシャーサイエンティフィ	4472380	PCR装置ソフト
RNU6-2 プライマー	Qiagen	MS00033740	公開
手術用ハサミ	夏目製作所	B-2
血管クリップアプリヤ	VITALITEC	1621420