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方法論記事

がん薬理学研究のためのPDXとPDX由来オルガノイドのインビボ/インビトロ患者由来モデルペアの作成

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DOI:

10.3791/61382

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2021年5月5日

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1Crown Bioscience Inc., Changping District, Beijing, China, 2Crown Bioscience Inc., Taicang, Jiangsu, China, 3Crown Bioscience Inc., San Diego, CA, USA

この記事について

サマリー

インビトロスクリーニングのために患者由来の異種移植片(PDX)を使用してオルガノイドを作成する方法が記載され、インビボ/インビトロモデルのペアが一致する結果となる。PDX腫瘍は、機械的または酵素的に小片に収穫/処理され、その後、元のPDXに対して通過し、凍結保存され、特徴付けられる腫瘍オルガノイドを成長させるCleversの方法が続いた。

要約

患者由来腫瘍異種移植片(PDXs)は、最も予測的な前臨床モデルと考えられており、主に従来の癌薬物評価のために癌幹細胞(CSC)によって駆動されると考えられている。PDXsの大規模なライブラリは、患者集団の多様性を反映しているため、集団ベースの前臨床試験(「第II相のようなマウス臨床試験」)を可能にします。ただし、PDX には、低スループット、高コスト、および長期間の実質的な制限があります。腫瘍オルガノイドは、患者由来のCSC駆動モデルであることも、PDXのin vitro同等物と見なされ、オルガノイドまたは化合物の大規模なライブラリを扱うための特定のPDX制限を克服することができる。本研究では、PDX由来オルガノイド(PDXO)を作成する方法を説明し、インビトロおよびインビボ薬理学研究のためのペアモデルを生じる。皮下移植されたPDX-CR2110腫瘍は、腫瘍が200〜800mm3に達したときに腫瘍を持つマウスから採取し、承認された検死処置ごとに、隣接する非腫瘍組織を除去し、小さな腫瘍断片への解離を行った。小さな腫瘍断片を洗浄し、100μmの細胞ストレーナーを通過して破片を除去した。細胞クラスターを回収し、地下膜抽出液(BME)溶液に懸濁し、CO2インキュベーターで増殖するために周囲の液体培地を有する固体液滴として6ウェルプレートにめっきした。オルガノイドの成長を光顕微鏡下で週2回監視し、写真で記録し、続いて週に2〜3回液体培地変化を行った。成長したオルガノイドは、トリプシンの添加と10 μM Y-27632の添加によって助けられ、機械的剪断を使用してBME埋め込みオルガノイドを破壊することによって、さらに1:2比で(7日後)に継進した。オルガノイドは、長期保存のために凍結チューブで凍結保存され、遠心分離によってBMEから放出された後、さらに特徴付けのためにサンプリング(例えば、DNA、RNAおよびFFPEブロック)であった。

概要

癌は多様な遺伝的および免疫学的障害の集合体である。効果的な治療法の開発が成功することは、臨床結果を効果的に予測する実験モデルに大きく依存しています。よく特徴付けられた患者由来の異種移植片(PDX)の大規模なライブラリは、患者の腫瘍特性、不均一性および患者薬物応答1を再現する能力のために、化学療法および/または標的療法を試験するために選択された翻訳in vivoシステムとして長い間見られてきた。PDXsは一般に癌幹細胞疾患と考えられており、遺伝的安定性を特徴とする、細胞株由来異種移植片2とは対照的である。ここ数十年の間に、PDXの大規模なコレクションは、今日の癌の医薬品開発の主力となり、世界中で作成されています。広く使用され、大きな翻訳値を持つが、これらの動物モデルは本質的に高価で、時間がかかり、スループットが低いため、大規模スクリーニングには不十分です。PDXは免疫不全性の性質に起因する免疫腫瘍学(IO)検査にも望ましくない。したがって、利用可能な大きなライブラリのPDXを最大限に活用することは現実的ではありません。

ハンス・クレバーズの研究室5によって開拓された最近の発見は、上皮起源の大部分のヒト器官における成体幹細胞から生成されるオルガノイドのインビトロ培養の確立につながっている5。これらのプロトコルは、さまざまな適応症のヒト癌腫における想定CSからのオルガノイドの増殖を可能にするためにさらに改良された6,7。これらの患者由来オルガノイド(PPO)は、全学的に安定な8、9であり、臨床治療結果10、11、12を高い予測性であることが示されている。さらに、PPOのインビトロ性質はハイスループットスクリーニング(HTS)13を可能にし、インビボモデルよりも優位性を提供し、患者集団の代理として大きなオルガノイドライブラリを活用する可能性がある。PDUは、上述のPDXの多くの制限を克服し、重要な発見と翻訳プラットフォームになる準備ができています。

PDOおよびPDXは、患者由来およびCSC駆動モデルであり、パーソナライズされた治療または臨床試験形式のコンテキストで治療を評価する能力を有する。PDXの既存の大規模なライブラリは、>3000 PDXs14、15、16、17の独自のコレクションのように、腫瘍オルガノイド(PDX由来オルガノイド、またはPDXO)のライブラリの迅速な生成に適しており、PDXおよびPDXOモデルの組み合わせライブラリを得る。このレポートは、親PDX-CR2110モデル16に関連して大腸癌PDXO-CR2110を作成し、特徴付ける手順を説明する。

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プロトコル

動物のケアと使用に関するすべての議定書および修正または手順は、研究を行う前にクラウンバイオサイエンス施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されました。動物のケアと使用は、AAALAC(実験動物ケアの評価と認定協会)に従って行われました国際ガイドラインは、国立研究評議会(2011)の実験動物のケアと使用のためのガイドに記載されています。すべての動物実験手順は、SPF(特定の病原体フリー)施設で無菌状態にあり、異なる政府機関(例えば、国立衛生研究所)の実験動物のケアと使用のためのガイドに厳密に従って行われました。この議定書は、施設機関の動物実験倫理委員会(例えば、機関IACUC委員会)によって承認された。

1. 腫瘍移植の準備

  1. 動物用住宅
    1. ハウスバルブ/cヌードマウス(n=5)は、個々の換気ケージ、20〜26°C、30〜70%の湿度、および12-h光/12-h暗の照明サイクルで、コーンコブ寝具が毎週変更され、滅菌乾燥顆粒食品と無菌飲料水アドリビタムを照射した。
  2. ドナー腫瘍断片製剤
    1. 体重(BW、計量バランスを介して)、および腫瘍容積(TV、キャリパー測定による)について腫瘍を持つドナーマウスを注意深く監視する。
    2. テレビが800-1000 mm3に達すると、バイオハザードフードで腫瘍を持つ動物を安楽死させる。
      1. マウスを安楽死室に入れ、蓋をしてCO2ガスをチャンバーに送ります。動物への苦痛を最小限に抑え、急速な無意識を生み出す流量でガスをチャンバーに排出する。CO2の最適な流量は約2-2.5 Lpmです。
      2. 動物が意識を取り戻さないことを観察することによって安楽死を保障する。
      3. 明らかな臨床死の後、動物が回復する可能性を最小限に抑えるために>1分間のガスの流れを維持する。
    3. ヨウドファー綿棒を使用して腫瘍の周りの皮膚を殺菌する。隣接する非腫瘍組織を除去し、20mLのPBSを含むペトリ皿に入れることで腫瘍を採取し、安楽死前に予冷(4°C)する。
    4. 別のペトリ皿でPBSで腫瘍を洗い、血液成分を半分に切断し、余分な皮膚、血管、石灰化および/または壊死を取り除きます。
    5. 移植のために別の動物室に輸送する前に、PBSの20 mLで無菌50 mL遠心分離チューブに無傷の腫瘍片のみを入れます。

2. 皮下腫瘍の増殖

  1. 免疫不全マウスへの腫瘍片の皮下接種
    1. PDX腫瘍をメスで2mmに切り、皮下(SC)移植のためにトロカーにそれぞれを入れる。
    2. 5%のイオブルラン(1%で鼻コーンで維持される)でレシピエント動物を麻酔する。動物はリラックスし、右の反射を失い、最終的には痛みに反応しないまで動かなくなります。麻酔マウスを右横位置の実験ボードに固定し、ヨードファー綿棒、特に腫瘍接種部位を取り巻く領域で殺菌する。
    3. 左脇腹の皮膚には、ちょうど股関節に頭蓋を作り、メスで0.5センチメートルの切開を行い、鈍い鉗子を使用して、前肢に向かって皮膚の下にトンネルを作成します。
    4. 接種部位ごとに腫瘍断片の1つの立方体を培地から無菌的に移動し、皮下トンネルの奥深くに置く。傷のクリップで創傷の閉鎖前に断片の位置を視覚的に確認する。
    5. 腫瘍移植マウス(5)を注意力が高まるまで監視し、麻酔から完全に回復した後にのみケージに戻します。
  2. 腫瘍を持つマウスの健康モニタリング
    1. 毎日水と食品の消費量をチェックし、毎週体重を記録します。
    2. 定期的なモニタリング中にマウスを確認します。移動性、呼吸、グルーミング、一般的な外観、食物と水の消費量、BWの利益/損失、腹水などに影響を記録します。
    3. カリパーを使用して週2回テレビを測定し、mm3 あたりでエクスプレス:TV = 0.5 a ×b2、aとbはそれぞれ腫瘍の長さと幅です。
    4. 次の兆候のいずれかが現れたときにサンプルを収集するために動物を犠牲にする:BW損失>20%;身体の不自由な(食べたり飲んだりすることができない);有意な腹水または腹部の拡大のために正常に移動することができません。呼吸の努力;死。

3. 壊死と腫瘍の収穫

  1. 腫瘍の体積が200〜800mm3に達すると、承認されたプロトコルごとにマウスを安楽死させる(ステップ1.2.2を参照)。
  2. 隣接する非腫瘍組織を除去して腫瘍組織を採取し、その後、解離前にAD+++(氷上)で50mLプラスチックチューブに組織を入れる。

4. PDX由来オルガノイド培養の準備

注:以下のすべてのステップは、組織培養標準ガイドラインに従ってバイオセーフティキャビネット内で行われました。使用前に37°Cインキュベーターに96-、24、および6ウェルプレートの事前温め在庫を保管してください。

  1. 試薬製剤
    1. 地下膜抽出物(BME)溶液(成長因子が低下し、フェノールレッドフリー)を調製する。10mLのBMEを4°Cの冷蔵庫に一晩保管してください。解凍したら、BMEボトルを旋回して分散を確実にします。
    2. ベース メディア/洗浄バッファー AD+++ を準備します。5 mL L-グルタミン、1 M HEPES、ペン/ストレップを5 mLピペットでピペット処理して、高度なDMEM/F12メディアに5 mLを加えます。
    3. Satoらによって記載されているように大腸オルガノイド培地を調製する。 N-Ac(1 mM)、A83-01(500 nM)、B27(1x)、EGF(50 ng/mL)、ノギン(100 ng/mL)、ニコチンアミド(10mM)、SD2021を使用して18 90(10 nM)、R-スポンダミン(500 ng/mL)、L-グルタミン(2mM)、HEPES(10 μM)、ペニシリンストレプトマイシン(1x)およびY-27623(10 μM)19。
    4. AD+++消化培地を調製:コラゲナーゼタイプII(20mg/mL)の500μL(20mg/mL)の1xオルガノイド培養培地の10 mLとRhoKI Y-27632(10 mM)の10 μL。
  2. 腫瘍解離20
    1. 50 mLプラスチックチューブの腫瘍を10cmのペトリ皿に移します。定規と一緒に巨視的な写真を撮り、その状態(すなわち、サイズ、脂肪組織、血管管炎、壊死など)の説明を記録します。
    2. 吸引によって余分なAD +++を取り除き、1-2個をドライアイスで凍結するために2mLマイクロチューブに1〜2個の移入を続けて腫瘍組織を小片に切ります。ゲノムプロファイリングのために-80 °Cで保管してください。AD+++を使用して50 mLプラスチックチューブに移す前に、残りの部分をはさみで細かくミンチします。
    3. ひき肉をAD+++の35 mLで2〜3回洗浄し、続いて10mLの消化培地(ステップ4.1.4を参照)を加え、37°Cで1時間4 x g の軌道シェーカーに配置する。
    4. 5 mLの無菌プラスチックピペットを使用して上下にピペット化し、AD+++を20 mL添加し、100 μmの細胞ストレーナーで濾過することにより、消化組織を均質化します。
    5. パススルーをAD+++で2回洗浄し(450 x g で5分間スピン)、BMEで再懸濁(BMEの4倍量を懸濁液用ペレットに加える)、氷19に保つ。
  3. オルガノイド培養の準備
    1. BME細胞懸濁液を6ウェルプレートに複数滴で加え、1ウェル当たり合計200 μLにします。
    2. プレートを37°Cインキュベーターに移します。30分後、ゲルは固化を落とします。
    3. 各ウェルにオルガノイド培地の2 mLを加え、インキュベーターに移す前に顕微鏡写真で記録された代表的な滴(37°Cおよび5%CO2)を加える。
    4. 3~4日毎に培地変化を伴うオルガノイド培養物を維持し、7日毎に1:2比で、またはそれらの成長と密度に応じて通過する。

5. 組織病理学と次世代シーケンシング(NGS)解析

  1. 組織病理学
    1. P1000ピペットを使用して既存の培地とウェルからオルガノイドを収集し、続いて遠心分離(5分間450 x g でスピン)、PBSで洗浄し、10%ホルマリンで1時間固定します。
    2. 固定オルガノイドを50 mL円錐形チューブの底に100%ゼラチンに入れ、続いて定期的な組織処理と埋め込みを行います。
    3. 4mmパラフィンセクションで標準プロトコルを使用してヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色を行います。
  2. RNAEq とエキソメ シーケンシング全体
    1. P1000ピペットを用いて既存の培養培地でウェルからオルガノイドを採取し、その後に最大速度(12,000 x g)で5分間マイクロ遠心分離を用いて遠心分離を行い、4°Cで5分間回収する。
    2. 可視BMEが存在しないように培地上清を除去してペレットを回収し、マイクロチューブ(ドライアイス)でスナップ凍結し、次に-80°Cの冷凍庫に移します。
    3. メーカーの標準的な手順を使用してRNAまたはDNAを抽出し、RNAAseqとエキソームシーケンシング(WES)の両方に対してNGS分析を行います。

6. IC50 アッセイ20

  1. IC50 アッセイ用384ウェルプレートでのオルガノイド播種
    1. BME中のオルガノイドを解離すると、各ウェル(6ウェルプレート)に20μLの10μLのジスパーゼ溶液を加え、37°Cで10分のインキュベーションが行われます。
    2. ピペットは、70 μmフィルターを通してオルガノイドを50 mLプラスチックチューブに消化してオルガノイドを収集しました。
    3. オルガノイド濃度の測定のために顕微鏡下でオルガノイドを数える。BMEを加える前に、培養培地を使用してオルガノイドを吊り下げ、氷上で5%(v/v)の最終濃度に達する。
    4. オルガノイド懸濁液の50 μLを液体ディスペンサー付きの各384ウェルプレートに加え、対応するオルガノイド培養培地でウェルあたり200 CR2110 PPOの播種密度を持つプレートマップに従います。
  2. シスプラチンおよびイリノテカン処理
    1. シスプラチン(最高濃度100μM)と「イリノテカン」(濃度10μMの最高濃度)を使用してください。SN-38(イリノテカンの代謝産物、通常インビボ研究に使用されるイリノテカンとは対照的)を、9回の用量の薬物希釈スキームに従って、デジタルディスペンによる連続希釈で各ウェルに加える。
    2. デジタルディスペンサーソフトウェアツールを使用して、プレートマップを作成します。0%の生存率を示した5 μMのスターロスポリンの100%の生存率および後制御を有する陰性制御車を含む。
    3. 薬物処理された384ウェルプレートを37°Cインキュベーターに戻します。
  3. 薬物治療後のオルガノイド細胞生存率の決定
    1. 5日間の薬剤治療の終わりに、メーカーの推奨手順に従って、発光細胞生存率試薬を使用してオルガノイド細胞の生存率を決定する。液体ディスペナーで各ウェルに発光試薬を加え、プレートシェーカーで5分間混ぜ、暗い室温で30分間インキュベーションします。
    2. 発光マルチウェルプレートリーダーに発光信号を記録します。
    3. プレートリーダーからの生の測定値を使用して各ウェルの正規化された生存率を計算し、非線形曲線フィッティングによって線量応答曲線とIC50 値を作成します。

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結果

PPOの形態は、光顕微鏡下でのオルガノイドの典型的な、およびH&E染色当たりの親PDXと一致する
光顕微鏡の下で、PDXO-CR2110は、患者由来オルガノイド(PDO)に対して前述したように、典型的な嚢胞形態(図1A)を示し、同じ培養条件下でPDXOとPDOの類似性を裏付ける証拠である。

H&E染色による病理組織学的検査では、PDXO-CR2110(図1B)の組織構造と細胞型が、PDXとPDXOが同じ起源であるCR2110から開発されたことを支持する元のPDX-CR2110(図1C)を反映していることが明らかになった。この観察は、PDXOとその親PDXとの類似性を裏付ける組織病理学的証拠を提供する。

トランスクリプトーム発現とエキソメシーケンシング全体は、PDXO-CR2110...

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ディスカッション

この報告書のPDX-/PDXO-CR2110の予備データは、両方のモデルが患者の元のCSCに由来する疾患形態を表すため、ゲノミクス、組織病理学および薬理学に関して、PDXとその誘導体PDXOとの間の生物学的同等性を支持する。どちらのモデルも患者由来疾患モデルであり、患者10、11、12、21の臨床応答の予測可能性がある。インビトロモデルとインビボモデルの一致ペアは、インビボでのインビトロスクリーニングと検証のために互いに補完し合い、創薬の成功率を向上させ、臨床開発における消耗率を低下させる可能性がある。PDXOは、PDXが高いインビボコストと長いタイムラインのためにPDXが失敗する利用可能な大規模な患者由来オルガノイドライブラリを利用できるようにしました。言うまでもなく、一致したPDX-PDXOライブラリは、近い将来、創薬や翻訳研究を支援するプラットフォームとなるでしょう。

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開示事項

すべての著者は、クラウンバイオサイエンス社の現在の正社員です。

謝辞

著者らは、ジョディ・バルボー博士、フェデリカ・パリシ博士、ラジェンドラ・クマリ博士の原稿の批判的な読み取りと編集に感謝したいと考えています。著者らはまた、vitroとin vivoチームの偉大な技術的努力にクラウンバイオサイエンス腫瘍学に感謝したいと考えています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アドバンスト DMEM/F12ライフテクノロジー12634028ベースメディウム
DMEMハイクロンSH30243.01洗浄メディウム
コラゲニーズII型Invitrogen17101015消化腫瘍
マトリゲルコーニング356231オルガノイド培養マトリックス(基底膜抽出物、成長因子低減)
N-AcSigmaA9165オルガノイド培地
A83-01トクリス2939オルガノイド培地
B27ライフテクノロジー17504044オルガノイド培地
EGFペプロテックAF-100-15オルガノイド培地
ノギンペプロテック120-10Cオルガノイド培地
ニコチンアミドシグマN0636オルガノイド培地
SB202190SigmaS7076オルガノイド培養液
ガストリンシグマG9145オルガノイド培養液
RspondinPeprotech120-38-1000オルガノイド培養液
L-グルタミンライフテクノロジーズ 35050038オルガノイド培養液
HepesLife Technologies15630056オルガノイド培養液
ペニシリン-ストレプトマイシンLife Technologies15140122オルガノイド培地
Y-27632AbmoleM1817オルガノイド培地
DispaseLife Technologies17105041スクリーニングアッセイ
CellTiter-Glo 3DPromegaG9683スクリーニングアッセイ(発光ATPインジケーター)
マルチドロップディスペンサーサーモフィッシャーマルチドロップ コンビプレーティング オルガノイド/CellTiter-Glo 3D追加
デジタルディスペンナーTecanD300e化合物追加
エンビジョン プレートリーダーパーキンエルマー2104発光読み取り
Balb/c ヌードマウス北京 HFK バイオテクノロジー株式会社
RNAeasy ミニキットキアゲン74104tRNA精製キット
DNAeasy血液&ティッシュキットキアゲン69506DNA精製キット
ヒストゲルサーモフィッシャーHG-4000-012オルガノイド包埋
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参考文献

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