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方法論記事

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

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DOI:

10.3791/61383

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2020年8月27日

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

この記事について

サマリー

一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。

要約

マイクロRNA(miRNA)は、一本鎖で非コード化されたRNA分子であり、メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(UTR)の部分的に相補的な標的部位に結合することによって転写後レベルで遺伝子発現を調節するのが一般的であり、mRNAの翻訳および安定性を低下させる。マウスの様々な臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルは検討されているが、マウス腎臓におけるmiRNAの精製および定量のための標準的な方法は利用できなかった。我々は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による腎間質線維化によるマウス腎におけるmiRNA発現を抽出し、評価するための効果的かつ信頼できる方法を確立した。このプロトコルには、(1)シャムと一方的な尿管閉塞(UUO)マウスの作成の5つのステップが必要でした。(2) UUOマウスからの腎臓サンプルの抽出;(3) 腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNAの抽出;(4) 相補的 DNA (cDNA) miRNA からの逆転写による合成;(5) cDNAを用いたqRT-PCRを用いた。このプロトコルを用いて、対照と比較してmiRNA-3070-3pの発現が有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が腎間質線維症のマウスモデルの腎臓において有意に減少したことを確認した。このプロトコルは、UUOを有するマウスの腎臓におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。

概要

マイクロRNA(miRNA)は、メッセンジャーRNA(mRNA)1の分解および転写阻害を引き起こす短い非コードRNAであり、生理学1と疾患(例えば、炎症、線維症、代謝障害、癌)の両方において重要な役割を果たしている様々なmRNAの発現を調節することが示されている。したがって、miRNAの一部は,、様々な疾患2、3、4、53の新しい2バイオマーカーおよび治療標的の候補である可能性がある。,45脳、心臓、肺、肝臓、腎臓を含むマウスの臓器および組織におけるmiRNA発現プロファイルは66、7、8、9、107,8,9,10と記載されているが、腎間質線維症を有するマウス腎臓におけるmiRNAの抽出および評価のための標準的な方法は存在しなかった。

腎間質線維症を有す....

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プロトコル

すべての動物実験プロトコルは、吉地医科大学動物倫理委員会によって承認され、実験動物のための吉地医科大学ガイドから実験動物の使用とケアのガイドラインに従って行われました。

1. 恥の手術

  1. イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室用ワイプ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)付きのペトリ皿、4-0ナイロン、ピンセット、外科用ハサミ、綿棒、8週齢のC57BL/6オスマウスを用意します。
  2. 1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。次に、脱毛クリームをマウスの腹部に塗布します。数分後、脱毛クリームをPBS浸した実験室の拭き取りで拭き取ります。
  3. マウスの腹部に70%エタノールを注入し、その後、スピーフィンの位置にコルクシートの上にマウスを置きます。
  4. 手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。
  5. PBSで綿棒を2本湿らせ、腸を慎重に横に引っ張ります。湿らせた綿棒を置いて、左腎臓と尿管を識別します。
  6. 腹膜を閉じ、4-0ナイロンで切開を閉じます。

2. UUO手術

  1. イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室のワイプ、PBS付きペトリ皿、4-0シルク、4-0ナイロン、2.5 mLシリンジ、綿綿棒、ピン....

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結果

UUOマウスモデルは、20〜25gの体重を量る8週齢の雄マウスの21を記述した左尿管結紮によって作成された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。鎮痛薬(メロキシカム5mg/kg、皮下注射)は手術前および手術後2日間毎日投与された。手術後8日間で、腎臓を採取し、PBSですすいだ、解剖し、さらに分析するために液体窒素に貯蔵した。シャム作動したマウスはコントロールとして機能した。二重結紮は、左腎臓に水腎症がある場合に成功する。このUUOモデルを用いて得られたmiRNA qRT-PCRデータに基づいて、miRNA-3070-3pのレベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pのレベルは、コントロールと比較してUUOマウスの腎臓において有意に減少した(図1)。

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ディスカッション

qRT-PCR を用いた上記のプロトコルは、標的 miRNA の発現レベルを正常に決定しました。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るために重要であり、そしてqRT-PCRを行う前にmiRNAの品質を確認するために、260nmでの吸光度の比率を280nmで分光光度計で確認する必要があります。qRT-PCRでは、予想される長さおよび融点または単一性融解曲線の単一PCR増幅が得られない場合、反応板の各ウェルにDNA汚染またはプライマーダイマーが存在する可能性があります。

miRNAの発現レベルは、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法を含む、qRT-PCR以外のいくつかの方法で評価することができます。しかしながら、qRT-PCRは、正確かつ感度の高い、簡単で再現性の高い手順であり、より小さなサンプル量は、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイ22と比較してqRT-PCRに使用することができる。さらに、マイクロアレイは数万個のmiRNAの発現を同時に測定できるため.......

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開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

エダンツ・グループ(https://en-author-services.edanzgroup.com/)のミシェル・グッディ博士は、この原稿の草稿を編集してくれたことに感謝します。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Qiagen79216ウォッシュバッファー 2
Qiagen1067933ウォッシュバッファー 1
Tokyo Laboratory Animals Science未割り当て
サーモフィッシャーサイエンティフィック431681396ウェル反応プレート
サーモフィッシャーサイエンティフィック431197196ウェル反応プレート
用粘着フィルムQiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUGGGGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004膜固定スピン2.0 mL コレクションチューブ
Qiagen218161逆転写酵素キット
Qiagen218073Green 色素ベースの PCR キット
Qiagen796542.0 mL コレクションチューブ
Qiagen79306フェノール/グアニジンベースの溶解試薬
サーモフィッシャーサイエンティフィック4472380リアルタイムPCR装置
サーモフィッシャーサイエンティフィック4472380リアルタイムPCR装置ソフトウェア
Qiagen129112
QiagenMS00033740非公開
タカラバイオ9790Bシリコンホモジナイザー
ASKULGA04SW
AS ONEER1004NA45-KF2,62 -9968-32
内のカラム内のバイオポリマースピンカラム

参考文献

  1. Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
  2. Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.....

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