このプロトコルは、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を理解するための正規的方法を記述する。この方法は、トランスジェニックマウスモデルといくつかの正規の手法を用いて骨格表現型を分析する。
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方法論記事
条件付き Stat3 欠損マウスモデルの骨格表現型解析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
トランスジェニックマウスモデルは、破骨細胞の分化と活性を制御する重要な遺伝子を理解し、骨粗鬆症のメカニズムと薬学的治療法を研究するのに強力です。カテプシンK(Ctsk)-クレマウスは、破骨細胞の機能研究に広く使用されています。転写3(STAT3)のシグナルトランスデューサおよび活性化剤は骨恒常性に関連しているが、生体内の破骨細胞におけるその役割は未定のままである。STAT3が破骨細胞分化と骨代謝に関与しているというインビボの証拠を提供するために、我々は、破骨細胞特異的Stat3欠失マウスモデル(Stat3 fl/fl;Ctsk-Cre)を、骨格表現型を分析した。マイクロCTスキャンと3D再構成は、条件付きノックアウトマウスにおける骨量の増加を暗示した。H&E染色、カルセインおよびアリザリンレッド二重染色、および酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)染色を行い、骨代謝を検出した。つまり、このプロトコルは、骨格表現型を分析し、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を研究するためのいくつかの正規の方法と技術を記述する。
概要
骨格骨は人体の主な荷重を受ける器官であり、歩行と運動1の間に内部環境と外部環境の両方から圧力を受けている。骨は骨芽細胞と破骨細胞のバランスが取れた自己再生を通り抜け続ける。破骨細胞が古い骨を除去し、骨芽細胞が新しい骨を形成する過程は、骨格系2の恒常性および機械的機能を維持する。バランスの乱れは骨粗鬆症などの骨代謝性疾患を誘発しうる。骨粗鬆症は、過剰な破骨活性によって引き起こされ、世界的に流行しており、社会2、3、4に大きな経済的損失を引き起こす。骨粗鬆症治療に利用できる限られた数の薬物と副作用のリスク4によると、骨細胞形成および活動の詳細を明らかにすることが重要である。
単球/マクロファージ造血系統に由来する破骨細胞は、複数の核(2〜50核を有し得る)を有し、大きい(通常、直径100μmを超える)2である。骨破骨疾患のメカニズムの探索と薬剤のスクリーニングは、体外骨細胞内培養を通じて広く改善されているが、複雑な有機反応は、標的療法に不可欠なインビボの証拠を作る。マウスとヒトの間の遺伝的....
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プロトコル
ここに記載されている動物に関するすべての方法は、上海交通大学医学部の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 破骨細胞特異的 Stat3 欠失マウスの繁殖
注 :Stat3fl/fl マウスは商業的に得られた。 Ctsk-Cre マウスは、加藤(東京大学、東京12)によって提供された。マウスは、標準化された条件下で施設内の動物施設で特異的な病原体を含まない(SPF)状態下で飼育および維持した。
- 性的に成熟した雄のマウスと同じ年齢の2匹の雌マウスを組み合わせる。18日後、新生児の毎日のチェックをチェックしてください。妊娠中の雌マウスを分離し、必要に応じて単独で保管してください。雌マウスがペアリングから1ヶ月以内に妊娠しなかった場合、異なる繁殖ケージの間で雄マウスを変更する。
- Ctsk-Creマウス(F0)にStat3fl/flマウスを渡る。ジェノタイピングのための尾をクリップし、男性のStat3flを保つ/+;Ctsk-Cre....
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結果
本プロトコルを用いて、破骨細胞特異的Stat3欠失マウスを生成し、破骨細胞分化に対するSTAT3欠失の影響を検討した。Stat3Ctskマウスとその野生型(WT)リターメイトは、ジェノタイピング後に飼育され、保管された。骨髄マクロファージを単離し、破骨細胞に培養し、Stat3CtskマウスにおけるSTAT3欠失が実証された(図1)。
マイクロCTによるフェムラ再構成および定量分析は、Stat3Ctskマウスの骨量がWTマウスと比較して増加したことを示した(図2)。
WTおよびStat3Ctskマウスからのフェムラの組織形態をH&E染色を介して調べた(
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ディスカッション
遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患13のメカニズムおよび医薬的治療の研究に一般的に使用される。 Ctsk-Cre マウスは、破骨細胞6の機能研究に広く使用されている。本研究では、骨格表現型を分析し、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を研究する方法のプロトコルについて説明した。
組織学的分析は骨代謝を検出する最も直感的な方法です。そして、パラフィンセクションの品質は、組織学的分析の基礎です。骨組織を断片化させることができるので、骨組織の完全な固定および脱灰のための十分な時間は非常に不可欠である。フェムラと脛骨に焦点を当てた研究者は、埋め込みステップで大腿骨と脛骨を90°の角度に置く必要があります。信頼性と質の高い組織学的解析を行うために、軟骨層が対称的で、H&E染色で明確なM字線を示した矢状パラフィンセクションを選択しました。一方、膝関節と隣接する関節靭帯を観察する必要がある場合は、大腿骨と脛骨を120°の角度で配置する必要があります。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
試薬とマウスのWeiguo Zou教授と加藤先生、そしてZou研究室のメンバーに有益な議論を感謝します。また、上海第9人民病院頭蓋顔面異常研究センターのデジタル化された病頭学研究センターに対する支援に感謝します。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC)からの助成金によって部分的に支えられました[81570950、81870740、81800949]、 上海サミット・高原分野、上海精密医学研究所、上海九人民病院、上海交通大学医学部(JC201809)、上海交通大学医学部の高レベルイノベーションチームインセンティブプロジェクト上海交通大学医学部上海交通大学附属病院(JYJC201902)の学際研究基金L.J.は、優れた青少年医療人材、上海「医療人材の新星」青少年育成プログラム、上海交通大学の「陳興」プロジェクトの学者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4%パラホルムアルデヒド溶液 | サンゴンバイオテック(株) | ||
| アセトン | 上海実験試薬有限公司 | ||
| 80000360 Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| アンモニア溶液 | 上海実験試薬有限公司 | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875< | |
| em>Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | 上海実験試薬有限公司 | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | 電子顕微鏡 科学 | 14900 | |
| 蛍光顕微鏡 | オリン | IX73 | |
| ヘマトキシリン溶液 | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG& | mu;CT 80 | |
| NaHCO3 | 上海実験試薬有限公司 | ||
| ニュートラルバルサム | サンゴンバイオテック(株) | ||
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| パラフィン | ・サンゴン・バイオテック | ||
| 回転式ミクロトーム | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl/fl マウス | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| キシレン | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330年20月7 |
参考文献
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J.
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再版と許可
