Method Article

植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

DOI:

10.3791/61394

⸱

July 11th, 2020

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法は、全RNA抽出物からmiRNAを検出するためのノーザンハイブリダイゼーション技術の使用を実証する。

Abstract

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マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物の両方における遺伝子発現の調節に関与する内因的に非コード的に発現するクラスであり、〜21nt小さいRNAである。ほとんどのmiRNAは、主要遺伝子を標的とする遺伝子発現の陰性スイッチとして機能します。植物では、一次miRNA(プリミRNA)転写産物はRNAポリメラーゼIIによって生成され、プレミRNAと呼ばれる安定したステムループ構造の様々な長さを形成する。エンドヌクレアーゼ、Dicer-like1は、プレミRNAをmiRNA-miRNA*二重鎖に処理します。miRNA-miRNA*二重鎖からストランドの1つを選択し、アルゴノート1タンパク質またはそのホモログにロードして、標的mRNAの切断を仲介する。miRNAは主要なシグナル伝達分子ですが、それらの検出は、感度の高いノーザンブロット分析ではなく、最適なPCRベースの方法よりも低い方法で行われることが多い。我々は、文字通り、任意の植物組織から、非常に高感度でmiRNAレベルの定量に最適である、シンプルで信頼性の高い、非常に敏感な北部の方法を記述します。さらに、この方法は、miRNAとその前駆体のサイズ、安定性および存在量を確認するために使用することができる。

Introduction

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最近の小さな規制RNAの発見, マイクロRNA, それらを理解する研究をリードし、植物や動物でのそれらの役割1.miRNAの長い前駆体はHYL1および特異的なダイサー様タンパク質22、33によって21〜24nt成熟したmiRNAに処理される。22 nt miRNA は、二次 siRNA4を生成することによってカスケードサイレンシングを開始できます。研究は、開発におけるmiRNAおよび二次siRNAの役割を示している, 細胞の運命とストレス応答5,,6.

ノーザンハイブリダイゼーションは、特定のRNA分子を検出するために日常的に採用されている実験的方法である。このメソッドは、合計 RNA7のプールから約 19 -24 nt 長い小さな RNA の検出での使用をカスタマイズします。このデモでは、miRNAの検出と定量にこの手法を用いるための方法を示します。この方法では、放射性同位元素を使用したプローブのラベリングを使用します。したがって、サンプル中のmiRNAレベルは、感度の向上とともに検出することができる....

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Protocol

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1. 15%変性ポリアクリルアミドゲルの調製

  1. 尿素の4.8 gを加え、40%アクリルアミドの3.75 mLを加え、ビサクリアミド(19:1)溶液と10x TBE pH 8.2の1 mLを無菌50 mLチューブに加えます。
  2. 60°Cにセットした水浴を用いて尿素を透明な溶液に溶かします。
  3. オートクレーブされた新しい滅菌水を使用して体積を10 mLにメイクアップし、ゲルミックスを室温まで冷却します。
  4. 新鮮な10%(w/v)過硫酸アンモニウム溶液を調製します。

2. ガラス板と電気泳動ユニットの組み立て

  1. ゲル電気泳動と電気ブロッティングに必要な装置をすべて洗剤で洗います。柔らかいスポンジを使ってやさしくこすり、残留バッファーとアクリルアミドを取り除き、水で洗い流し、乾燥させます。
  2. 両方のガラス板を一緒に組み立て、スポンジの上にしっかりと置きます。このセットアップには厚さ1mmのプレートを使用してください。漏れを避けるために、プレートが同じレベルであることを確認してください。
  3. 10 mLのゲルミックスに、8 μLのTEMEDと80 μLの新鮮な10%(w/v)過硫酸アンモニウム溶液を加えます。
  4. 遅滞なく、組み立てられたガラス板の間に静かに混ぜて注ぎます。櫛を慎重に置きます。このステップでは気泡の発生を避けてください。....

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Results

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このデモでは、インディカ米の異なる組織におけるmiR397の発現を検出し、定量化した(図1)。miR397は22のnt miRNAおよび保存されたmiRNAである。miR397の発現は、テストされたすべてのサンプルで検出することができます。次世代シーケンシングデータに従って、サンプル1(苗組織)は100万回当たり5読み(rpm)でmiR397を有する。我々は、その信号を快適に検出し、この方法が非常に敏感であり、非常に低い豊富なmiRNAを検出するために使用できることを示した。今回の実験では、読み込みコントロールとして miR168 とU6を使用しました。

このブロット(図1)では、ImageJを用いて信号の強度を定量した。miR397の発現は、栄養葉鞘において最も高い。

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Discussion

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この方法は、あまり豊富なmiRNAを含む小さなRNAの検出および定量化に広く使用することができる。プロトコルは主に、ローディングバッファー内の全RNAを変量するステップ、ゲル電気泳動によるサイズ分離、膜へのRNAの伝達、RNAを膜に架橋し、所望の放射性標識されたオリゴプローブを使用してハイブリダイズするステップを記述する。

ブロッティング実験の重要なステップは、サンプル調製のための良質のRNAの使用です。ゲルをロードする前に、サンプルが自由に流れ、負荷の先端に固執していないことを確認する必要があります。サンプルをロードする間は注意が必要ですが、サンプルがウェル内の1つの薄い層を占めているように、先端は井戸の底のすぐ上に挿入する必要があります。ハイブリダイゼーションオーブンの温度は、非常に少ない豊富なmiRNAの検出のために35°Cで維持されなければなりません。ブロットのハイブリダイゼーションを繰り返す場合は、2倍のSSCで湿気を保ち、4°Cで保存してください。

この方法は、多糖類およびポリフェノール

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Disclosures

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利益相反は宣言されていません。

Acknowledgements

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著者らは、ホスト研究所とBRITが提供する放射線ラボへのアクセスを認めている。PVS研究所は、国立生物科学センター、タタ基礎研究所、助成金(BT/PR12394/AGIII/103/891/2014;;BT/IN/スイス/47/JGK/2018-19;BT/PR25767/GET/119/151/2017) インド政府バイオテクノロジー省から。MPは、DBT研究アソシエイトシップ、DBT、インド政府を認めています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40% アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液SigmaA9926
過硫酸アンモニウム (APS)BioRad1610700
あぶらとり紙whatmann あぶらとり紙 I1001-125
ブロモフェノールブルーSigmaB5525-5G
毛細管ローディングのヒントBioRad2239915
脱イオン化ホルムアミドアンビオンAM9342
ヒーティング ブロックエッペンドルフ5350
ハイボンド N+ナイロン膜GERPN203B
ハイブリダイゼーション ボトルシグマZ374792-1EA
ハイブリダイゼーション オーブンサーモ サイエンティフィック1211V79
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)シグマT7024-25ml
フォスファーイメージャーGE-台風スキャナー29187194
フォスファーイメージャースクリーンとカセットGEヘルスケアGE28-9564-75
ペットギルソン、モデル:P20およびP10FA10002M、FA10003M
プラスチックピペットファルコン357550
ポリアクリルアミドゲル装置BioRad1658003EDU
Sephadex G-25 カラムGE ヘルスケア27532501
スピード Vac コンセントレーターThermo Scientific20-548-130
SpinwinTarsons1010
T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (PNK)NEBM0201S
トランスブロット装置BioRad1703946
ULTRAHybハイブリダイゼーションバッファー AmbionAM8670
尿素フィッシャー サイエンティフィ15985
UV架橋剤UVPCL-1000L
ボルテックスターソン3020
ウォーターバスNEOLABD-8810
キシレンシアノールSigmaX4126-10G
ピック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V.

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