Method Article

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

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ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。

Abstract

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精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および内分泌学を体外で研究するためのツールを提供します。精巣オルガノイドを作るためにいくつかの方法が開発された。これらの方法の多くは、de novo組織アセンブリを促進するために細胞外マトリックス(ECM)に依存しますが、バイオミメティック形態と組織の機能の点で方法の違いがあります。さらに、公開されたメソッドの直接比較はほとんどありません。ここでは、オルガノイド生成プロトコルの違いを研究することによって直接比較が行われ、結果が得られる。4つの原型生成方法:(1)2D ECMフリー、(2)2D ECM、(3)3D ECMフリー、および(4)3D ECM培養法が記載されている。精巣オルガノイド発生を評価するために3つの主要なベンチマークが使用された。これらは、細胞自己集合体、主要な細胞タイプ(セルトリ、レイディグ、胚芽、および骨膜細胞)を含み、適切に区分された組織アーキテクチャである。試験された4つの環境のうち、2D ECMおよび3D ECMフリー培養は、尿管細胞型と間質細胞型のデノボ区画化、管状構造の開発、確立された長期内分泌機能など、天然精巣に最も類似した内部形態を有するオルガノイドを生成した。研究されたすべての方法は、未ソートの一次マウス精巣細胞懸濁液を利用し、一般的にアクセス可能な培養リソースを使用した。これらの精巣オルガノイド生成技術は、精巣の器官形成および生理学の研究イニシアチブのための非常にアクセス可能で再現性の高いツールキットを提供する。

Introduction

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精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および生理学をvitro11、2、3、42,3,4で研究するための先駆的な技術である。オルガノイド生成のためにいくつかの方法が検討されている。これらには、2次元(2D)および3次元(3D)の向きの両方で、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリー培養系が含まれる。異なる生成方法は、明確なセルラーアセンブリ戦略を促進することができます;これにより、公開されたオルガノイドモデル間の形態学的および機能的変動の高いレベルが生じる。この記事の目的は、精巣の器官化実験を設計する際に、体外精巣モデルの現状を議論し、将来の研究者のためのテンプレートとして機能することです。本研究では、4つの異なる培養系のアーキタイプが、実験過程および生物学的結果において定義され、特徴付けられる。これらには、2D ECM フリー、2D ECM、3D ECM フリー、および 3D ECM カルチャメソッドが含まれます。本書に示す戦略は、異なる研究所と研究グループ間で、シンプルでアクセスしやすく、再現性の高い戦略です。

歴史的に精巣のために、「in vitro」という指定は、精巣組織および細胞のいくつかの異....

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Protocol

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すべてのマウス実験はノースウェスタン大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、すべての手順はIACUC承認プロトコルの下で行われました。

1. 酵素組織解離液の調製

  1. 2種類の酵素溶液(溶液1および溶液2)を用いて、いずれも基底培養培地溶液(BM)を用いて作製した。
  2. BMを調製するには、血清およびペニシリンストレプトマイシンを最小必須培地から最終濃度10%および1%にそれぞれ加えます(特定の試薬の材料表を参照)。次いで、0.22 μmフィルターを介してBMを無菌でフィルタします。細胞と共に使用する前に、培養皿に分注し、加湿した5%CO2インキュベーターを最低1時間37°Cで入2れることによって、無菌BMを中性pHに事前平衡化する。
    注:BMは、新鮮なBMを作る必要があり、その後、1週間まで4°Cで保存することができます。
  3. コラゲレーターIストック液を調製するために、まず100mgのコラゲレーターIを1mLの無菌胚グレードH2O(最終濃度10%m/v)に溶解し、反転または旋回して溶解し、後で使用するために-20°Cで20μLのアリコートを保存する。アリコートは一度だけ解凍する必要があります。
  4. デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)ストック溶液を調製するには、DNase Iの20mgを無菌胚グレー....

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Results

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精巣細胞が培養72時間以内に自己集合しなかった場合、オルガノイド生成は失敗と考えられていたが、ここで提示されるすべての方法は、若年性(5dpp)マウス細胞を使用する場合には24時間以内に組み立てられる。培養後も自由に懸濁した細胞( 図1の0hカラム)の継続として提示される生物学的構築物生成の失敗(72時間)。。組織自己集合性がない場合、任意の見かけの細胞クラスターは、穏やかな操作(すなわち、ピペット化)でさえも個々の細胞に容易に分散する。正常に生成された組織は、最初は3D細胞の「クラスター」として観察された( 図1の6hカラムの黄色い矢印)。ECMフリー環境(2Dおよび3D)内では、これらの構造は、特に3Dアガロースペトリ皿(図1A,C)で、文化の最初の24時間にわたって「コンパクト」に見えました(ECM 環境 (2D および 3D) のセル クラスターでは、クラスタとその周辺環境との間に明確なマージンがあります (

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Discussion

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このオルガノイド生成プロトコルの完成により、ユーザーはECMまたはECMフリー環境で精巣構造およびオルガノイドを組み立てるために利用可能な4つの異なる培養技術を有する。重要なことに、4つの方法はすべて、研究者がタイムラプスイメージングまたはビデオ記録を通じて時間の経過とともにオルガノイド自己集合を非侵襲的に観察し、培養中に組織を乱すことなく、分泌されたホルモンおよびサイトカインの分析のために非侵襲的に条件付き培地を収集することを可能にする。すべての方法において、24時間の間に、実験者は細胞数が許す限り数百個のオルガノイド/精巣構造を生成することができる。これらの方法は、組織の自己集合を異なるサイズと形態を持つ構造に促進します。オルガノイドサイズは、培養で使用される細胞数および濃度に依存し、他のオルガノイド報告書34に見られるようになる。オルガノイドの大きさや直径を小さくすることは、時にはより大きなオルガノイドに現れる壊死の内側領域の発達を減らすのに役立つかもしれない。2D ECMおよび3D ECMフリープロトコル法の特定の強みは、形態学的模倣精巣オルガノイドを生成する能力であり、管状細胞型.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この研究は、国立衛生研究所、国立衛生人間開発研究所(NICHD)F31 HD089693、国立環境衛生研究所/国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NIEHS/NCATS)UH3TR001207および4UH3ES029073-03、トーマス・J・ワトキンの記念教授によって資金提供されました。

著者らは、エリック・W・ロスが透過電子顕微鏡の支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、ソフトおよびハイブリッドナノテクノロジー実験(SHyNE)リソース(NSF ECCS-1542205)からの支援を受けているノースウェスタン大学のNU ANCE センターのBioCryo施設を利用しました。材料研究センターのMRSECプログラム(NSF DMR-1720139)国際ナノテクノロジー研究所(IIN)そしてイリノイ州、IINを通じて。また、MRIプログラム(NSF DMR-1229693)からサポートを受けているCryoCluster機器を利用しました。図 1 のグラフィックスは、BioRender.comを使用して設計されています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 um媒体の生殖不能フィルターMilliporeのシグマscgpu05re生殖不能のろ過媒体
3&ベータのため;HSD 一次抗体Cosmo Bio CoK0607Leydig cell marker, 1:500 dilution
AlexaFluor 568 &-MouseThermo Fisher ScientificA-21202蛍光タグ付き二次抗体
AlexaFluor 568 &-RabbitThermo Fisher ScientificA10042蛍光タグ付き二次抗体
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080培地のベース
コラゲナーゼ Iワーシントン バイオLS004197解離液用 1
コーニング マトリゲル膜マトリックス、LDEVフリーコーニング3542342Dおよび3D ECM培養ゲルのキャスティングに使用される細胞外マトリックス
Countess セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィックC10227オートメイテッドセルカウンター(血球計算装置)
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228Hemacytometer slide for use with Countess自動カウンター
DDX4 一次抗体Abcam138540Spermatogonia marker, 1:500 dilution
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)Worthington BioLS002140解離液用 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182再構成用 ヒアルロニダーゼ
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 +Ca/+Mgサーモフィッシャー サイエンティフィック14040117PBS
胚グレード H2Oミリポア シグマW1503再構成用 コラゲナーゼIおよびドナーゼI
の再構成用 ウシ胎児血清サーモフィッシャーサイエンティフィック16000044クエンシング酵素解離液
胞刺激ホルモンアブカムab51888長期オルガノイド培養用
ヒト絨毛性ゴナドトロピンミリポアシグマC1063長期オルガノイド培養用
ヒアルロニダーゼ、ウシ精巣由来ミリポアシグマH4272解離液用 2
インヒビンB 酵素結合免疫吸着アッセイアンッシュラボAL-107インヒビンB ELISAキット
ノックアウト血清交換サーモフィッシャーサイエンティフィック10828-028基礎培地用血清ソース
マイクロ組織 3Dペトリ皿 マイクロモールドスフェロイド(24-35、5x7アレイ)ミリポアシグマZ7640513D ECMフリーオルガノイド製造用
Nunc、Lab Tek IIチャンバースライドシステム、4ウェルサーモフィッシャーサイエンティフィック12-565-72D ECMフリー、および2D、3D ECM培養
ペニシリン/ストレプトマイシン用サーモフィッシャーサイエンティフィック15-140-122メディア用抗生物質
リチャード・アラン・サイエンティフィック;Histogel, Specimen Processing gelThermo Fisher ScientificHG-4000-012For aiding paraffin embedding
SOX9 primary antibodyMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker, 1:500 dilution
Tedklad Global Mouse Chow (ブリーダー)Teklad Global2920Mouse food without phytoestrogens
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)Teklad Global2916植物性エストロゲンを含まないマウス食品
テストステロン 酵素結合免疫吸着アッセイCalbiotechTE373Sテストステロン ELISA キット
トリパン ブルー 溶液、0.4%サーモフィッシャー サイエンティフィ15250061細胞計数
用&α;SMA 一次抗体ミリポア シグマA2547尿管周囲マーカー、1:500 希釈
&β;カテニン一次抗体BD Biosciences610154Sertoli Cytoplasm marker、1:100
卵ック 希釈

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro....

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