ここでは、巨大なアンキリンGがないために組み立て済みのAISを欠く海馬ニューロンの軸索初期セグメント(AIS)の組み立てと構造を定量的に研究するプロトコルについて説明した。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
ニューロン軸索初期セグメント(AIS)は、作用電位の開始部位であり、分子構造、組立および活動依存性の可塑性について広く研究されている。AISのマスターオーガナイザーであるジャイアントアンキリンGは、膜をまたぐ電圧ゲート付きナトリウム(VSVG)およびカリウムチャネル(KCNQ2/3)、ならびにL1CAM細胞接着分子である186kDaニューロファシンと直接関連付けます。ジャイアントアンキリン-Gはまた、β-4-スペクトリン、および微小管結合タンパク質EB1/EB3およびNdel1を含む細胞質AIS分子に結合し、募集する。巨大なアンキリンGは、アンキリンG欠損ニューロンにおけるAIS形成を救うのに十分である。Ankyrin-Gはまた、AISの代わりに樹状脊椎に位置する小さな190 kDaアイソフォームを含み、AISに標的化したり、アンキリンG欠損ニューロンでAISを救出することができない。ここでは、ANK3-E22/23-floxマウスからの培養海馬ニューロンを用いたプロトコルについて説明し、Cre-BFPにトランスフェクトすると、アンキリンGのすべてのアイソフォームの喪失を示し、AISの形成を損なう。修飾されたバンカーグリア/ニューロン共培養システムを組み合わせて、AISの形成を救うのに十分な480 kDaアンキリンG-GFPプラスミドを持つアンキリンGヌルニューロンをトランスフェクトする方法を開発しました。さらに、サルザーと同僚が開発した定量方法を採用し、海馬ニューロン培養で起こるニューロン細胞体からのAIS距離の変動に対処する。このプロトコルは、AISのデノボアセンブリと動的挙動の定量的研究を可能にする。
概要
軸索初期セグメントは、ほとんどの脊椎動物ニューロンの近位軸索に位置する。機能的には、AISは、この領域の電圧ゲートナトリウムチャネルの高密度のためにアクション電位が開始される場所です。いくつかの興奮性ニューロンのAISはまた、GABAergicシナプス1、2、3を形成することによって阻害性インターニューロンによって標的にされる。したがって、AISは細胞シグナル伝達を統合し、ニューロンの興奮性を調節する重要な部位である。AISは通常20~60μmの長さで、細胞体から20μm以内に位置しています。AIS の長さと位置は、脳領域全体のニューロンで異なります, 同様に同じニューロンの異なる発達段階で 4,5.蓄積された証拠は、AISの組成と位置が神経活動4、5、6、7の変化に応答するに動的であることを示唆した。
480 kDaアン....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
注:このヒマチニューロンの培養法は、出生後0日ANK3-E22/23f/fマウスから、ゲイリー・バンカーのグリア/ニューロン共培養系から適応される。 従って、殺菌された用具を使用してきれいなフードで解剖した後のすべてのステップを行うことが重要である。このプロトコルは最大 1 か月かかります。図3にワークフローが表示されます。プロトコルはデューク大学の動物のガイドラインに従います.
1. カバーリップと神経メッキ料理の準備
- 培養日の少なくとも1週間前に、カバースリップラックにカバースリップを積み込み、硝酸(70%W/W)に一晩浸します(数日延長することができます)。
- 硝酸処理されたカバーリップを、ガラス瓶の低速シェーカーに蒸留水で2回、それぞれ1時間洗浄します。
- 飽和KOH中のカバーリップを一晩100%エタノールに溶解するインキュベート。溶解しなくなるまで、KOHをエタノールに加えます。
- 蒸留水で洗浄工程を繰り返します。100%エタノールで10分間に1回のカバーリップをすすいすります。
- カバースリップをラックからガラスビーカーに移します。ビーカーをアルミホイルで覆います。カバーリップを一晩225°Cのオーブンで焼き、カバーリップを殺菌します。(カバーリップは何週間もビーカーに保存す....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
実験の完全なセットは、陰性対照としてクレ-BFPのトランスフェクションのみを含む必要があります, Cre-BFPプラス 480 kDa ankyrin-Gは、正のコントロールとして、非トランスフェクションの状態を技術制御として.Cre-BFPのみ制御において、トランスフェクトされたニューロンは、AnkG(ankG)、β4-スペクトリン(β4)、ニューロファシン(Nf)および電圧ゲートナトリウムチャネル(VSVG)を含むAISマーカーの蓄積を欠いている(図4A)16。対照的に、Creと480 kDaアンキリン-G共トランスフェクションニューロンは、AISマーカーの存在によって明らかにされたAISを完全に組み立てている(図4B)。非トランスフェクションされた料理と比較して、培養の質を確認することが重要です。不健康なニューロンは、中止または異所AISのような異常なAIS構造を示す傾向がある(図4C)。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
AISの組み立ては480 kDaアンキリン-Gによって組織される。しかし、ankyrin-Gは野生型ニューロンのAISを標的とすることができる短いアイソフォームを有し、AISアセンブリの構造機能解析の解釈が困難になる可能性がある。ここでは、AISのデノボアセンブリの研究を可能にするANK3-E22/23-floxマウスのニューロンを用いた方法を提示する。 3 divでCre-BFPでトランスフェクトすることにより、アンキリンGの内在性アイソフォームをすべて排除します。また、AISの形成を救うために480 kDa ankyrin-Gを共同トランスフェクトすることもできます。これにより、クリーンなシステムにおけるAIS形成の研究が可能になります。グリア細胞の過剰増殖を伴わずに生存率を向上させるバンカー培養システムをさらに採用することで、高いトランスフェクション効率に達し、AIS寸法の定量測定に十分なニューロンを提供することができました。
このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。最初の重要なステップは、AISの組み立てを防ぐのに十分早く、最.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
神経培養プロトコルに関する提案をしてくれたゲイリー・バンカー博士に感謝します。この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIHからの助成金、ジョージ・バース・ゲラーが教授職(V.B.)によって支えられている。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10xHBSS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14065-056 | |
| 18mm カバーガラス (1.5D) | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-84-1D | |
| 190kDa アンキリン-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% トリプシン フェノールレッドなし | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14065-056 | |
| 480kDa アンキリン-G-GFP | ラボ ご要望 | に応じて | 提供 |
| ANK3-E22/23f/fマウス | JAX | 品番:029797 | B6.129-ANK3TM2.1Bnt/J; |
| B27 無血清サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A3582801 | |
| ホウ酸 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| 70 mmメッシュ付きセルストレーナー | BD Biosciences | 352350 | |
| セラミックカバースリップ染色ラック | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle'塩とL-グルタミン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11095-080 | |
| ニューロベースルミディアム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21103-049 | |
| 硝酸 70% | シグマ-アルドリッチ | 225711 | |
| Opti-MEM I 還元血清培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31985062パラ | |
| ホルムアルデヒド | シグマ-アルドリッチ | P6148 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 15140122 | |
| ポリ-L-リジン塩酸塩 | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| 水酸化カリウム | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
参考文献
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
