ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

Summary

エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。

Abstract

多重液滴PCR(mdPCR)ワークフローとエピジェネティックベースの白血球(WBC)微分カウントを決定するための詳細なプロトコルが、熱可塑性エラストマー(TPE)マイクロ流体液滴生成装置と共に記載されている。エピジェネティックマーカーは、異なる疾患における重要な予後値であるWBCサブタイピングに使用されます。これは、ゲノム中の特定のCGリッチ領域(CpG loci)のDNAメチル化パターンの定量化を通じて達成される。本論文では、末梢血単核細胞(PBMCs)の亜硫酸水素塩処理DNAを、WBC亜集団と相関するCpG遺伝子座に特異的なプライマーおよび加水分解蛍光プローブを含むmdPCR試薬を用いて液滴に封入する。マルチプレックスアプローチは、別々のmdPCR反応を必要とせずに多くのCpG遺伝子座の尋問を可能にし、メチル化部位のエピジェネティック解析を用いたWBC亜集団のより正確なパラメトリック決定を可能にする。この精密な定量はさまざまな適用に拡張することができ、臨床診断とその後の予後のための利点を強調する。

Introduction

白血球(WbCs)組成物の分析は、血液学的診断において最も頻繁に要求される検査検査の一つです。▲微分白血球数は、感染症、炎症、貧血、白血病などの疾患のスペクトルの指標として機能し、他のいくつかの条件の初期予後バイオマーカーとして調査中である。WBCサブタイピングにおけるゴールドスタンダードは、高価で不安定な蛍光抗体を必要とする免疫染色および/またはフローサイトメトリーを含み、サンプル調製におけるオペレータの熟練度に大きく依存することが多い。さらに、この方法は、出荷または後の分析のためにサンプルを凍結することができないような新鮮な血液サンプルにのみ適用されます。

エピジェネティックマーカーは、表現型のバリエーションの研究のための強力な分析ツールとして最近登場しています。その後、ヒト白血球集団は、WBCサブセットの正確な特徴付けを可能にする細胞系DNAメチル化パターンを有することが示されている。エピジェネティックマーカーに基づくサブタイプは、新鮮な血液サンプル採取や高価な抗体に依存せず、疾患発症および感受性^{11、2、3、4、52,}のバイオマーカーとして利用できる有望な代替手段を提供する。^3,4,

Protocol

ヒトサンプルを含むこの研究で行われたすべての実験は、NRCの倫理委員会によって承認され、適用される研究ガイドラインに従い、カナダのケベック州の法律に準拠している人間の被験者を支配するNRCの方針に従って行われました。

1. 細胞の調製

1. 凍結したヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、凍結した凍結した血液単核細胞(PBMC)を、水浴中に凍結槽を5分間37°Cで置いてすぐに解凍する。
2. 細胞を穏やかに再懸濁し、1 mLピペットを使用して細胞懸濁液を15 mL円錐形チューブに移すために、2回クライオビアルを反転させます。

1. 
   

Results

TPEベースのマイクロ流体液滴発生装置は、図1に示すように記載されたプロトコルを用いて製造した。透明マスクをフォトリソグラフィに使用し、シリコン(Si)マスターを得る。柔らかいリソグラフィは、次いでエポキシ型を製造するために使用されたSiマスターの逆PDMSレプリカを得るために行った。エポキシ前駆体をPDMS上に注ぎ、架橋して硬化させた。この金型は、Siマスターの正確なレプリカを表す、熱エンボスを使用して熱可塑性のその後の熱成形のためにより弾力性があった。エポキシモールドが得られると、熱可塑性エラストマーをエンボス加工した。エンボス加工の後、TPEは解体され、デバイスは切断されました。平らなTPEの基質は装置を密封するために使用された。上部カバーに穴を開け、2つの基板を接着した。最後に、世界とチップの接続に必要なチューブが挿入され、デバイスが使用できる状態になりました。製造されたマスター金型、TPE材料およびエンボス加工装置のサンプル画像を図2に示します。チューブインターコネクトを備えた組み立てられた装置は、一対の独立.......

Discussion

提示された実験的なプロトコルおよび方法は作られたTPEの液滴発生器、熱サイクラーおよび蛍光顕微鏡を使用して社内mdPCRを可能にする。柔らかいTPEからTPEへの結合を使用して製造された装置は、最終的な装置が液滴発生器としてその後使用するために表面処理を必要としないように、すべてのチャネル壁にわたって均一である疎水性表面特性を与える。この材料は、高スループット製造^{,,9、10、11、12、1310,11}との互換性を必要とするポイント・⁹オブ・ケア・プラットフォームで日常的に採用されています。¹²¹³また、光学的にも明瞭で、可視スペクトルにおける低蛍光の背景を示し、mdPCRを使用した完全なサンプル対回答ワークフローの将来の統合に魅力的な特徴です。PCR試薬のレシピは、ファシリティ多重化遺伝子の定量を可能にする自家製.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON TFI0201		PCR tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactant	Fluoro-Surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, UK		EMCCD camera
Thermo Fisher Scientific, Waltham,	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		蛍光画像解析
ニコン, 日本		10倍対物レンズ
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
フィッシャー、カナダ
Vitrocom、ニュージャージー州、米国	5015 および 5010	ホウケイ酸キャピラリーチューブ
(http://definetherain.org.uk/)
浜松、日本	LC-L1V5	DEL UV 光源
ドロマイト	3200063	使い捨て流体チューブ
ドロマイト	3200302	使い捨て流体チューブ
IDT、コーラルビル、アイオワ
州ニコン、メルビル、ニューヨーク		立光学顕微鏡
Cytec Industries、ウッドランドパーク、ニュージャージー
州 EV Group、Schärding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Switzerland		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germany
Image J		液滴径
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		広域スペクトルLED蛍光灯
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, & Aring;エムアリング;l, Sweden		熱可塑性エラストマー(TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japan		画像取得
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	青色蛍光生細胞染色(DAPI)
IDEXヘルス&科学、オークハーバー、WA	P-881 PEEK	フィッティング
Sigma-Aldrich、オークビル、オンタリオ州	806552
ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州
ThinkyUSA、CA、USA	ARV 310
IHC world、メリーランド州、米国	IW-125-0
Zinsser NA、ノースリッジ、CA	2607808
Cetoni GmbH、コルビュッセン、ドイツ
Sigma-Aldrich、オークビル、オンタリオ州	484431
Bio-Rad、ミシサガ、オンタリオ州	1861096
日立ハイテクノロジーズ、ミシサガ、オンタリオ州
ニコン、メルビル、ニューヨーク		倒立顕微鏡
ニコン、日本
ロックタイト	AAの352