方法論記事

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

DOI：

10.3791/61421

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2020年6月29日

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1Life Sciences Division, National Research Council of Canada, 2Galenvs Sciences, Inc.

この記事について

サマリー

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エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。

要約

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多重液滴PCR(mdPCR)ワークフローとエピジェネティックベースの白血球(WBC)微分カウントを決定するための詳細なプロトコルが、熱可塑性エラストマー(TPE)マイクロ流体液滴生成装置と共に記載されている。エピジェネティックマーカーは、異なる疾患における重要な予後値であるWBCサブタイピングに使用されます。これは、ゲノム中の特定のCGリッチ領域(CpG loci)のDNAメチル化パターンの定量化を通じて達成される。本論文では、末梢血単核細胞(PBMCs)の亜硫酸水素塩処理DNAを、WBC亜集団と相関するCpG遺伝子座に特異的なプライマーおよび加水分解蛍光プローブを含むmdPCR試薬を用いて液滴に封入する。マルチプレックスアプローチは、別々のmdPCR反応を必要とせずに多くのCpG遺伝子座の尋問を可能にし、メチル化部位のエピジェネティック解析を用いたWBC亜集団のより正確なパラメトリック決定を可能にする。この精密な定量はさまざまな適用に拡張することができ、臨床診断とその後の予後のための利点を強調する。

概要

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白血球(WbCs)組成物の分析は、血液学的診断において最も頻繁に要求される検査検査の一つです。▲微分白血球数は、感染症、炎症、貧血、白血病などの疾患のスペクトルの指標として機能し、他のいくつかの条件の初期予後バイオマーカーとして調査中である。WBCサブタイピングにおけるゴールドスタンダードは、高価で不安定な蛍光抗体を必要とする免疫染色および/またはフローサイトメトリーを含み、サンプル調製におけるオペレータの熟練度に大きく依存することが多い。さらに、この方法は、出荷または後の分析のためにサンプルを凍結することができないような新鮮な血液サンプルにのみ適用されます。

エピジェネティックマーカーは、表現型のバリエーションの研究のための強力な分析ツールとして最近登場しています。その後、ヒト白血球集団は、WBCサブセットの正確な特徴付けを可能にする細胞系DNAメチル化パターンを有することが示されている。エピジェネティックマーカーに基づくサブタイプは、新鮮な血液サンプル採取や高価な抗体に依存せず、疾患発症および感受性11、2、3、4、52,のバイオマーカーとして利用できる有望な代替手段を提供する。3,4,5

ゲノムワイド研究は、白血球サブタイプにおけるゲノム(CpG島)におけるメチル化された特定のCGリッチ領域の広範なマッピングに対して行われ、白血球サブタイプに特異的なエピジェネティックマーカー候補を同定する。PCRプロトコルは、メチル化遺伝子領域、例えばCD3ZおよびFOXP3、CD3+T細胞およびCD4+CD25+調節性T細胞(T-Regs)+にそれぞれ対応する理由から開発された。Wienckeらは、T細胞のエピジェネティックサブタイピングに対する二重液滴PCRの有用性を実証し、フロー活性化細胞選別(FACS)解析6と高い相関を持つ結果を生じる。この定量的遺伝子解析法は、鋳型核酸分子およびPCR試薬を、マイクロ流体によって可能,な油中水乳液を用いて、ゼロ、1つ以上の標的核酸コピーを含む数千個の離散、体積的に定義されたサブナノリットルサイズの液滴に分割することに依存している。PCR増幅は、個々の液滴内で行われ、各液滴のエンドポイント蛍光強度が測定され、サンプル中に存在する標的の絶対定量が可能となる。液滴PCRは、標準のqPCRよりも正確で正確で技術的に簡単なように確立されており、T細胞の臨床評価に適したDNAメチル化ベースの方法となっています。急速に出現するサブタイピング方法論であるものの、様々なメチル化CpG領域を同時に探査するエピジェネティック解析の多重化は欠けている。これは、定期的な白血球の差動度数に必要です。

本明細書において、熱可塑性エラストマー(TPE)液滴微小流体装置が提示され、メチル化特異的多重液滴PCR(mdPCR)に用いられた。この技術は、細胞系DNAメチル化パターン、すなわちCD3ZおよびFOXP3 CpG領域のエピジェネティック変異に基づいて、特定の白血球サブタイプ、CD3+T細胞およびCD4+CD25+T-Regsをそれぞれ説明するために使用されてきた。+ +DNA抽出、亜硫酸水素変換およびmdPCRのための詳細なプロトコルは、TPE液滴生成装置の製造方法と協調して説明される。この方法の代表的な結果は、提案されたアプローチの有用性を強調する免疫蛍光染色のものと比較される。

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プロトコル

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ヒトサンプルを含むこの研究で行われたすべての実験は、NRCの倫理委員会によって承認され、適用される研究ガイドラインに従い、カナダのケベック州の法律に準拠している人間の被験者を支配するNRCの方針に従って行われました。

1. 細胞の調製

  1. 凍結したヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、凍結した凍結した血液単核細胞(PBMC)を、水浴中に凍結槽を5分間37°Cで置いてすぐに解凍する。
  2. 細胞を穏やかに再懸濁し、1 mLピペットを使用して細胞懸濁液を15 mL円錐形チューブに移すために、2回クライオビアルを反転させます。







    11. figure-protocol-1

    12. figure-protocol-2

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結果

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TPEベースのマイクロ流体液滴発生装置は、図1に示すように記載されたプロトコルを用いて製造した。透明マスクをフォトリソグラフィに使用し、シリコン(Si)マスターを得る。柔らかいリソグラフィは、次いでエポキシ型を製造するために使用されたSiマスターの逆PDMSレプリカを得るために行った。エポキシ前駆体をPDMS上に注ぎ、架橋して硬化させた。この金型は、Siマスターの正確なレプリカを表す、熱エンボスを使用して熱可塑性のその後の熱成形のためにより弾力性があった。エポキシモールドが得られると、熱可塑性エラストマーをエンボス加工した。エンボス加工の後、TPEは解体され、デバイスは切断されました。平らなTPEの基質は装置を密封するために使用された。上部カバーに穴を開け、2つの基板を接着した。最後に、世界とチップの接続に必要なチューブが挿入され、デバイスが使用できる状態になりました。製造されたマスター金型、TPE材料およびエンボス加工装置のサンプル画像を図2に示します。チューブインターコネクトを備えた組み立てられた装置は、一対の独立...

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ディスカッション

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提示された実験的なプロトコルおよび方法は作られたTPEの液滴発生器、熱サイクラーおよび蛍光顕微鏡を使用して社内mdPCRを可能にする。柔らかいTPEからTPEへの結合を使用して製造された装置は、最終的な装置が液滴発生器としてその後使用するために表面処理を必要としないように、すべてのチャネル壁にわたって均一である疎水性表面特性を与える。この材料は、高スループット製造,,9、10、11、12、1310,11との互換性を必要とするポイント・9オブ・ケア・プラットフォームで日常的に採用されています。1213また、光学的にも明瞭で、可視スペクトルにおける低蛍光の背景を示し、mdPCRを使用した完全なサンプル対回答ワークフローの将来の統合に魅力的な特徴です。PCR試薬のレシピは、ファシリティ多重化遺伝子の定量を可能にする自家製...

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開示事項

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宣言する競合はありません。

謝辞

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著者らは、カナダ国立研究評議会からの財政的支援を認めている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Bio-Rad, Mississauga, ON TFI0201PCR tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA008-FluoroSurfactantFluoro-Surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, UKEMCCD camera
Thermo Fisher Scientific, Waltham,MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA22-8425-71
CellProfiler蛍光画像解析
ニコン, 日本10倍対物レンズ
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAPCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)p/n 200-U1
フィッシャー、カナダ
Vitrocom、ニュージャージー州、米国5015 および 5010ホウケイ酸キャピラリーチューブ
(http://definetherain.org.uk/)
浜松、日本LC-L1V5DEL UV 光源
ドロマイト3200063使い捨て流体チューブ
ドロマイト3200302使い捨て流体チューブ
IDT、コーラルビル、アイオワ
州ニコン、メルビル、ニューヨーク立光学顕微鏡
Cytec Industries、ウッドランドパーク、ニュージャージー
州 EV Group、Schärding, Austria
Zymo Research, Irvine, CAD5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, SwitzerlandSU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germany
Image J液滴径
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA広域スペクトルLED蛍光灯
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QCDE1010
Hexpol TPE, & Aring;エムアリング;l, Sweden熱可塑性エラストマー(TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA13-400-518
Nikon, Japan画像取得
3M, St Paul, MNCarrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAR37605青色蛍光生細胞染色(DAPI)
IDEXヘルス&科学、オークハーバー、WAP-881 PEEKフィッティング
Sigma-Aldrich、オークビル、オンタリオ州806552
ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州
ThinkyUSA、CA、USAARV 310
IHC world、メリーランド州、米国IW-125-0
Zinsser NA、ノースリッジ、CA2607808
Cetoni GmbH、コルビュッセン、ドイツ
Sigma-Aldrich、オークビル、オンタリオ州484431
Bio-Rad、ミシサガ、オンタリオ州1861096
日立ハイテクノロジーズ、ミシサガ、オンタリオ州
ニコン、メルビル、ニューヨーク倒立顕微鏡
ニコン、日本
ロックタイトAAの352
に使用州直203603の評価に使用に使用

参考文献

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  1. Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
  2. Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
  3. Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
  4. Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
  5. Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  6. Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
  7. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  8. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  9. Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
  10. Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
  11. Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
  12. Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
  13. Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).

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