一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

Summary

このプロトコルは、一次神経細胞培養におけるタンパク質の共局在化を研究するために超解像顕微鏡を採用する方法を示す。

Abstract

シナプスはニューロンの機能要素であり、その欠陥または損失はいくつかの神経変性疾患および神経疾患の基礎にある。画像化研究は、生理学的および病理学的状態におけるその機能および可塑性を調べるのに広く使用されている。タンパク質のサイズと構造のため、タンパク質のローカリゼーション研究には高解像度イメージング技術が必要です。本プロトコルでは、構造化された照明顕微鏡(SIM)を用いて、シナプスマーカーを用いた標的タンパク質のシナプスマーカーとの共局在化を一次ニューロンで研究する手順を説明する。SIMは、広視野顕微鏡の空間分解能を2倍にするパターン光照明技術で、約100nmのディテールに達します。このプロトコルは、堅牢な共局化研究に必要な制御と設定、およびイメージングデータを適切に分析するための統計的手法の概要を示します。

Introduction

シナプスの理解と見解は、フォスターとシェリントンによる1897年の最初の記述以来、大きく変わりました^。それ以来、神経伝達の知識とその背後にある分子プロセスは指数関数的に^{成長しました 2}.シナプスは、2コンパートメントシステムとして考えることができることが明らかになりました:神経伝達物質の放出のための小胞を含むシナプス前コンパートメントと受容体³を有するシナプス後コンパートメント。この単純な見解は、過去20年間で、トランスミッタ結合をシグナル4に変換するために必要なタンパク質の複雑なネットワークに^{進化した。}

理解の利益は、シナプスの次元に合わせて従来の光顕微鏡の回折限界を克服した超解像技術による部分⁵⁶5、6、7、8、9、10。^,7,8,9,10,回折限界のため、光学顕微鏡は横^11,12,12を超える解像度に達することができない。この限界を回避するために、異なるアプローチを使用して、異なる回折限界解像度に達する超解像技術が作成されました:SIM、STED(刺激放出枯渇顕微鏡)、PALM(光活性化局在化顕微鏡)およびSTORM(確率的光学再構成顕微鏡^{)13、14。13,}SIMは、励起ビーム経路¹⁵に回折格子を挿入することにより、レーザーベースの広視野顕微鏡システムの空間分解能を倍増する。可動格子は、レーザービームを回折して、既知の照明パターン(通常はストライプ)を作成します。この意図的に構成された光パターンは、蛍光色素(試料の)の未知の空間分布に重ね合わされる。2つのパターンによって形成された干渉縞は、通常の広視野顕微鏡法で区別できない細かい細部を符号化する。最終的な超解決画像は、回折格子の移動と回転によって得られた同じサンプルのいくつかの生画像を数学的方法で組み合わせてデコードすることによって得られます。超解決画像の解像度は、側面で100nm、横方向の軸方向で500nm、横方向では^{150nm、3D-SIM16}の軸方向では250nmに達する。¹⁶

シナプスの新しい理解は、シナプス機能障害が発症と進行に大きな役割を果たす多くの神経疾患の観点からさらに重要である^17,,18.アルツハイマー病は、ダウン症、パーキンソン病、プリオン病、てんかん、自閉症スペクトラム障害および脆弱X症候群の中でもシナプス組成物、形態および機能^{19、20、21、22,}の異常に関連している^19,。^21,22

最近では、一連のSUMO特異的抗体を用いて、SIMを用いて、SYNOタンパク質の一次海馬ニューロンにおけるシナプトフィシン前および事後マーカーシナプトフィシンおよびPSD95を超分解能レベル²³で共局在化させた。これにより、ニューロンにおけるSUMOの局在化の生化学的および共焦点的な顕微鏡の証拠を確認することができました。

ここでは、マウス海馬の一次ニューロンにおけるタンパク質の局在を研究するプロトコルについて述べている。同時に、このプロトコルは、異なるタイプの主要な神経細胞培養に適応され得る。

Protocol

1. 主要文化

1. #1.5(0.17 mm)のカバースリップ厚さの客観的要件に一致するチャンバーカバーリップ(イビディμスライド8ウェルまたはNunc Lab-Tekチャンバードカバーグラスなど)における培養マウス海馬主要ニューロン。
2. ポリL-リジン(100 μg/mL)の100 μLのカバースリップをコーティング。
3. 翌日、チャンバー付きのカバーリップを滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で2回洗います。
4. マウスの主要なニューロンを得るために、P1-P4の子犬²³から海馬を分離する。
5. 解剖培地の10mLに解剖カバを配置し(表1)、チューブの底部に沈着させる。
6. 滅菌ピペットを使用して、慎重に解剖培地を取り出し、海馬をチューブの底に邪魔しません。
7. 海馬に培地1(表1)10mLを加え、37°Cで30分間インキュベートします。
8. 滅菌ピペットを使用して、慎重にチューブの底に邪魔されずに海馬を残して、メディア1を除去します。
9. メディア2(表1)10mLを加え、(キャップ付き)遠心管をフードの下に45分間水平に残します。
10. 遠心管を縦に立たせて、組織がチューブの底に落ち着くようにします。
11. 滅菌ピペットを使用して、慎重に遠心管の底に乱れのない海馬を残して、メディア2を除去します。
12. メディア3(表1)の2mLを追加します。
13. p1000ピペットを使用して、濾過された先端を有し、細胞を組織から機械的に解離する。
14. 単離されたニューロンに位置する上清を15 mL遠心分離管に移す。
15. 室温(RT)で300xgで2分間細胞懸濁g液を遠心分離する。
16. 遠心分離後、細胞は遠心分離管の底部に位置する。滅菌ピペットを使用して上清を捨てる。
17. 培地4の1mLで細胞を再懸濁する。
18. 70 μm フィルターを使用して、非解シシテアドセルを除去します。
19. ビュルカーチャンバに1 μLの0.4%トリパンブルー溶液を19 μLのセル懸濁液に加えて、生き残った細胞を数えます。
20. プレートセルは、ウェルあたり200 μLの体積で70,000個の細胞/ウェルで行います。
21. 細胞を37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーターに2時間取り付けることを許可₂する。
22. チャンバーカバースリップをインキュベーターから取り出し、培地を200μLの培養メディアに慎重に交換します。
23. チャンバーカバースリップは、37°Cと5%CO2の加湿インキュベーターに残₂します。
24. 培地の3分の1を5~7日ごとに新鮮な培養培地に置き換えます。
25. 海馬の一次ニューロンが完全に成熟するまで待ちます (めっき後 12-14 日) 共局在化研究を行います.

2. 免疫蛍光染色

1. インキュベーターからチャンバーカバーリップを取ります。
2. メディアを取り外します。
3. 200 μL の PBS で素早く井戸を洗います。
4. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBS(200 μL/well)に加えて、すぐにそれらを固定します。
5. RTで15分間細胞をインキュベートする。
6. PFA ソリューションを削除します。
7. 0.2%トリトンX-100(200 μL/well)でPBSを加えて細胞を透過させます。
8. RTで1分間インキュベートします。
9. 溶液を取り除き、PBS(200 μL/well)の1%のウシ血清アルブミン(BSA)をRTで1時間インキュベートし、無関係なタンパク質でプレートのすべての自由結合面を受動的に覆います。トリトンX-100のないBSAベースのブロッキングバッファーは、0.2%Triton X-100と同じバッファよりも効率的に抗体のバックグラウンドを減少させます。
10. ソリューションを削除します。
11. 1%BSAおよび0.2%トリトンX-100(120-200 μL/well、抗体希釈および可用性に応じて)を含むPBS溶液に希釈した一次抗体を追加します。サンプルを2時間インキュベートする。
    1. 陰性対照として、一次抗体を一つのウェルに添加しないでください。異なる標的に対して異なる種の複数の抗体を同時に使用してもよい。鶏で育てられたMAP2(ニューロンマーカー)に対する抗体、マウスで育てられたPSD95またはシナプトフィシンのいずれかに対する抗体、およびウサギで育てられた標的タンパク質に対する抗体を使用する。これにより、3色のSIM解析が可能になります。
12. PBS(200 μL/ウェル)でウェルを3回素早く洗います。
13. 1%BSAおよび0.2%トリトンX-100(200 μL/well)を含むPBS溶液中で希釈した二次抗体(dyLightおよびAlexa二次抗体の両方を使用することができる)を加える。RTで1時間サンプルをインキュベートする。
14. PBS(200 μL/ウェル)でウェルを3回素早く洗います。
15. PBS(200 μL/ウェル)で希釈した濃度1 μg/mLで、核を染色するようHoechst色素を加えます。RTで10分間サンプルをインキュベートします。
16. PBSで2回素早く井戸を洗います。
17. SIM 対応のマウントを使用してセルをマウントします。ProLongガラスアンチフェードマウンタントの10 μL/ウェルを使用してください。
18. カバーグラス(直径8mmの丸いカバーグラスなど)で細胞を覆い保護します。正方形のものも使用できます。
19. チャンバーカバースリップをRTに保管し、画像を取得する前に少なくとも48時間待ちます。ダイヤモンドグラスは、超解像度の買収の前に少なくとも2日間の硬化を必要とします。

3. 抗体特異性制御

注:抗体の特異性を保証するために2つの戦略を使用してください。第1の戦略は、同じ基質を標的とする少なくとも2つの異なる抗体を使用することである。第2の戦略は、抗体を上げるため、精製タンパク質標的またはエピトープを用いたインキュベーションによる抗体中和である。

1. PBSで1%BSAのRTで1時間の組換え標的またはエピトープの5倍の過剰で選択した抗体をインキュベートする。
2. インキュベーション後、上記の2.11から前記のように染色するための通常の濃度で中和抗体を使用する。

4. 顕微鏡キャリブレーション

注:私たちは、超解像研究のためにニコン製N-SIM超解像度顕微鏡システムを日常的に使用しています。しかし、他のいくつかの企業は、カタログに超解像度顕微鏡を提供しています。ニコンのN-SIMシステムの具体的な指示は説明されていますが、後述の手順は他のシステムに一般化することができます。SIM画像を取得する前に、システムは特定のサブ解像度サイズの蛍光ビーズを適切にキャリブレーションする必要があります。例として、テトラスペックの微小球があります。これらのビーズは、1つのサンプルで異なるレーザーのキャリブレーションを可能にするために、異なる蛍光色素で染色されています。

1. 水浴で1.8 x 10^8蛍 光微小球の周りに10分間超音波処理します。ニコンのN-SIMシステムは、キャリブレーションのためにまばらな多色ビーズサンプルを必要とします。これは、サブ解像度サイズの蛍光ビーズの緻密な単層を必要とする他のシステムで異なる可能性があります。蛍光粒子の数を適宜調整します。
2. 蛍光微小球を1:500に二重蒸留水で希釈します。
3. さらに10分間2回目のソニッケートを行います。
4. 希釈されたビーズの15 μLをチャンバーカバースリップの井戸にピペット。
5. 溶液をRTで5分間乾燥させます。
6. 取り付け溶液を10μL加え、8mmのカバースリップを上に置きます。
7. 適切な硬化を可能にするために少なくとも48時間待ってください。
8. 顕微鏡とレーザーをオンにします。
9. システムが温まるすべての顕微鏡コンポーネントの熱平衡に達するようにします。N-SIM超解像度顕微鏡システムは、少なくとも3時間を必要とします。
10. 100x の目標を選択します。
11. レーザーを回折格子ブロックの中心に合わせて調整を開始します。N-SIMシステムでは、マイクロメーターノブと専用カメラを使用して、光線をターゲットにセンタリングできます。
12. チャンバーカバースリップを顕微鏡に挿入して、観察します。客観的な補正カラーを調整することにより、チャンバーカバースリップの厚さにシステムを設定します。NISソフトウェアは、N-SIM超解像度顕微鏡システムで提供される独自のソフトウェアで、補正首輪を調節する自動機能を備えています。
13. 各チャンネルのグレーティングブロックフォーカスを調整して、サンプルに焦点を合わせて構造化されたパターン照明を確保します。NIS ソフトウェアは、このタスクの自動機能を提供します。
14. 次に、多色微小球の生の3D-SIM画像を取得します。生画像を再構成して、生体画像ImageJ²⁴ およびプラグイン^fairSIM25の解析用の顕微鏡ソフトウェアまたはオープンソースソフトウェアプラットフォームを用いて超解決画像を得る。
15. 4.14で得られた超分解画像のフーリエ変換を、分離された波長ごとに計算します。変換された画像が正しい花のようなパターンを得られない場合は、スーパー解像度が達成されていないので、4.11からキャリブレーションを再開します。
16. 超解決イメージでは、1 つのマイクロスフィアを選択し、各チャネルの強度プロファイルを計算して、達成した解像度を測定します。横に 100 nm に近いはずです。
17. 次に、マイクロスフィアのマルチチャンネル集録をオーバーレイしてチャンネル登録を行う。目標は、すべてのチャンネル信号を横に、軸に合致することです。これは異なったチャネルのずれによる色収差を除去し、共局在分析を助ける。
18. オープンソースアプリケーションImageJのためのプラグインのスイートであるSIMcheck²⁶の「照明段階ステップ」と「イルミネーションパターンフォーカス」機能を使用してキャリブレーションの品質を確認します。この最後に、チャンバーカバースリップを準備して、TetraSpeck微小球の密な単層を得て、サンプルの3D-SIM画像を取得します。ImageJで画像を解析し、収差が検出された場合は、ステップ4.11から顕微鏡キャリブレーションを再開します。

5. 取得

1. 共焦点またはワイドフィールドモードで40倍の目的を使用してサンプルの分析を開始します。これにより、サンプルに移動でき、良い詳細と大きな視野を維持できます。
2. MAP2抗体シグナルを使用して、ニューロンプロセスを表す領域を特定します。
3. 共焦点モードでサンプルの画像を取得し、染色の品質を決定します。低い共焦点品質は、低い SIM 品質に反映されるため、サンプルを廃棄する必要があります。
4. 画像の面積と品質が満足できる場合は、目的を100倍に切り替えます。
5. 100xの目的に油を適用します。
6. 超解決イメージの品質を評価するために後で使用されるワイドフィールドまたは共焦点イメージを取得します (図 1A,B)。
7. 3D-SIM モードに切り替えます。
8. ダイアログ ウィンドウを使用して取得するパラメータを設定し、色情報を最大化するために使用可能な最高のビット深度設定を選択します。通常、16 ビットが標準の選択肢です。また、信号対雑音比を向上させるために、1MHzなどの取得に低い周波数値を選択します。
9. ヒストグラムウィンドウを使用して、レーザーパワーを設定して信号の線形応答を得る。情報の損失を避けるため、画像の飽和ピクセルを制限します。N-SIMシステムは、アンドーiXon3カメラを使用しています。16 ビットで作業する場合は、カメラの線形応答を確保するために、目標の強度 16,000 を選択します。または、取得のダイナミックレンジを最大化するために30,000から45,000の範囲を選択します。
10. サンプルを撮影する場合は、レーザーパワーを0.1~50%に設定し、50 ms~2秒の間の露出時間を設定します。50%を超えるレーザーパワーは、使用中の蛍光色素の急速な光の漂白を引き起こす可能性があります。
11. 3D-SIMモードで画像の取得を開始します。
12. SIMcheck、ImageJ用の無料プラグインのスイートを使用して、生画像の取得の品質を評価します。
13. SIMCheck でアーティファクトや品質の問題が検出されない場合は、4 つの技術複製から最低 10 個のイメージを取得して、統計分析を行います。

6. ポストプロダクション:画像再構成

注:3D-SIM取得画像は、再構成された超解決画像を取得するために処理する必要がある生の画像です。生画像の誤った再構成は、サンプルの分析に影響を与えるアーティファクトにつながる可能性があります。したがって、再構成パラメータを適切に選択するには、大きな注意を払う必要があります。

1. 顕微鏡再構成解析ソフトウェアを用いて生画像を処理し、超分解画像を得る(図1C)。あるいは、自由に利用できる ImageJ プラグイン fairSIM を使用して、生のイメージを再構築します。
2. 顕微鏡再構成ソフトウェアまたは ImageJ プラグイン SIMCheck を使用して、超解決画像のフーリエ変換を計算します。良い再構築された画像は、各チャンネルのために、花のような画像を返す必要があります。再構築された画像が花のような形状を再現できない場合は、生の画像から再開し、ウィーナーフィルタリング、アポダイゼーション、ゼロオーダー抑圧²⁷などの再構成パラメータを修正して再構築する。NISソフトウェアでは、パラメータの変更が最終的な解決されたイメージにどのように影響するかを監視するためにプレビューを使用して、パラメータを変更i)照明変調コントラスト、ii)高解像度ノイズ抑制とiii)フォーカスの外抑制。
3. 次に、再構築された画像を分析し、ImageJベースのプラグインNanoJ-SQUIRREL²⁸を使用して、超解決画像の品質を評価することで、アーティファクトを公平に検出します。
4. NanoJ-SQUIRREL がアーティファクトを検出した場合は、生の画像から再起動し、ウィーナー フィルタリング、アポダイゼーション、ゼロ オーダー抑制などの再構築パラメータを変更して再構築します。NIS ソフトウェアでは、プレビューを使用して、パラメータの変更が最終的な解決されたイメージに与える影響を監視し、パラメータ[照明変調コントラスト]、[高解像度ノイズ抑制]、および[焦点外抑制]パラメータを変更します。
5. 超解決画像を使用して、共局在プロファイルおよび/またはピアソンとマンダーの係数を計算します。

7. プロファイル分析との共同ローカリゼーション

注: シナプスマーカーと目的のタンパク質の共同局在化を研究する最初のステップとして、超解決画像を取り、単一の軌跡を分析してシグナルの重複を判断します。

1. 超解決画像上の単一の軌跡を識別します。
2. 対象の軌跡の蛍光シグナルの強度プロファイルを取得します。
3. データをエクスポートします。
4. GraphPad Prism または同様の解析ソフトウェアを使用して、すべての信号ピークを正規化し、各チャネルに対して同等の信号強度を得て、軌跡固有の共局在化を決定するという最終目標を達成します。

8. ピアソンとマンダーの係数の定量化

注:プロファイル分析で単一の遺伝子座の共局在化が示唆されている場合、PearsonとManderの係数^29,30,30を計算することで、画像全体のより一般的な分析を行うことができます。

1. 共ローカライズの 2 つのパラメーターを決定するには、ImageJ プラグインである JACoP³¹を使用します: ピアソンとマンダーの。

9. 統計分析

1. JACoP で収集されたデータを処理するには、GraphPad プリズム(または同様の分析およびグラフ作成ソフトウェア)を使用します。
2. グラフを取得し、統計的関連性を得るために分析した各条件に少なくとも 40 SIM イメージを使用します。

Results

ここでは、神経タンパク質の共局在化を研究するための標準的なワークフローを紹介します。まず顕微鏡を校正し、次にサンプルのSIM分析を行いました。システムの較正のために、直径0.1μmの蛍光微小球を用いた。ビーズの超解決 3D-SIM 画像を取得すると、基になる画像データはフーリエ変換されて空間周波数表現に変換されます。 図2Aでは、明確な花のパターンは、超解像度の詳細レベルの指標として提示されています。次に、単一のビーズの強度プロファイルのピークの半分の最大値(FWHM)で全幅を計算することによって達成される解像度を測定しました(図2B,C)。最後に、蛍光微小球を使用して、チャネル登録による色収差を修正しました(図3A,B)。次に、100xの目的でサンプルの解析を開始し、3D-SIM画像を取得しました。SIMCheckを使用して、取得時のフィールド照明や運動の均一性を評価しました(

Discussion

シナプスの構造と組成を解明することは、記憶と認知を調節する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要である。正常な状態にある間、シナプスは記憶の構成要素であり、アルツハイマー病³²のような複雑な神経疾患の根源でもある。ここで説明するプロトコルは、SIMと呼ばれる超解像顕微鏡技術を用いて神経タンパク質の共局在化を研究するのに役立つ。特定の照明パターンを使用して、SIMは、通常0.03〜0.15μmの間で測定するシナプスの研究に適した約0.1μmの解像度に達することができます。さらに詳細には、STED(刺激放出枯渇顕微鏡)、PALM(光活性化局在化顕微鏡)またはSTORM(確率的光学再構成顕微鏡)などの他の超解像技術を、10〜20nmの分解能に達することができる^、33を適用してもよい。

ここでは、一次ニューロンにおけるシナプスマーカーを用いた標的タンパク質の共局在化の分析について述べている。このプロトコルは、海馬、小脳、皮質ニューロンなどの神経細胞の任意の一次培養、さらには腸神経系ニ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4%トリパンブルー溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061	ケミカル
70 & マイクロ;mフィルター	コーニング	352350
Equiment Alexa	Thermo Fisher	Scientific-Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	抗体
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	メルク	5470	ケミカル
CaCl2	メルク ライフサイエンス	21115	ケミカル
チャンバー カバースリップ	同上	80826	Equiment
DyLight	サーモフィッシャー サイエンティフィ	ック抗体
FBS (ハイクロン)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	血清
FluoSpheresカルボン酸修飾マイクロスフェア、0.1 μメートル、黄色–緑色	蛍光 サーモフィッシャーサイエンティフィック	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	メルクライフサイエンス	C6852-25g	化学
MAP2	メルク	AB15452	抗体
MEM	ライフテクノロジー	21575022	中
MgCl	メルク ライフサイエンス	M8266	化学
NaOH	VWR 国際	1,091,371,000	化学
神経基礎 A	ライフテクノロジー	ズ 10888022	中
N-SIM 超解像顕微鏡	ニコン	イン	スツルメント
パパイン	メルク ライフサイエンス	P-3125	化学
パラホルムアルデヒド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28908	ケミカル
ペン/溶連菌 10x	Life Technologies	15140122	化学
リン酸塩緩衝生理食塩水	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L リジン	Sigma	P2636	ケミカル
ProLong ダイヤモンド ガラス 退色防止剤	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	抗体
丸型カバーガラス	サーモ	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	抗体
シナプトフィジン	メルク	S5768	抗体
トリトンX-100	メルク	T8787	ケミカル
トリプシン阻害剤	メルクライフサイエンス	T9003-500MG	ケミカル