フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

Summary

このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。

Abstract

増加する証拠は、神経免疫相互作用がホメオスタティックおよび病理状態の神経系機能に影響を与えるという仮説を裏付ける。主要な組織適合性複合体クラスI(MHCI)の十分に研究された機能は、特に感染に応答して、適応免疫系への細胞由来ペプチドの提示である。最近では、ニューロン上のMHCI分子の発現が、正常な発達および神経障害の間のシナプス結合性における活性依存性の変化を調節できることが示されている。脳の健康にこれらの機能の重要性は、ニューロンのMHCI発現を容易に検出する高感度アッセイの必要性をサポートしています。ここでは、マウス海馬ニューロンの一次培養法と、フローサイトメトリック解析によるMHCI発現評価の方法について説明する。マウス海馬は、胚性18日目に出生前マウスの子犬から微小化される。組織は、酵素的および機械的手法を用いて単一細胞懸濁液に解離され、次いで非神経細胞の増殖を制限する無血清培地で培養される。インビトロで7日後、MHCI発現は、βインターフェロンで薬理学的に培養細胞を処理することによって刺激される。MHCI分子は蛍光タグ付き抗体をその時に標識し、次いで細胞が非酵素的に単一細胞懸濁液に解離される。神経細胞の同一性を確認するために、細胞はパラホルムアルデヒドで固定され、透過し、ニューロン核抗原NeuNを認識する蛍光タグ付き抗体で標識されます。MHCI発現は、次いで、フローサイトメトリック解析によってニューロン上で定量化される。神経細胞培養は、特定の仮説をテストするための遺伝子組み換えまたは薬理学的介入によって容易に操作することができる。わずかな変更を加えれば、これらの方法は、他の神経集団を培養したり、関心のある他のタンパク質の発現を評価するために使用することができる。

Introduction

中枢神経系(CNS)はかつて「免疫特権^1」と呼ばれる免疫監視を欠いていると考えられていた。この特権は免疫成分の絶対的な欠如に相当するのではなく、免疫病理学に関連する損傷を制限する特殊な規制を意味することが明らか^である。実際、CNSと免疫系との間のコミュニケーションは、健康な脳の発達と感染症への応答のために必要な継続的な会話^{である2,3。}

主要な組織適合性複合体クラスI(MHCI)分子は、感染時に^CD8+T細胞に抗原ペプチドを提示する機能について最もよく知られている多形および多形の膜貫通タンパク質^{である4。}従来のMHCI複合体は、膜貫通α鎖とβ2マイクログロブリンと呼ばれる細胞外軽鎖から構成されています。α鎖は、プレゼンテーション⁵のために抗原ペプチドを結合する多形の溝を含む。細胞外膜上でのMHCIの適切な発現は、高親和性ペプチドリガンド⁵のローディングと共にα鎖およびβ2-ミクログロブリンの適切な折り畳みを確保するために、小胞体における分子シャペロンの協調作用を必要とする。MHCI複合体が組み立てられるのは一度だけ、小胞体から形質膜⁶にエクスポートされる。ペプチドを含んだMHCI複合体を伴う同結合性T細胞受容体の関与の際^、CD8+T細胞は、パーフォリンおよび顆粒体を含むリティック顆粒を放出することによって細胞殺死を仲介するか、または標的細胞膜⁷上のFas受容体を結合することによってアポトーシスを誘導する。さらに^、CD8+T細胞は、ガンマインターフェロン(IFNγ)や腫瘍壊死因子α(TNFα)などのサイトカインを産生し、細胞変性作用を伴わない感染細胞における抗ウイルス機構を活性化することができる^8,9。多くの神経刺激性ウイルスの場合、CD8⁺ T細胞はCNS^10、11、12から感染をクリアする必要があります。

ニューロンは、損傷、ウイルス感染、またはインビトロサイトカイン刺激の条件下でのみMHCIを発現すると以前考えられていた。近年、研究はシナプスリモデリングおよび可塑性^13,14におけるMHCIの神経発現に対する役割を同定した。シナプス調節の基礎となる正確なメカニズムはよく理解されていないが、データはMHCI発現レベルがシナプス活性^15、16によって調節されることを示す。一つの仮説は、ニューロンが対の免疫グロブリン様受容体B(PirB)を予離的に発現することを示唆し、これはMHCIを経経的に結合する^13,17である。この相互作用は、シナプスリモデリングに関与する経路に反対するPirBによるシグナル伝達カスケードを開始し、シナプス接続^17、18、19を強化および安定化させる。神経活性がない場合、MHCI発現は¹⁴減少し、MHCIの消失はシナプスの消失不良と誤ったシナプス回路^20,21をもたらす。

ここで説明したアッセイは、シュヴァリエら⁹から適応したもので、フローサイトメトリック分析を用いて、マウス海馬ニューロンの一次培養物に対するMHCIの細胞外タンパク質発現を定量的に評価する。このプロトコルは、胚性マウスの子犬から海馬組織をマイクロディスセクトするための初期技術を示している。次に、組織を単一細胞懸濁液に酵素的および機械的に解離するプロセスと、培養をインビトロで維持するための方法について詳述する。 分裂しないため、培養後、ニューロンは実験エンドポイントに適した皿と密度にメッキする必要があります。次に、βインターフェロン(IFNβ)によるMHCI発現を誘導するステップ、MHCIおよび神経核マーカーNeuNの免疫標識、およびフローサイトメトリーによる細胞の分析を行うためのステップを概説する。最後に、MHCI陽性ニューロンを同定し、MHCI発現のレベルを定量化するためのフローサイトメトリーデータを評価する手順について説明する。また、このプロトコルで注目されているのは、海馬ニューロンに加えて、または代わりに皮質ニューロンを培養するために行うことができる小さな調整である。このプロトコルは、遺伝的変異または薬理学的治療を用いて特定の仮説をテストするために容易に変更することができる。

Protocol

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に従って行われました。この議定書は、ノースカロライナ大学シャーロット制度動物の世話と使用委員会(プロトコル#19-020)によって承認されました。

1. 文化の準備

注:これらの手順は、組織培養指定のバイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行う必要があります。メディアとソリューションについては 、表 1 を参照してください。

1. 自己シール滅菌袋でオートクレーブすることにより、すべての解剖ツールを殺菌します。
2. 12ウェルの文化料理を扱うためのポリD-リジンの作業ストックを準備します。
   1. ポリD-リジンを1xホウ酸バッファーに100 μg/mL(10x濃縮)の濃度に溶解します。必要になるまで-20°Cで約1mLのアリコートを保管してください。
   2. 10倍濃縮ポリD-リジンをdPBSで10μg/mL(1x)に希釈し、フィルター滅菌します。
   3. 12ウェル培養プレートを、1xポリD-リジンのウェルあたり0.5 mLで、室温で少なくとも1時間または翌日に使用するために一晩治療します。ポリD-リジンの体積が培養領域の底部を完全に覆うのに十分であることを確認してください。
   4. 使用の直前に、培養プレートからポリD-リジンを取り除き、滅菌水で3倍すすいで、細胞をプレートする準備ができるまで滅菌水に入れます。めっき細胞の前に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を除去する。
3. ニューロン成長培地とFACSバッファを準備します。フィルターは滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。ニューロン成長培地は約2 wksのために保つことができます。FACS バッファは約 4 wk のために保つことができます。

2. 胚海馬の解剖

注:この手順は、海馬の髄液および微細解剖の除去のためのステレオ顕微鏡の使用を必要とするため、ベンチトップで行うことができます。潜在的な汚染を最小限に抑えるために厳格な無菌技術に従います。

1. CO2チャンバーの胚性18日目に、時を超えた妊娠C57BL/6Jメスマウスを安楽死させる。
2. 腹部の皮膚と毛皮に70%のEtOHをスプレーし、組織鉗子で皮膚をつまみ、外科用ハサミで小さな切開を行います。腹部を切開して内臓と子宮を露出させる。
3. 標準的なパターン鉗子で子宮をつかみ、空洞から持ち上げ、細かいはさみでメソムトリウムへの接続を切断します。胚を含む子宮を氷の上に置かれた100mmの無菌プラスチック培養皿に移す。
4. 細かいはさみと細かい鉗子を使用して、慎重に子宮を切断し、胚嚢を取り除いて胚を放出する。氷の上に置かれたdPBSを含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に胚を移す。
5. 細かいはさみを使用して胚の子犬を切断し、氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に頭を移す。
6. 脳を取り除くために、片手に細かい鉗子を持って頭を持つ。一方、湾曲したデュモン#7鉗子を使用して、頭蓋骨の基部に鉗子の先端を挿入し、脳を突き刺すことなく、正中線に沿って前に動く骨と上の皮膚をつまみます。
7. 湾曲した鉗子を使用すると、皮膚と頭蓋骨を引き離して脳を露出させます。露出した嗅球から小脳まで脳の下の湾曲した鉗子を掃いて、頭蓋骨から脳を持ち上げます。氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100ミリメートルの無菌プラスチック培養皿に脳を移す。各脳について繰り返します。
   注: 実験に特化した目的で別々にする必要がない限り、すべての脳を単一の培養皿に集めてもよい。
8. ステレオ解剖顕微鏡の下で、一度に1つの脳と2組の無菌デュモン#5鉗子で働き、嗅球をつまんで髄を引き離します。髄液の徹底除去は、他の細胞による培養汚染を避け、さらなる解剖を可能にするために必要である。
9. 髄液が適切に除去されると、皮質の上側が横に開き、海馬を露出させる。デュモン#5鉗子を使用して、付属の皮質から海馬をつまみ、氷の上に5mLのHibernate-E培地を含む無菌15 mL円錐管に隔離された海馬を慎重に移す。
10. 各胚性マウスの子犬の両方の脳半球の解剖を繰り返し、実験固有の目的のために別々に必要でない限り、すべての海馬を単一の15 mL円錐形チューブに組み合わせる。
    1. 皮質ニューロンを培養するために、皮質は皮質下皮質から分離され、海馬ニューロンと同じように処理され得る。
       注: この時点で、プロトコルが一時停止する可能性があります。B27を補充したハイベルネートE培地の脳または解剖カバピを保存する(2%)4 °Cで最大1ヶ月間、延長遅延は生存細胞の数を損なう可能性がある。

3. 海馬ニューロンの解離と培養

注:すべての手順は、組織培養指定バイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行われるべきです。

1. 海馬解離のために胚当たり0.5mLのパパイン解離液を調製する。解離に必要な解離液の量は、解剖される胚脳の数によって異なります。
   注:皮質ニューロン培養の場合、1胚あたり1.0 mLのパパイン溶液を調製してください。
   1. ハイバネートE培地の1mL当たり20μLのパパイン懸濁液を約3分間ボルテックスで溶解します。
   2. パパインが溶解した後、溶液の1 mLあたり1μLのDNase Iを加えます。これは酵素を失活させることができるので、DNase Iが添加された後に溶液を渦出しないでください。
2. 遠心分離機15 mL海馬組織を含む円錐管(ステップ2.10)で1,000xgで5分間。 上清を取り除き、パパイン溶液を加えます。数回反転して組織を再中断します。37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに組織を再懸濁させる。
   1. 皮質ニューロンを培養する場合は、すべての皮質を新しい100mm滅菌培養皿に移し、プレートから慎重に吸引し、細かいはさみやカミソリの刃を持つミンチ組織を作ります。培養皿にパパイン溶液を加え、無菌移動ピペットを用いて15 mL円錐管にパパイン溶液を用いて皮質組織を移管する。37°Cで30分間、組織と酵素溶液をインキュベートし、10分ごとに攪拌する。
3. 30分間のインキュベーション中に、3つの火で磨かれたガラスのパスツールピペットを準備してください:1完全に開いて、1半分開いて、そして1四分の一開き。
4. 30分インキュベーション後、消化された脳組織を含む15 mL円錐管を10分間 125xg で遠心分離する。酵素溶液を取り除き、新鮮なハイベルネートE培地の等量に置き換えます。
5. 完全に開いたパスツールピペットを使用して、組織を10倍にトリチュレートする。組織を2分間落ち着かせ、その後、上清細胞懸濁液を滅菌50 mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。
6. 半分開いたパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前工程と同じ50mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。
7. 四半期オープンパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前のステップと同じ50 mL円錐形に再び移します。解ciaしていない残りの組織を捨てます。
8. 遠心分離機は、細胞懸濁液からの上清を含む50mLの円錐管を 125xg で5分間用いた。まだ行われていない場合は、滅菌水でポリD-リジンコーティングされたプレートを洗浄し、遠心分離中に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を取り除きます。
9. 遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットをニューロン成長培地の5 mLで再懸濁します。トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して生細胞を数えます。
   1. 皮質ニューロンを培養する場合, 少ない密度の細胞とより正確なカウントのためのニューロン成長培地の少なくとも 10 mL を追加.
10. ニューロン成長培地を用いた細胞を希釈し、1ml当たり5 x 10^5個の生存細胞の最終的なめっき密度を実現し、12ウェルプレートの各ウェルに希釈細胞懸濁液1mLを加えます。5%CO2で37°Cでニューロンを維持する。
    注:典型的には、1胚マウス脳からの海馬、すなわち、2海馬は、約1 x 10⁶ 生存細胞を生み出す。この数値は実験計画目的でのみ提供され、各培養のセル数の代替と見なされるべきではありません。
11. 培養後の翌日に培養後の培地の半分を取り除き、すなわち0.5mL、培養細胞を破壊しないようにウェルの側面に等量の新鮮な培地を加えて培養した。文化の寿命に対して、週2回の半分のメディア変更を完了します。

4. フローサイトメトリーによるMHCI発現の評価

1. インターフェロンβ(IFNβ)またはニューロン成長培地中の希釈剤の等量を希釈することによって治療を準備する。培地交換は半量変化となるため、2倍濃縮IFNβで処理培地を用意する。すなわち、12ウェルプレートの3つのウェルを100 U/mLのIFNβで処理し、培地処理コントロール用に200 U/mL IFNβまたは同量のIFNβと等量のIFNβを1.5mL調製する。
2. ニューロンの各ウェルから0.5 mLを除去し、各ウェルにIFNβの有無にかかわらず、ニューロン成長培地の0.5 mLを追加します。実験条件およびシグナル最適化に応じて、通常の成長条件(37°C、5%CO2)で6-72時間インキュベートします。
3. 治療時間の後、すべての培養培地を取り除き、サプリメントを欠いた冷たい神経基底培地(B27、L-グルタミン、ペンストレップ)で1回静かに洗います。
4. 1 μg/mLのFcブロックを含む非補製の冷たいニューロ基底培地を0.5 mL、各ウェルに1μg/mLの蛍光共役抗MHCI抗体を加えます。4°Cで45分間光から保護。
5. 抗体含有培地を取り除き、冷たいdPBSで一度丁寧に洗浄してください。各ウェルに0.5 mLの室温酵素フリー細胞解離バッファーを加え、攪拌して細胞を取り除きます。逆組織培養顕微鏡を使用して解離を監視します。
6. 細胞が培養皿から切り離されたら、各ウェルに0.5mLのFACSバッファーを加え、細胞をトリチュレートして塊を分散させ、各ウェルの総体積を個々の1.7 mLマイクロ遠心分離管に移します。
7. 遠心分離機 1,000 x g 5分間上清を取り除き、FACSバッファーの100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、各チューブの総体積を96ウェルUボトムプレートの個々のウェルに移します。
8. 各ウェルに100μLの固定化試薬を加えます。細胞が凝集するのを避けるために数回トリチュレートし、光から保護された室温で15分間インキュベートします。
9. 500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り外し、FACSバッファの200 μlで再中断します。
10. 500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り除き、蛍光共役抗NeuN抗体(1:100希釈)を各ウェルに含むパーメアビライズ試薬を100μLで再懸濁します。よく混ぜ、光から保護された室温で20分間揺れ動きます。
11. インキュベーション後、500xgで5分間遠心分離機を使用する。上清を取り外し、FACSバッファの100 μLで再中断します。2x を繰り返します。
12. 最終洗浄後、FACSバッファーで希釈した2%パラホルムアルデヒドの100 μLで細胞を再懸濁します。細胞が凝集するのを防ぐためによく混ぜます。フローサイトメーターで読み取る準備ができるまで、光から保護された4°Cで保管してください。1週間以内に、できるだけ早くサンプルを読んでください。

5. データの定量化と評価

1. 各蛍光色素の補償制御を測定し、スペクトルの重複を補正します。理想的な補償制御には、染色されていない培養ニューロン、抗MHCIのみで染色され、抗NeuNのみで染色されたニューロンが含まれます。
2. 可能であれば、各サンプル (少なくとも 10,000) に対して 100,000 個のイベントを記録し、FCS ファイルとして保存します。
3. 適切な解析ソフトウェアを使用してデータを分析するには、 図1A-C に示すように、NeuN-陽性ニューロンを選択するシーケンシャルゲートを設定します。
   1. SSC-A (ログ) と FSC-A (線形) をプロットします。細胞集団(P1)にゲートを描画し、細胞の破片を分析から排除します。
   2. P1細胞集団内で、FSC-H(線形)対FSC-A(線形)をプロットします。単一セルの母集団にゲートを描画します。
   3. 単一セルの母集団内で、SSC-A (ログ) と NeuN (ログ) をプロットします。NeuN陽性集団に、染色されていない細胞またはMHCIのみの染色された細胞をガイドとして使用してゲートを描画します。
   4. Y軸上でモードに正規化された細胞イベントを用いてMHCI蛍光のヒストグラムをプロットする。染色されていないまたはNeuNのみの染色されたニューロンをガイドとして使用して、水平ゲートを描き、MHCIに陽性のニューロンパーセントを定量化する。
   5. 統計評価およびグラフ描画のために、MHCIに陽性のパーセント細胞と、NeuN陽性集団のMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)をエクスポートします。

Results

ここで提示された手順を用いて、海馬組織は胚18日目に出生前マウスの子犬から解剖された。組織を酵素的および機械的方法を用いて単一細胞懸濁液に解光し、次いでポリD-リジンで前処理した12のウェルプレートで培養した。インビトロで7日後、細胞は、MHCIの発現を刺激した72時間だけ、IFNβまたは培地の100 U/mLで処理した。ニューロンは、単一の細胞懸濁液に非酵素的に解離される前に、MHCIのSituに染色された。ニューロンを固定し、透過し、次にニューロン核マーカーNeuNについて細胞内染色した。サンプルをフローサイトメトリーで評価し、関連ソフトウェアを用いてデータを分析した。ニューロンは、細胞の破片およびダブレットを除外する全事象の逐次的な格言によって同定された(図1A,B)。ニューロンはNeuN陽性によって決定的に同定された(図1C)。^NeuN+細胞は、Y軸上のモードに正規化された細胞数とX軸上のMHCI蛍光を用いてヒストグラム上の細胞をプロットすることによって、MHCI陽性性についてさらに分析した。正と負のピークが発散する点でMHCI⁺ゲートが描画されました (図 1D)。このことから、MHCI染色に陽性のニューロンパーセント(図1E)および中央値蛍光強度(MFI;図1F)が計算された。結果は、MFIが示すように、IFNβ治療がMHCIの細胞外染色に陽性のニューロンの割合と発現レベルを有意に上方制御したことを示している。統計分析とグラフィカル表現は、市販の統計ソフトウェアを使用して行われました。

図1:代表的な格言戦略とMHCI定量化。
一次海馬ニューロンは、IFNβまたは培地のみの100 U/mLで治療した。72時間後、ニューロンは太平洋ブルー共役MHCI(1μg/mL H2-K^b)で細胞外染色され、次いでPE共役NeuN(1:100希釈)で細胞内標識した。細胞蛍光をフローサイトメトリーで評価し、データを分析した。(A)合計事象はSSC-A(対FSC-A)対FSC-A(線形)としてプロットされ、細胞(P1)は破片を除外するためにゲートされた。(B) P1集団内で、細胞をFSC-H(線形)対FSC-A(線形)としてプロットし、単一細胞集団をゲートした。(C) 単一細胞母集団内で、セルを NeuN-PE (ログ) に対して SSC-A (ログ) にプロットした。^NeuN+細胞は、ニューロンを同定するためにゲート付けされた。(D) ニューロンの集団の中で、細胞をx軸上にMHCI-PacBluを持つヒストグラムにプロットし、y軸上で細胞番号をモードに正規化した。MHCI染色に陽性のニューロンの割合を定量化するために水平ゲートを描いた。(E) 培地中のNeuN+細胞の^MHCI+パーセントの定量化およびIFNβ処理ニューロンのみ。(F)培地中の^NeuN+細胞に対するMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)の定量化(黒)およびIFNβ処理(赤)ニューロン。統計的有意性は、非対t検定によって計算された。**,P < 0.01.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ニューロン成長培地 (50 ml)
試薬	最終濃度	ストック濃度	50mlの場合
B27 サプリメント	2%	100%	1.0 ml
L-グルタミン	2 mM	200 mM	0.5 ml
ペニシリンストレプトマイシン	100 U/ml	10,000 U/ml	0.5 ml
神経基底培地			48.0 ml
FACS バッファー (500 ml)
試薬	最終濃度	ストック濃度	500mlの場合
胎児牛血清	2%	100%	10ml
エドタ	1 mM	500 mM	1ml
dPBS			489 ml
パパイン解離解液
試薬	最終濃度	ストック濃度	1mlの場合
パパインサスペンション	20 U/ml	1000 U/ml	0.020 ml
DNase I	2.5 U/ml	2500 U/ml	0.001 ml
ハイバーネート-E			1.0 ml
注:パパイン解離解液の必要量は、解剖される胚脳の数によって異なります。海馬ニューロンの脳あたり0.5 ml、皮質ニューロンの脳あたり1.0 mlを準備します。
注:Hibernate-Eで約3分間、パパイン懸濁液をボルテックスして解離液を調製してください。パパインが完全に溶解した後、DNase Iを加えます。渦を起じないでください。

表1:メディアとソリューション

Discussion

このプロトコルは、胚性18日目の出生前マウスの子犬からの主要な海馬ニューロンの解剖および培養を記述する。げっ歯類から培養された主要なニューロンの使用は、現代の神経生物学²²で開発された最も基本的な方法論の1つである。不死化細胞株はニューロンの特定の側面をモデル化することができるが、腫瘍由来細胞としての性質、定義された軸索を発達させなかったこと、および細胞分裂を継続することは、生体内²³における非実在性ニューロンの特性を忠実に再現するかどうか疑問を提起する。一次ニューロンに代わるもう一つの選択肢は、ヒト誘導多能性幹細胞(HiPSC)の使用である。HiPSCを使用する技術、特に患者由来の技術は、近年急速に進歩しています²⁴.しかしながら、細胞株間の変動性、機能的成熟度の欠如、エピジェネティックプロファイル²⁵の違いなど、HiPSCの取り扱いにはまだ限界がある。一次げっ歯類ニューロンの還元モデルを扱うには制限もありますが、培養ニューロンは生体内のニューロンのポストミトティックな性質を保持します。また、マウスに利用可能な広範な分子生物学ツールと遺伝子組み換えは、多くの用途でHiPSCよりも主要なニューロンの使用を好み、マウス研究は実験的な遺伝的システムを失うことなく、より複雑な生体内生物に簡単に翻訳することができます。これらの理由から, 多くの研究者は、主要なげっ歯類のニューロンを使用して、 主要な側面を検証します, ない場合は、バルク, 彼らの研究の.

あるアッセイの場合、ニューロンは脳ex vivoからの分離に続いて直接分析され得る。 これは特に、特定の実験条件に従うことができる、または複数の細胞タイプの相互作用に依存する可能性のある成体マウスを含む実験に対して望ましい。ただし、実行できる分析の種類を制限するいくつかの問題があります。ニューロンは一意に相互接続され、ミエリン²⁶によって包まれているため、成体マウスの脳からニューロンの単一の細胞懸濁液を準備することは技術的に困難です。組織トリアーションの非酵素的方法は、組織を解離して細胞死を引き起こす際には非効率的であり、一方、酵素製剤はしばしば細胞表面抗原²⁷を切断する。さらに、ミエリンは、胚性マウスからはほとんど存在しないが、それは、成人の脳の約20%を含み、そして生細胞の分離および妨げる流れのサイトメトリー分析²⁸を損なう可能性がある。開発された技術の多くは、最終的に細胞質のニューロンを取り除き、主に核²⁹からなる小さな丸みを帯びた細胞体を残す。これは一部の分析では許容されますが、細胞質や細胞外タンパク質の発現を定量化するには適していません。さらに、還元細胞培養システムは、in vivoシステムで頻繁に可能であるよりも短い時間スケールで特定の機械学的な質問をテストすることができます。

また、このプロトコルでは、IFNβを用いてMHCI発現を薬理学的に刺激する方法、およびフローサイトメトリーによる細胞外MHCI発現の定量化を行う方法も記載されている。IFNβによる刺激は、他の実験条件をテストするのに有用な陽性対照であるが、IFNγおよびカイエン酸はまた、ニューロン^9、30においてMHCI発現を刺激し得る一方で、テトロドトキシンはMHCI発現¹⁴を減少させることにも留意することができる。MHCI発現を検出するための以前の方法は、その場合のハイブリダイゼーションおよび免疫ヒストリシス分析^{14、15、20、31}に依存していた。mRNAベースのアッセイは、その場合のハイブリダイゼーションやqRT-PCRなど、時空間的局在、細胞型特異性、遺伝子転写レベルを決定できますが、これらのアッセイではタンパク質翻訳や原形質膜への輸送を評価することはできません。免疫組織化学およびウェスタンブロット分析は、タンパク質発現の違いおよび潜在的に細胞の局在化を決定できますが、正確に定量することは困難です。さらに、多くのMHCI抗体は複合体の三次構造を認識し、立体構造変化に対して非常に敏感である。このようにパーメアビライゼーションまたは変性状態は、MHCI免疫反応性³²の損失をもたらす。ここで示す方法は、MHCIのsitu免疫染色で使用され、抗体を天然の立体構造で認識させ、続いて固定およびパーメアビライゼーション法を使用します。

わずかな変更を用いて、ここで説明する方法は、他の神経集団を培養したり、関心のある他の細胞外タンパク質の発現を評価するために使用することができる。このプロトコルで注目される、皮質ニューロンを培養するために行うことができる簡単な変更であるが、ここで説明する方法はまた、線条体ニューロン³³のような他の神経集団を培養するために使用されてもよい。さらに、このプロトコルはMHCIおよびNeuNの免疫染色を規定しているが、他の細胞マーカーも同様の方法で同定することができる。一般に、細胞外マーカーはMHCIおよび細胞内マーカーのように扱うことができるが、NeuNのように扱うことができる。しかし、細胞解離工程中に、軸索突起はソーマから切断される。ここで定義された格子戦略は、細胞の破片を選別し、神経核マーカーNeuNに焦点を当てているため、軸索突起で排他的に発現されるタンパク質は検出されない可能性があります。

最近まで、ニューロンは、細胞傷害性^CD8+T 細胞⁹に従事するために損傷、感染、またはインビトロサイトカイン刺激に応答するだけでMHCIを発現すると考えられていた。新しい研究は、開発中にシナプス接続を調節する際にMHCIの別の機能を解明しました¹³.ここで説明するプロトコルは、野生型培養ニューロンにおけるMHCI発現を刺激するためにIFNβを使用するが、同様の方法は、特定の仮説をテストするために様々な細胞刺激または遺伝子修飾と共に使用され得る。この方法により、研究者はMHCI発現を調節する分子メカニズムを研究し、これら2つの異なる細胞機能におけるMHCIの二分の役割の理解を深める。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	フィッシャー	05-408-129	ラボ用品
100 mm 滅菌培養皿	フィッシャー	FB012924	組織培養用品
15 ml 遠心チューブ	ジェネシー	21-103	ラボ用品
50 ml 遠心チューブ	ジェネシー	21-108	ラボ用品
500 mM EDTA	Invitrogen	AM9260G	FACS緩衝液試薬
70%エタ	ノールフィ	ッシャーBP82031Gal	培養用品96
ウェルU底プレート	ジェネゼー25-221		フローサイトメトリー用品
B27	ブコ	17504044	ニューロン培養試薬
ホウ酸バッファー	サーモサイエンティフィック	28341	組織培養用品ホ
ウケイ酸ガラスパスツールピペット	フィッシャー	13 678 20C	実験用品
細胞解離バッファー	Gibco	13 151 014	フローサイトメトリー用品
DNase I	Thermo	90083	解離溶液試薬
dPBS	Gibco	14190-235	組織培養用品
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	91150-20	解剖ツール
デュモン#7鉗子	ファインサイエンスツール	91197-00	解剖ツール
胎児ウシ血清	Gibco 26140079		組織培養用品
ファインフォーセプス	ファインサイエンスツール	91113-10	剖ツール
ファインハサミ	ファインサイエンスツール	91460-11	剖ツール
固定およびパーマ細胞透過化キット	Invitrogen	GAS003	フローサイトメトリー 供給
Glutamax	Gibco	35050061	ニューロン培養試薬
Hibernate-E 培地	Gibco	A1247601	ニューロン培養試薬
インスタントシーリング 滅菌ポーチ	Fisher	181254	組織培養用品
インターフェロン ベータ	PBL アッセイ 科学	12405-1	フローサイトメトリー用品
Milli-Mark Anti-NeuN-PE 抗体、クローン A60	MilliporeSigma	FCMAB317PE	Flow Cytometry 抗体
Neurobasal Media	Gibco	21103049	Neuron Culture Reagent
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody	BioLegend	116513	Flow Cytometry Antibody
Papain Solution	Worthington		LS003126 Dissociation Solution Reagent
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	15714	固定剤
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140122	ニューロン培養試薬
ポリ-D-リジン	シグマ	P7280	ニューロン培養試薬
標準パターン鉗子	ファインサイエンスツール	91100-12	解剖ツール
立体解剖顕微鏡	スウィフト	M29TZ-SM99CL-BTW1	解剖ツール
手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	91401-10	解剖ツール
トランスファー ピペット	コーニング	357575	ラボ用品
TruStain FcX (抗マウス CD16/32) 抗体	BioLegend	101319	フローサイトメトリー 抗体
トリパンブルー	シグマ	T8154-100ML	組織培養用品