MCF7細胞単層における細胞基質接着面積と細胞形状分布の定量化

Summary

本稿では、1)焦点接着のサイズと数および2)細胞形状指標およびMCF7細胞のコンラエント単層の共焦点画像からの分布の定量化について説明する。

Abstract

ここで提示される方法は、複数の適切に染色された共焦点画像からコンフルエント付着細胞単層のいくつかのパラメータを定量化する:焦点接着の数と大きさの関数としての基質への接着、および細胞形状、細胞形状指数および他の形状記述子によって特徴付けられる。パクシリン染色によって焦点付着を可視化し、細胞-細胞の境界を接合プラコグロビンとアクチンによって特徴づけた。細胞培養と染色の方法は標準的であった。画像は単一の焦点面を表します。画像解析は、一般に公開されている画像処理ソフトウェアを使用して行った。提示されたプロトコルは、単層の焦点接着の数と大きさおよび細胞形状分布の違いを定量化するために使用されるが、染色することができる他の細胞構造(例えば、ミトコンドリアまたは核)のサイズおよび形状の定量化のために再利用することができる。これらのパラメータを評価することは、細胞の形状に影響を与える細胞接着およびアトミオシン収縮性を含む、接着細胞層における動的力の特性評価において重要である。

Introduction

上皮細胞単層は、細胞細胞および細胞基質接着ならびに収縮力および緊張が重要なパラメータを表^,し、それらの適切なバランスがユニット^1、2、32の全体的な完全性に寄与する集団として作用する¹。³したがって、これらのパラメータを評価することは、セル層の現在の状態を確立する方法を表す。

ここで説明する2つの方法は、接着性、上皮細胞(この場合はMCF7乳癌細胞株)のコンフルエント単層の2次元分析を表す。解析は、Z 軸上の異なる領域の共焦点画像 (単一の Z スライス) を使用して実行されます。基底領域は、細胞形状測定のための焦点接着(FA)測定のための基質および尖体領域の近く。提示された方法は比較的簡単で、標準的な実験室の技術とオープンソースソフトウェアを必要とします。このプロトコルでは共焦点顕微鏡で十分であるため、より専門的なTIRF(全内部反射蛍光)顕微鏡を採用することなく実行できます。したがって、プロトコルは比較的標準的な実験室の設定で実装することができる。方法の精度は限られているが、焦点接着と細胞形状の基本的な違いを区別することができる。

ここで説明する両方の方法は、ImageJを使用して行われる細胞培養、免疫染色、共焦点イメージング、画像解析などの標準的な実験手順で構成されています。ただし、適切な機能を持つ任意の画像処理ソフトウェアを使用することができます。提示された方法は、薬理学的治療または最小限の遺伝子組み換えによって引き起こされた変化を追跡し、比較することができます。これらのメソッドの精度が限られているため、明確な値を取得することはお勧めしません。2つの自動化されたマクロが含まれ、多くの画像の測定を容易にしました。

Protocol

1. 準備手順

1. コンフルエント単層を得るための細胞播種
   1. 播種する前に、4ウェルのチャンバースライドのウェルにコラーゲンI(または選択した他のECM成分)をコーティングします。コラーゲンIコーティングの場合は、市販のプロトコルに従ってください:https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html濃度8 μg/cm².
   2. 4ウェルチャンバースライドの1ウェルに400,000細胞をシードします。
   3. 染色前に24時間(またはより長い、実験エンドポイントに依存して)細胞を培養し、37°Cでインキュベーターで、5%CO2₂を培養する。このステップは細胞細胞接触の成熟および単層の形成を可能にする。
   4. 光学式の逆顕微鏡を使用して、合流性(約90%が必要)と単層の一般的な状態を確認します。セルが浮いているか、ストレスを感じている場合は、先に進まないでください。
2. 免疫蛍光染色
   注: セルは、選択したプロトコルで染色できます。ここで、免疫蛍光は、前述の⁴のように行った。
   1. 焦点接着解析のために、選択したフォーカル接着タンパク質(このプロトコルパキシリン)で細胞を染色する。細胞形状解析用染色は、選択した細胞細胞接合タンパク質(このプロトコルではデスモソームタンパク質プラコグロビン)である。
   2. この手順では、特に指定がない限り、指定されたソリューションの 0.5 mL を使用します。
   3. 氷上で30分間PBSで4%ホルムアルデヒド中の細胞を固定します。
   4. 0.1 M塩化アンモニウム(PBS)で10分間インキュベートし、自動蛍光をクエンチします。
   5. 0.5%トリトンX-100(PBS)を30分間追加します(透過化)。
   6. TBS-Tに5%の牛乳(または1%BSA)を1時間ブロックします。
   7. 一次抗体を一晩4°Cでインキュベート(抗パキシリン:ウサギ、1:250、抗プラコグロビン:ウサギ、1:400)
   8. 2次抗体を30分間インキュベートする(アレクサFluor 594ヤギ抗ウサギ、1:500、1:500)
   9. 光から保護された1〜5分間の300 nM DAPIで染色。
      注:任意で、蛍光ファロイジンコンジュゲート(conc. 1:400)を使用したアクチンの追加染色が行われることがあります。ファロイジンは、二次抗体と同じステップで添加する必要があります。
3. 共焦点イメージング
   1. 共焦点顕微鏡(例えば、ツァイスLSM800)を使用して、単一のZスライスの画像を撮ります。
      注: オプションのアクチン染色は、適切な焦点面を評価するのに役立ちます。皮質アクチン染色は、アクチンストレス繊維が基底領域に存在する間、図1に示すように基質の近くに存在する間、アピカル領域に存在する。
   2. 焦点接着画像
      1. 基底領域から基底領域から焦点接着解析のためのZスライスを選択し、基板に近い。
      2. 使用可能な最も高い数値開口を持つ目的を使用します(63x N.A.:1.4が好ましい)。
         注:FAの形状は非常に具体的で、簡単に認識できます。したがって、細胞の下の焦点面からスキャンを開始し、その後、FAがはっきりと見えるまでゆっくりとそれらに向かってスキャンすることをお勧めします。画像解析は、より一様に傾向のある視野の小さい方からより正確になりますが、これは単一の視野で計算されるセルが少なくなることを意味します。
   3. 細胞-細胞接触イメージング
      1. 40xまたは63xの目的を使用します。
      2. 核染色および好ましい接合タンパク質染色のためのチャネルを選択します。
      3. 単一レイヤーのアペカル領域からセル形状解析の Z スライスを選択します。
      4. 少なくとも3つの異なる視野(200〜400細胞)のために写真を撮ります。

2. 画像解析

注: 提供されたマクロは、ImageJ バージョン 1.50f 以降で最適に動作します。信号対雑音比が高く、ピクセルが過小または過飽和の画像のみを定量化するために使用します。説明する方法には、手動でパラメータ調整を必要とするステップが含まれます。したがって、ブラインド分析/ブラインド実験のセットアップをお勧めします。画像ファイル名の暗号化には、「ブラインド分析ツール」(https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools)などのImageJプラグインを使用できます。

1. 焦点接着解析
   注: 次の方法で推奨される入力ファイルは、8 ビットのグレースケールで表される FA のイメージを .tiff 形式で保存します。
   1. イメージを使用して画像を開きます。
   2. イメージのスケールをピクセルに設定する (分析 |スケールを設定します。スケールを削除し、グローバルオプションをチェックします)。
   3. 測定オプションにファイル名と ROI 領域を含める (分析 |測定を設定します。[エリア]および[ラベルの表示]オプションをオンにします。
   4. 背景を減算する (プロセス |背景を減算します。ローリングボール半径パラメータを50ピクセルに設定します。[スライディング放物線] オプションをオンにします。擬似色のRGB画像の場合:RGBチャンネルを分割し、開いたFAを持つチャンネルを残し、残りのチャンネルを閉じる (画像 |色 |チャンネルの分割
   5. 関心領域 (ROI) の最小領域を決定します。フリーハンドまたはポリゴン選択を使用すると、最小の単一焦点接着の輪郭を描き、その領域を測定します (分析 |測定します。ランダムに選択された画像 (合計 20 の ROI) から、異なる ROI (FA) に対してこの手順を繰り返します。取得した結果の平均を計算して保存します。
      注:このステップは、特定の画像のセットが初めて分析される場合にのみ必要です(特定の細胞株、特定の細胞外マトリックス成分を持つコーティングスライド、異なる培養条件)。
   6. 次のいずれかの方法を使用して、イメージをバイナリに変換します。
      1. グローバルしきい値を設定する (イメージ |調整 |しきい値。[デフォルト]、[B&W]、[暗い背景]の各オプションをオンにし、手動でしきい値を調整するか、自動的に設定します)。
      2. ローカルしきい値を設定する (イメージ |調整 |自動ローカルしきい値.;ファンサルカルにメソッドを設定し、黒の背景オプションに白いオブジェクトをチェックします。次に、画像を反転します (編集 |反転)。
   7. ROI の数と面積を測定します。分析を選択 |パーティクルの分析[ピクセル単位]、[結果の表示]、[結果のクリア]、[集計オプション] をオンにし、下限として[サイズ] パラメータを設定すると、ステップ 2.1.5 の最小の ROI の平均値を使用します。上限は、一般的なセル領域の 25% に設定できます。
   8. [概要] ウィンドウから選択したデータ管理プログラムにデータを転送します (画像名、FAの数、FA の合計領域と平均面積、それぞれスライス、カウント、合計面積、平均サイズ)。
   9. DAPI染色された核を数えることによって、画像当たりの細胞数を決定する。カウントは手動で行うことができます (プラグイン |分析 |セル カウンタ) または使用可能なプロトコルの場合と同様に、 https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation。
   10. また、FA カウントを容易にするために、添付された ImageJ マクロ (FAs.ijm) を使用します。
       1. マクロと共に .ijm ファイルを ImageJ ソースファイルフォルダにあるプラグインまたはマクロフォルダに移動します。
       2. ステップ 2.1.4 で説明した最小の ROI の領域を決定します。
       3. マクロファイルを開く (プラグイン |マクロ |編集します。
       4. マクロを実行する前に、3 つの変数の値を設定します: area_of_the_smallest_region_of_interestの値をステップ 2.1.4 で取得した数値で設定します。threshold_type値を手動または自動に設定します。
       5. 変更を保存します (マクロは使用可能です)。
       6. ImageJ パネルからマクロを呼び出すか、マクロへのショートカットを作成します。マクロは、標準の開いているダイアログ ウィンドウで始まります。処理するイメージを選択します。
          注: 手動でしきい値を調整する場合は、しきい値の手動確認が必要になります([しきい値] ダイアログ ウィンドウの[適用] ボタンを使用して変更を受け付けないようにする場合は、代わりに[アクションが必要]カスタム ダイアログ ウィンドウを使用します)。マクロを操作して得られる結果は、ステップ 2.1.8 ([概要]ダイアログ ウィンドウに含まれる) で説明したものと同じです。さらに、手動しきい値調整の場合は、ログダイアログウィンドウに下限レベルが表示され、この値により、必要に応じて、取得した結果を将来に再現できます。補足的な数値 S1およびS2は、FAs.ijm マクロのトレーニング データセットとして含まれていました。
2. 細胞形状解析
   1. 手動
      1. 類似した機能セットを使用して ImageJ または別の画像処理ソフトウェアでイメージを開きます (ImageJ に関連する詳しい手順)。メニューから選択して測定するパラメータを選択する|表示ボックスで[計測]と[形状の記述子]を設定します。
      2. フリーハンド選択アイコンを使用して、選択した接合タンパク質によってマークされたセル境界を手動で表します。選択したパラメータは、セルごとに自動的に計算されます。[編集] をクリックして各セルのアウトラインを作成した後に結果を保存する |選択 |マネージャに追加します。完全な、完全に表示されるセルのみ、途切れない境界線を持つセルをカウントする必要があります。
      3. ビューのフィールド内のすべてのセルの輪郭が表示されたら、ROI マネージャの左側のボックスに表示されるすべての数値 (セルに対応) をマークし、[結果]ボックスに [結果] をクリックして、選択したスプレッドシートに転送します。
   2. 自動
      注: セルシェイプ記述子 (CSI、アスペクト比、丸み、固さを含む) の定量化を容易にするために、ImageJ マクロが準備され、この記事 (CSI.ijm) に添付されています。マクロは、主に、MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵と呼ばれる ImageJ プラグインに基づいています。マクロは次の手順を実行します: 1) 10 黒のピクセルによる画像の各境界の拡張 [MorpholibJ];2)膨張と侵食のラウンド - 形態学的フィルタ[MorpholibJ]。3)形態学的セグメンテーションによる細胞境界のバイナリ画像の生成[MorpholibJ];4)細胞境界の拡張;5) ピクセル値の反転;6)画像上の細胞の面積と周囲の選択と測定の生成;7) 輪郭を描いたセルと ImageJ ROI の選択を含むイメージを新しいファイルに保存します。
      1. マクロを含む .ijm ファイルを、ImageJ ソース ファイル フォルダにあるプラグインまたはマクロ フォルダに移動します。ImageJ パネルからマクロを呼び出すか、マクロへのショートカットを作成します。
      2. 新しいデータセットを定量化する前に、対象となる最小領域と最大領域の値を決定します。画像上の最小セルと最大セルのアウトライン(フリーハンドまたはポリゴン選択)の例を少し (3 -10) し、その領域を測定します (分析 |測定します。
      3. または、デフォルト設定でマクロを実行し (下限が 0 に設定され、上限が無限大に設定されている)、マクロが終了するのを待ち、セル サイズ境界の設定オプションを選択します。ラベルをクリックし、ImageJ ROI マネージャで[メジャー]を押して、最小セルと最大セルの面積を測定します。the_smallest_cellとthe_biggest_cell変数の値を設定します。変更を保存し、すべてのマクロ ダイアログ ウィンドウを閉じてから、マクロを再度実行します。
         注: このマクロは ROI サイズの境界を設定せずに使用できますが、不適切なセルフラグメントやセル クラスタを測定する可能性が大幅に高くなるため、このマクロは推奨されません。
      4. 標準の開くダイアログ ウィンドウでマクロを起動します。処理するイメージを選択します (グレースケール)。
      5. 結果を分析します。マクロによって提供される出力は、結果の表(セルラベル、画像ラベル、セル領域[ピクセル^2]、セルの周囲[ピクセル^2]、円形[CSI]、縦横比、丸み、固さ)、輪郭を描かれたセルとROI選択リスト(結果サブフォルダの新しいファイルにも保存されます)で構成されます。結果テーブルは、ユーザーのクリップボードに自動的にコピーされます。
         注:補足的な数値 S3およびS4は、CSI.ijm マクロのトレーニング データセットとして含まれていました。

3. 定量化

1. FAの定量化
   1. 細胞/核あたりの平均 FA 数と平均 FA サイズを計算します。
      注: 一部のセルラインでは、個別のセルに別々に FA をカウントできます。MCF7のような単層として増殖する細胞株の場合、画像全体の核数で数えて、各細胞のFAの数とサイズを計算することができます。
   2. 集団間の潜在的な差の統計的有意性を評価する(実験群)。データの分布と分散に応じて、2つの異なるグループの比較には、スチューデント t 検定 (正規分布) または非パラメトリック U 検定 (マン-ホイットニー) を使用します。複数のグループの比較には、一方向の ANOVA または Kruskal-Wallis を適切なポストホック テストと組み合わせて使用します。
2. 細胞形状解析
   1. 形状記述子の計算
      1. 手動分析: 次の数式を使用して、適切な面積と周長から各測定セルに適したスプレッドシートで、セル形状インデックス (CSI、円形またはセル形状とも呼ばれます) を計算します。
         
         注: CSI は、1 (円形) ~ 0 (細長い) の値を想定しています。さまざまなセル形状 (同じ領域) とそれぞれの CSI の例を図 2に示します。自動解析では、(以下に登録されて定義される)形状記述子の値が自動的に計算され、結果ボックスに表示されます。
         (1) CSI = 4π*エリア/(周囲)²
         (2) AR = 長軸/短軸
         (3) 丸み = 4*エリア/π*(長軸)²
         (4) 固さ =面積/凸面積
   2. 細胞形状分布のヒストグラム
      1. セル形状分布を、円形状のヒストグラム(CSI)としてプロットします。CSI 値 (最小 200 ~ 400 個のセルに対して計算) に従ってセルを分類し、10 個の均一な間隔 (範囲: 0 ~ 1、ビン幅: 0.1) のいずれかに分類します。ヒストグラムには、各カテゴリのセル数が表示されます。
         注: 一般的な MCF7 細胞層の形状分布を示すヒストグラムは、CSI のピークが 0.7~0.8 程度です。細胞の形状が何らかの要因によって歪んでいる場合(例えば、パクリタキセル処理、G2/M位相停止を引き起こし、その結果、より多くの細胞が丸くなる)、ヒストグラムに反映されるべきである。
   3. 累積分布プロット
      1. 各セルの形状変化 (または分布のその他の変化) の統計的に重要な違いを評価する最良の方法であるため、各セルラインの累積 CSI 分布を比較します。たとえば、このアプリケーションを適用して、変更する FA の分布を追跡できます。
      2. 分布を比較するために累積分布関数 (CDF) を計算します。CDF は、指定された CSI 値 (X 軸にプロット) に対して、すべての値がこの CSI 値以下である (Y 軸にプロット) パーセント (相対カウント) を割り当てます。したがって、CSI 値が高くなるほど、この値以下の値セットの割合も高くなります。CDFは、選択した統計ソフトウェアによって計算することも、手動で計算することもできます。
      3. 統計解析には、コルゴモロフ-スミルノフノンパラメトリック検定を使用します。

Results

焦点接着解析
HAX1遺伝子のノックダウンは、以前に焦点接着に影響を与えることを示^した6.細胞を48時間のコラーゲンIコーティング表面上で培養した。焦点接着性タンパク質パキシリンで染色した3つの独立実験からHAX1ノックダウン(HAX1 KD)を有するMCF7対照細胞とMCF7細胞の画像を、共焦点顕微鏡を用いて得た(基底領域からの単焦点面/Zスライスからの画像)。各細胞株から約2,000〜2,500個の細胞からのFAを、記載されたプロトコルを用いて定量した。最小焦点接着の平均値は 50 (ピクセル²⁾に設定しました。ImageJと共に数えるFAの代表的な画像は、最終的な、番号付きのアウトラインや元の画像を持つFAの輪郭のオーバーレイを含め、図3Aの両方の細胞線に対して示されている。図3Bに、両方のセルラインにおける FA の数とサイ...

Discussion

細胞細胞および細胞基質接着は、上皮細胞の固有の属性を構成し、組織形態形成および遺伝子形成において重要な役割を果たす。成人組織では、細胞層の機械的特性の適切な調節は、恒常性を維持し、腫瘍の進行および転移のような病理学的応答を予防する上で極めて重要である。焦点接着の大きさと数は細胞-基体接着の強さに依存し、細胞形状は収縮力に依存し、細胞-細胞接触の状態に関連する。

ここでは、この領域の定量的分析の2つの簡単な方法について、免疫蛍光によって染色された細胞構造の数および形状、この場合の細胞層における細胞全体の焦点接着とを説明する。ただし、提案されたツールは、選択した構造の定量化のために再利用することができます。これらの分析の重要な問題は、免疫蛍光染色と共焦点イメージングの品質です。これらの方法は、細胞培養ユニットと共焦点顕微鏡を備えた標準的な実験室で実施することができる。それらは、測定されたパラメータの差(自然または特定の治療によって誘発される)が相当である場合に特に、細胞株を比較するように設計されています。特に焦点付着の場合は、初期の任意の設定の最小限の変化に敏感であるため、微小な違いを...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	ヤギ抗ウサギ、1:500
塩化アンモニウム	Σ	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
子牛の皮からのコラーゲン	Sigma	C9791-10MG
DAPI	ΣD9542		1:10000 (H2O)、核酸に1mg/mLをストック染色
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		Standard equipment
MCF7-basedHAX1KD細胞株	バルセラックらに記載されている、ワルシャワの国立腫瘍学研究所で確立された細胞株、2019		MCF7細胞株、HAX1ノックダウン
MCF7細胞株(CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	上皮、接着性乳がん細胞株
リンパスCK2光学顕微鏡	リンパス
パキシリン			ウサギ、1:250、Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (DMSO に 5 mg/mL をストック)、アクチン標識
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST –NaCl	Sigma	S9888
TBST –Trizmaベース	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 共焦点顕微鏡	Zeiss