Method Article

MCF7細胞単層における細胞基質接着面積と細胞形状分布の定量化

DOI:

10.3791/61461

⸱

June 24th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Maria Sklodowska-Curie National Research Institute of Oncology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、1)焦点接着のサイズと数および2)細胞形状指標およびMCF7細胞のコンラエント単層の共焦点画像からの分布の定量化について説明する。

Abstract

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ここで提示される方法は、複数の適切に染色された共焦点画像からコンフルエント付着細胞単層のいくつかのパラメータを定量化する:焦点接着の数と大きさの関数としての基質への接着、および細胞形状、細胞形状指数および他の形状記述子によって特徴付けられる。パクシリン染色によって焦点付着を可視化し、細胞-細胞の境界を接合プラコグロビンとアクチンによって特徴づけた。細胞培養と染色の方法は標準的であった。画像は単一の焦点面を表します。画像解析は、一般に公開されている画像処理ソフトウェアを使用して行った。提示されたプロトコルは、単層の焦点接着の数と大きさおよび細胞形状分布の違いを定量化するために使用されるが、染色することができる他の細胞構造(例えば、ミトコンドリアまたは核)のサイズおよび形状の定量化のために再利用することができる。これらのパラメータを評価することは、細胞の形状に影響を与える細胞接着およびアトミオシン収縮性を含む、接着細胞層における動的力の特性評価において重要である。

Introduction

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上皮細胞単層は、細胞細胞および細胞基質接着ならびに収縮力および緊張が重要なパラメータを表,し、それらの適切なバランスがユニット1、2、32の全体的な完全性に寄与する集団として作用する1。3したがって、これらのパラメータを評価することは、セル層の現在の状態を確立する方法を表す。

ここで説明する2つの方法は、接着性、上皮細胞(この場合はMCF7乳癌細胞株)のコンフルエント単層の2次元分析を表す。解析は、Z 軸上の異なる領域の共焦点画像 (単一の Z スライス) を使用して実行されます。基底領域は、細胞形状測定のための焦点接着(FA)測定のための基質および尖体領域の近く。提示された方法は比較的簡単で、標準的な実験室の技術とオープンソースソフトウェアを必要とします。このプロトコルでは共焦点顕微鏡で十分であるため、より専門的なTIRF(全内部反射蛍光)顕微鏡を採用することなく実行できます。したがって、プロトコルは比較的標準的な実験室の設定で実装することができる。方法の精度は限られているが、焦点接着と細胞形状の基本的な違いを区別することができる。

ここで説明する両方の方法は、ImageJを使用して行われる細胞培養、免疫染色、共焦点イメージング、画像....

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Protocol

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1. 準備手順

  1. コンフルエント単層を得るための細胞播種
    1. 播種する前に、4ウェルのチャンバースライドのウェルにコラーゲンI(または選択した他のECM成分)をコーティングします。コラーゲンIコーティングの場合は、市販のプロトコルに従ってください:https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html濃度8 μg/cm2.
    2. 4ウェルチャンバースライドの1ウェルに400,000細胞をシードします。
    3. 染色前に24時間(またはより長い、実験エンドポイントに依存して)細胞を培養し、37°Cでインキュベーターで、5%CO22を培養する。このステップは細胞細胞接触の成熟および単層の形成を可能にする。
    4. 光学式の逆顕微鏡を使用して、合流性(約90%が必要)と単層の一般的な状態を確認します。セルが浮いているか、ストレスを感じている場合は、先に進まないでください。
  2. 免疫蛍光染色
    注: セルは、選択したプロトコルで染色できます。ここで、免疫蛍光は、前述の4のように行った。
    1. 焦点接着解析のために、選択したフォーカル接着タンパク質(このプロトコルパキシリン)で細胞を....

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Results

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焦点接着解析
HAX1遺伝子のノックダウンは、以前に焦点接着に影響を与えることを示した6.細胞を48時間のコラーゲンIコーティング表面上で培養した。焦点接着性タンパク質パキシリンで染色した3つの独立実験からHAX1ノックダウン(HAX1 KD)を有するMCF7対照細胞とMCF7細胞の画像を、共焦点顕微鏡を用いて得た(基底領域からの単焦点面/Zスライスからの画像)。各細胞株から約2,000〜2,500個の細胞からのFAを、記載されたプロトコルを用いて定量した。最小焦点接着の平均値は 50 (ピクセル2)に設定しました。ImageJと共に数えるFAの代表的な画像は、最終的な、番号付きのアウトラインや元の画像を持つFAの輪郭のオーバーレイを含め、図3Aの両方の細胞線に対して示されている。図3Bに、両方のセルラインにおける FA の数とサイ.......

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Discussion

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細胞細胞および細胞基質接着は、上皮細胞の固有の属性を構成し、組織形態形成および遺伝子形成において重要な役割を果たす。成人組織では、細胞層の機械的特性の適切な調節は、恒常性を維持し、腫瘍の進行および転移のような病理学的応答を予防する上で極めて重要である。焦点接着の大きさと数は細胞-基体接着の強さに依存し、細胞形状は収縮力に依存し、細胞-細胞接触の状態に関連する。

ここでは、この領域の定量的分析の2つの簡単な方法について、免疫蛍光によって染色された細胞構造の数および形状、この場合の細胞層における細胞全体の焦点接着とを説明する。ただし、提案されたツールは、選択した構造の定量化のために再利用することができます。これらの分析の重要な問題は、免疫蛍光染色と共焦点イメージングの品質です。これらの方法は、細胞培養ユニットと共焦点顕微鏡を備えた標準的な実験室で実施することができる。それらは、測定されたパラメータの差(自然または特定の治療によって誘発される)が相当である場合に特に、細胞株を比較するように設計されています。特に焦点付着の場合は、初期の任意の設定の最小限の変化に敏感であるため、微小な違いを.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この研究は、ポーランド国立科学センターによって助成金第2014/14/M/NZ1/00437の下で支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA32740ヤギ抗ウサギ、1:500
塩化アンモニウムΣA9434
BSABioShopALB001.500
子牛の皮からのコラーゲンSigmaC9791-10MG
DAPIΣD95421:10000 (H2O)、核酸に1mg/mLをストック染色
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, PyruvateThermoFisher Scientific21885-025
FBSThermoFisher Scientific10270-136
Junction plakoglobinCell Signaling2309Srabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2AlpinaStandard equipment
MCF7-basedHAX1KD細胞株バルセラックらに記載されている、ワルシャワの国立腫瘍学研究所で確立された細胞株、2019MCF7細胞株、HAX1ノックダウン
MCF7細胞株(CONTROL)ATCCATCC HTB-22上皮、接着性乳がん細胞株
リンパスCK2光学顕微鏡リンパス
パキシリンウサギ、1:250、Y113
PBSThermoFisher Scientific10010023
Phalloidin-TRITC conjugateSigmaP19511:400 (DMSO に 5 mg/mL をストック)、アクチン標識
PTXSigmaT7402-1MG
TBST –NaClSigmaS9888
TBST –TrizmaベースSigmaT1503
Triton X-100Sigma9002-93-11
Zeiss LSM800 共焦点顕微鏡Zeiss
オオAbcamab32084

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006(2016).
  2. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122

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